Zapis elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u szczura

Streszczenie

Źródło: Charng, J. et al. Implantacja i rejestracja bezprzewodowego elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u świadomych szczurów. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film pokazuje, jak rejestrować elektroretinogram (ERG) i wizualny potencjał wywołany (VEP) u przytomnego szczura. Szczur, z chirurgicznie wszczepionymi elektrodami, jest najpierw przystosowany do ciemności. Po zastosowaniu kropli rozszerzających zwierzę umieszcza się w unieruchomieniu i umieszcza w misce Ganzfelda. Następnie rejestrowane są sygnały ERG i VEP.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie elektrod

Uwaga: Trzykanałowy nadajnik jest używany do chirurgicznej implantacji, co umożliwia jednoczesne przeprowadzenie 2 elektroretinogramów (ERG) i 1 wizualnego potencjału wywołanego (VEP). Trzy aktywne i trzy nieaktywne elektrody muszą być wstępnie uformowane w kształt pierścienia przed implantacją, aby można je było przymocować do oka. W celach identyfikacyjnych producent umieścił elektrody aktywne w półbiałych, półkolorowych osłonach z tworzywa sztucznego, podczas gdy elektrody nieaktywne są pokryte w pełnokolorowych osłonach. Elektroda uziemiająca (przezroczysta osłona z tworzywa sztucznego) pozostaje niezmieniona, aby wszystkie aktywne i nieaktywne elektrody wykonywały kroki 1.1, 1.2, 1.3 i 1.7.

1. Odkręć dwużyłową elektrodę ze stali nierdzewnej za pomocą dwóch szczypiec z cienką końcówką.
2. Przytnij jedno z pasm ze stali nierdzewnej (około 1 cm od końcówki), pozostawiając jedno dłuższe proste pasmo do ukształtowania elektrody pierścieniowej.
3. Złóż pojedynczą żyłę ze stali nierdzewnej z powrotem na siebie i przekręć, tworząc gładki pierścień na końcu elektrody.
4. Dla elektrod aktywnych ERG uformuj tę pętlę o średnicy ~ 0,2 - 0,5 mm poprzez skręcenie podstawy pętli (w opisanym tutaj celu uformuj dwie aktywne elektrody w ten sposób, aby rejestrować ERG z obu oczu), a dla elektrod nieaktywnych ERG i VEP wykonaj średnicę pętli ~ 0,8 mm średnicy (w tym przykładzie, zrobić to dla jednej aktywnej elektrody VEP i wszystkich trzech elektrod nieaktywnych).
5. Zaczepić okrągłą elektrodę aktywną VEP wokół ze stali nierdzewnej (średnica 0.7 mm, długość 3 mm) tak, aby elektroda opierała się o.
6. Zaczepić 3 nieaktywne elektrody (2 ERG, 1 VEP) wokół drugiej ze stali nierdzewnej (średnica 0,7 mm, długość 3 mm).
7. Przeciągnij plastikową tuleję do przodu po ostrych końcach dwóch pasm ze stali nierdzewnej, aby zmniejszyć podrażnienia.
8. Wysterylizuj nadajniki telemetryczne, mocząc je w 2% aldehydzie glutarowym przez ponad 10 godzin w temperaturze około 25 °C. Następnie trzykrotnie przepłucz nadajnik sterylnym roztworem soli fizjologicznej.

2. Implantacja nadajnika

1. Przygotowanie zwierząt
   1. Zdezynfekuj obszar chirurgiczny przed eksperymentami, czyszcząc go 70% etanolem. Autoklawuj cały sprzęt chirurgiczny przed użyciem i utrzymuj sprzęt w chlorheksydynie, gdy nie jest używany podczas operacji. Przykryj zwierzę serwetą chirurgiczną podczas operacji, aby utrzymać sterylne środowisko. Upewnij się, że wszyscy eksperymentatorzy noszą maski chirurgiczne, sterylne rękawiczki i fartuchy.
   2. Znieczulenie należy wywołać 1,5 - 2% izofluranem o natężeniu przepływu 3 l/min i utrzymywać na poziomie 1,5 - 2% przy 2 l/min przez cały czas trwania zabiegu. Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca przy braku odruchu pedałowania po uszczypnięciu mięśnia między palcami.
   3. Ogolić obszar brzucha o wymiarach 40 mm x 30 mm od góry pachwiny do mostka.
   4. Ogolić obszar o wymiarach 30 mm x 20 mm nad czołem, za oczami i przed uszami.
   5. Zdezynfekuj dwa ogolone obszary. W okolicy czoła należy trzykrotnie zdezynfekować 10% jodonem powidonu (należy unikać stosowania środków antyseptycznych na bazie alkoholu w okolicy oka, zgodnie ze standardem postępowania określonym przez Stowarzyszenie Techników Chirurgicznych). Na brzuchu zdezynfekuj 10% jodu powidonu i 70% etanolu.
   6. Nałóż 1 kroplę proksymetakainy na rogówkę w celu dodatkowego znieczulenia miejscowego.
   7. Nałóż 1 kroplę karboksymetylocelulozy sodowej na rogówkę, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
2. Implantacja chirurgiczna
   1. Wykonaj 10-milimetrowe nacięcie na głowie wzdłuż pionowej linii środkowej między uszami za pomocą skalpela chirurgicznego.
   2. Wykonaj 5 mm nacięcie na brzuchu przez warstwę skóry wzdłuż linii środkowej poniżej mostka.
   3. Tunel kaniuli o średnicy 5 mm podskórnie od nacięcia brzucha do nacięcia głowy.
   4. Przeprowadź przewody elektrod (3 aktywne i 3 nieaktywne) nadajnika przez kaniulę od brzucha do głowy.
   5. Pozostaw elektrodę odniesienia z podstawą nadajnika i przykryj końcówkę elektrody aseptyczną gazą.
   6. Przykryj końcówki elektrod (3 aktywne i 3 nieaktywne) aseptyczną gazą.
   7. Przymocuj głowę szczura do platformy stereotaktycznej.
   8. Przedłuż nacięcie czoła do 30 mm długości za pomocą nożyczek chirurgicznych.
   9. Odsłonić obszar operacyjny, cofając luźną skórę za pomocą 2 szwów (3 - 0) na godzinie ~ 3 i 9.
   10. Zeskrob okostną pokrywającą czaszkę za pomocą wysterylizowanej gazy, aby odsłonić szwy bregma, lambda i linia środkowa.
   11. Wywierć dwa otwory w czaszce we współrzędnych stereotaktycznych VEP aktywnych (7 mm brzusznych do bregma, 3 mm bocznych do linii środkowej) i nieaktywnych (5 mm rostralnych do bregma na linii środkowej).
   12. Przymocuj aktywne i nieaktywne elektrody VEP za pomocą wstępnie przymocowanych ze stali nierdzewnej (średnica 0,7 mm, długość 3 mm) do czaszki za pomocą małego śrubokręta na głębokość ~ 1 mm w wykonane wcześniej otwory. To zakotwicza w kości bez uszkadzania leżącej poniżej tkanki korowej.
   13. Aby wszczepić aktywne elektrody ERG, użyj szwu 8 - 0, aby tymczasowo cofnąć górną powiekę.
   14. Wprowadzić kaniulę o mocy od 16 do 21 G podskórnie od tyłu oka do sklepienia górnego spojówki.
   15. Wyjąć igłę prowadzącą.
   16. Przeprowadź aktywną elektrodę przez skrócony plastikowy cewnik od czoła w kierunku oka. Następnie wyjmij plastikowy cewnik.
   17. Użyj tymczasowego szwu (8 - 0), który jest przewleczony przez pętlę elektrody, aby zapobiec cofaniu się elektrody do tunelu.
   18. Wykonaj nacięcie 0,5 mm na spojówce górnej na godzinie 12, 1 mm za rąbkiem. Użyj sekcji, aby odsłonić leżącą pod spodem twardówkę.
   19. Wszczepić szew 8 - 0 lub 9 - 0 bezpośrednio za rąbkiem na połowie grubości twardówki.
   20. Usuń tymczasowy szew z aktywnej elektrody ERG.
   21. Zakotwicz aktywną elektrodę ERG do szwu o połowie grubości twardówki, wiążąc 3 kolejne węzły, upewniając się, że końcówka elektrody znajduje się blisko rąbka.
   22. Zamknij płat spojówki za pomocą 1 do 2 przerwanych szwów (8 - 0 do 9 - 0). Upewnij się, że spojówka całkowicie zakrywa elektrodę ERG, aby poprawić komfort.
   23. Zdejmij szew zwijający powiekę.
   24. Powtórz procedurę dla przeciwległego oka.
   25. Nałóż żel cyjanoakrylowy na czaszkę, aby zabezpieczyć wszystkie ze stali nierdzewnej i druty elektrodowe. Upewnij się, że aktywne elektrody ERG nie są zbyt mocno naciągnięte przed ich zamocowaniem, aby umożliwić ruchy gałek ocznych.
   26. Zamknij ranę głowy za pomocą niewchłanialnego szwu 3 - 0.
   27. Obróć gryzonia, aby odsłonić obszar brzucha. Wydłuż nacięcie skóry brzucha do 40 mm wzdłuż Linea alba za pomocą nożyczek chirurgicznych.
   28. Wykonaj 35-milimetrowe nacięcie przez wewnętrzną ścianę mięśnia, aby odsłonić wewnętrzną jamę brzuszną.
   29. Za pomocą dwóch szwów (3 - 0) korpus nadajnika jest przymocowany do wewnętrznej ściany brzucha zwierzęcia po prawej stronie. Unikaj kontaktu z wątrobą.
   30. Zapętlić elektrodę masową i zabezpieczyć ją w tym kształcie szwem (3 - 0). Następnie umieść go swobodnie unoszący się w jamie brzusznej.
   31. Zamknij otrzewną za pomocą ciągłego szwu (3 - 0).
   32. Zamknąć nacięcie skóry za pomocą przerywanych szwów (3 - 0).
3. Opieka pooperacyjna
   1. Monitorować zwierzę do momentu, gdy odzyska przytomność na tyle, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Trzymaj zwierzę pojedynczo po operacji.
   2. Karprofen należy podawać podskórnie w celu znieczulenia (5 mg/kg) raz na dobę przez 4 dni.
   3. Dodaj profilaktyczne doustne antybiotyki (enrofloksyna, 5 mg/kg) do wody pitnej przez 7 dni po zabiegu.
   4. Nałóż maść przeciwzapalną na miejsca nacięć skóry, aby zmniejszyć podrażnienie przez pierwsze 7 dni po zabiegu.

3. Przeprowadzanie nagrań ERG i VEP u świadomych szczurów

1. Ciemne zwierzę adaptuje się przez 12 godzin przed nagraniami ERG i VEP.
2. Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzać przy słabym czerwonym oświetleniu (17,4 cd.m-2, λmax = 600 nm)
3. Zastosuj znieczulenie miejscowe (0,5% proksymetakainy) i krople rozszerzające (0,5% tropikamidu) na rogówkę.
4. Poprowadź świadomego gryzonia do specjalnie przygotowanego, przezroczystego ogranicznika.
   nuta: Długość tej plastikowej rurki można regulować, aby dostosować ją do szczurów o różnych rozmiarach, przy całkowitej średnicy ustalonej na 60 mm. Przedni koniec urządzenia jest zwężany, aby zminimalizować ruchy głowy i zawiera perforacje umożliwiające normalne oddychanie. Ten zwężający się przód umożliwia wyrównanie i stabilizację głowy i oczu szczura do otworu kuli Ganzfelda. Należy pamiętać, że gryzoń został zaaklimatyzowany do unieruchomienia (3 do 5 razy) przed zabiegiem.
5. Umieść gryzonia przed miską Ganzfelda tak, aby oczy były wyrównane z otworem miski.
6. Włącz nadajnik na stałe, przesuwając magnes w odległości ~ 5 cm od niego. Następnie sprawdź, czy nadajnik jest włączony, sprawdzając diodę LED stanu na podstawie odbiornika.
7. Zbieraj sygnały w zakresie energii świetlnych (tj. -5,6 do 1,52 log cd.s.m²).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Biowzmacniacz	Instrumenty ADInstruments	Zobacz materiał ML 135	Wzmacnia sygnały ERG i VEP
Sól sodowa karboksymetylocelulozy 1,0%	Alergik	CAS 0009000-11-7	Utrzymuj nawilżenie rogówki podczas operacji
Karprofen 0,5%	Grupa ds. Zdrowia Zwierząt firmy Pfizer	CAS 53716-49-7	Analgezja pooperacyjna, podawana z solą fizjologiczną w celu uzupełnienia płynów
Chlorheksadyna 0,5%	Laboratoria Oriona	Numer telefonu 27411, numer 80085	Dezynfekcja narzędzia chirurgicznego
Aktywator żelu cyjanoakrylowego	Komponenty RS	Księga 473-439	Szybko wysycha żel cyjanoakrylowy
Żel cyjanokrylanowy	Komponenty RS	Księga 473-423	Przymocuj ze stali nierdzewnej do czaszki
Frez dentystyczny	Storz Instruments, Bausch i Lomb	E0824A	Miniaturowa głowica wiertarska o średnicy ~0,7 mm do wykonania małego otworu w czaszce nad każdą półkulą w celu wszczepienia VEP
wiertarka	Bosch	Seria Dremel 300	Automatyczne wiertło do trepanacji
Enrofloksyna	Laboratoria Troy		Profilaktyczny antybiotyk pooperacyjny
Sfera integrująca Ganzfelda	Międzynarodowe rozwiązania fotometryczne		Specjalnie zaprojektowany stymulator światła: średnica 36 mm, apertura 13 cm
Waciki z gazy	Multigate Medical Products Pty Sp. z o.o	57-100 mld	Wysusza nacięcie chirurgiczne i odsłoniętą powierzchnię czaszki podczas operacji
Izofluran 99,9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Nazwa własna: Isoflo • Znieczulenie wziewne. Farmaceutyczny środek znieczulający wziewny zmieszany z gazowym tlenem do chirurgii implantów elektrod VEP
Maść Kenacomb	Aspen Pharma Pty Sp. z o.o		Aby zmniejszyć podrażnienie i swędzenie skóry po zabiegu
Luksusowe diody LED	Phillips Lighting Co.		Do stymulacji światłem dwadzieścia diod LED o mocy 5 W i jedna o mocy 1 W, kontrolowana przez oprogramowanie Scope
Igła (makrochirurgia)	Światowe instrumenty precyzyjne	501959	do szycia chirurgii jamy brzusznej i głowy, stosowany z szwem 3-0, igłą do oka, krawędzią tnącą 5/16 koło Rozmiar 1, 15mm
Uchwyt igły (makrochirurgia)	Światowe instrumenty precyzyjne	500224	Do trzymania igły podczas operacji jamy brzusznej i głowy
Uchwyt na igłę (mikrochirurgia)	Światowe instrumenty precyzyjne	555419NT	Do trzymania igły podczas operacji oka
Cewnik Optiva	Smiths Medical International Sp. z o.o.	16 lub 21 g	Poprowadź aktywne elektrody rogówki od czaszki do spojówki
Jod powidonu 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Nazwa własna: Betadine, Środek antyseptyczny do przygotowania ogolonej skóry do zabiegu 10%, 500 ml
System akwizycji danych Powerlab	Instrumenty ADInstruments	Zobacz materiał ML 785	Pozyskiwanie sygnału z nadajnika telemetrycznego, sparowanego z konwerterem danych telemetrycznych
Proksymetakaina 0,5%	Laboratoria Alcon	CAS 5875-06-9	Miejscowa analgezja oczna
Powściągliwość	cutom wykonane		Przód ogranicznika jest zwężany, aby zminimalizować ruchy głowy, długość można regulować, aby dostosować się do różnej długości szczura, całkowita średnica wynosi 60 mm.
Ostrze Scapel	R.G. Zaopatrzenie medyczne	SNSM0206	Do nacięcia chirurgicznego
Nożyczki (makrochirurgia)	Światowe instrumenty precyzyjne	501225	do cięcia tkanek na brzuchu i czole
Nożyczki (mikrochirurgia)	Światowe instrumenty precyzyjne	501232	Aby wypreparować spojówkę w celu zamocowania elektrody
Oprogramowanie do pomiaru zakresu	Instrumenty ADInstruments	Wersja 3.7.6	Jednocześnie wyzwala bodziec za pośrednictwem systemu ADI Powerlab i zbiera dane
golarka	Oster	Złoty A5	Golenie futra z obszarów chirurgicznych
ze stali nierdzewnej	Mikrołączniki	L001.003CS304	Średnica wału 0,7 mm, długość 3 mm
Ramka stereotaktyczna	Dawid Kopf	Wzór 900	Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt do lokalizowania punktów orientacyjnych implantacji na czaszce
Serweta chirurgiczna	Niezbędne środki medyczne	Silnik GM29-612EE	Zapewnienie sterylnego środowiska podczas operacji
Szew (makrochirurgia)	Igły medyczne Ninbo	Wynik 3-0	do szycia chirurgii jamy brzusznej i głowy, sterylny jedwabny oplot, 60cm
Igła do szycia (mikrochirurgia)	Igły medyczne Ninbo	8-0 lub 9-0	do chirurgii oka, w tym elektroda do szycia twardówki i zamykanie rany spojówki, szew nylonowy, koło 3/8 1×5, 30cm
Konwerter danych telemetrycznych	Międzynarodowe usługi DataSciences	Czynnik R08	Umożliwia połączenie sygnału telemetrycznego z oprogramowaniem do zbierania danych
Macierz wymiany danych telemetrycznych	Międzynarodowe usługi DataSciences		Zbiera dane z nadajników, paruje z odbiornikiem
Odbiornik danych telemetrycznych	Międzynarodowe usługi DataSciences	RPC-1	Odbiera dane telemetryczne z nadajnika
Nadajnik telemetryczny	Międzynarodowe usługi DataSciences	F50-EEE (elektroniczny sprzęt elektryczny)	3-kanałowy nadajnik telemetryczny
Tropikamid 0,5%	Laboratoria Alcon		Rozszerzenie tęczówki
Pęseta (makrochirurgia)	Światowe instrumenty precyzyjne	500092	Manipulowanie tkankami podczas operacji jamy brzusznej i głowy
Pęseta (mikrochirurgia)	Światowe instrumenty precyzyjne	500342	Manipulowanie tkankami podczas operacji oka

. .