Elektroencefalograficzny zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Montaż sondy mikrodializy z elektrodą

1. Użyj 3-kanałowej, dwuskręconej elektrody (z elektrodą rejestrującą o długości co najmniej 20 mm i elektrodą uziemiającą o długości 10 cm) i połącz ją z kaniulą prowadzącą, aby przygotować urządzenie. Zobacz przykłady elektrod 3-kanałowych i kaniuli prowadzącej do dializy na rysunku 1A-1B.
2. Wyjmij (Rysunek 1C) i włóż (Rysunek 1D) metalową kaniulę prowadzącą do atrapy plastikowej kaniuli kilka razy przed użyciem, aby ułatwić jej wyjęcie w momencie przełączenia na sondę do mikrodializy u zwierzęcia.
3. Zegnij skręcone druty elektrody rejestrującej dwa razy (rysunek 1E-1F), aby wyrównać przewody z atrapą kaniuli prowadnicy i przyciąć końcówkę elektrody (rysunek 1G) tak, aby była o 0,5 mm dłuższa niż końcówka kaniuli prowadzącej (rysunek 1H) za pomocą suwmiarki cyfrowej.
4. Przygotuj silikonowy krążek o długości 1 mm (średnica zewnętrzna [OD] 2 mm, grubość 0,3 mm; Rysunek 1I) i włóż końcówkę kaniuli prowadzącej i końcówkę skręconych elektrod do silikonowego kółka za pomocą pęsety (Rysunek 1J). Przymocuj go do podstawy cokołu kaniuli prowadzącej za pomocą kleju polimerowego o szybkim działaniu lub żywicy (rysunek 1K). Zobacz przykład ukończonych urządzeń na rysunku 1L i rysunku 2A.
5. Sterylizuj urządzenie w bakteriobójczym świetle ultrafioletowym (UV) przez 4 godziny. Odwróć urządzenie cztery razy, tak aby każda z jego stron była wystawiona na działanie światła przez 1 godzinę
   nuta: Wiele domowych elektrod i sond do mikrodializy może być montowanych w podobny sposób. Głowa wyżej opisanego implantu dla szczurów ma następujące wymiary: 7 mm szerokości x 5 mm głębokości x 10 mm długości od czubka do palca u nogi cokołu; Końcówka implantu ma około 11 mm długości, średnicę 600 μm, a całe urządzenie waży około 330-360 mg. Wyrób może być ponownie użyty dwa lub trzy razy, jeżeli (i) wystarczająca długość elektrody uziemiającej zostanie pozostawiona na czaszce podczas operacji do następnego użycia oraz (ii) gdy zwierzę zostanie uśmiercone, a wyrób odzyskany wraz z cementem dentystycznym pozostawia się go na noc w acetonie, tak aby cement mógł zostać mechanicznie zdezagregowany, a urządzenie ponownie umyte i wysterylizowane.

2. Chirurgia stereotaktyczna

1. Do implantacji urządzenia należy użyć aparatu stereotaktycznego i uchwytu na klips sondy (ryc. 2B) zgodnie z obecnymi standardami dla operacji aseptycznych i bezbolesnych.
   1. Znieczulić dorosłe szczury Sprague-Dawley mieszaniną ketaminy/ksylazyny (43 mg/kg i 7 mg/kg, dootrzewnowo [i.p.]) i przymocować ją do ramy stereotaktycznej. Dodać znieczulenie izofluranem (1,4% w powietrzu; 1,2 ml/min) do początkowego wstrzyknięcia ketaminy/ksylazyny, ponieważ pozwala to kontrolować głębokość znieczulenia w czasie. Ogol futro na głowie zwierzęcia.
2. Przetrzyj powierzchnię skóry głowy roztworem na bazie jodu, a następnie 70% etanolem, aby przygotować ją do operacji aseptycznej.
   1. Wszczepić przygotowaną w pierwszej kolejności kaniulę prowadzącą (1,1 – 1,5) do prawego brzusznego hipokampa, podając następujące współrzędne: belka nosowa + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm do bregmy. Postępuj zgodnie ze standardowymi technikami operacji stereotaktycznych.
   2. Upewnij się, że nie zakrywa kotwiących. Montując go na aparacie stereotaktycznym, chwyć urządzenie za głowicę kaniuli prowadzącej, ponieważ można ją łatwo dopasować do uchwytu sondy.
3. Zakotwicz urządzenie w czaszce za pomocą co najmniej czterech ze stali nierdzewnej, wkręcając je w kość czaszki (1 śruba w lewą i 1 śruba w prawą przednią płytkę kostną, 1 śruba w lewą płytkę ciemieniową i 1 śruba w płytki kości międzyciemieniowej). Dodaj kroplę kleju tkankowego, aby dodatkowo przymocować każdą do kości czaszki.
   1. Przykryj połowę gwintów cementem metakrylowym. Promuj wiązanie cementu, wykonując płytkie rowki w kości, aby zwiększyć przyczepność.
4. Gdy końcówka urządzenia zostanie umieszczona w tkance mózgowej, skręć drut elektrody uziemiającej wokół 3 kotwiących. Przykryj wszystkie zamontowane i urządzenie cementem dentystycznym.
5. Obserwuj zwierzęta podczas zabiegu i przez około 1 godzinę po zabiegu, aż osiągną pozycję pionową i będą poruszać się po klatce. Trzymaj je na podkładce rozgrzewającej, aby uniknąć hipotermii. Pozwól szczurom dojść do siebie przez co najmniej 7 dni po implantacji urządzenia.
6. Monitoruj zwierzęta co najmniej raz dziennie przez 3 dni po operacji pod kątem oznak bólu lub niepokoju. Podawać zwierzętom krem z antybiotykiem (gentamycyna 0,1%) w pobliżu miejsca nacięcia, aby zapobiec zakażeniu, oraz ze środkiem przeciwbólowym (tramadol 5 mg/kg mc., i.p.) przez 3 dni, aby zapobiec bólowi pooperacyjnemu.

3. Indukcja padaczki skroniowej przez pilokarpinę i przypisanie zwierząt do grup eksperymentalnych

1. Po tygodniu rekonwalescencji pooperacyjnej należy losowo przydzielić zwierzęta do grup: (i) zwierzęta kontrolne otrzymujące nośnik oraz (ii) zwierzęta z padaczką, które otrzymają pilokarpinę. W grupie chorych na padaczkę należy stosować proporcjonalnie większą liczbę zwierząt, ponieważ nie u wszystkich szczurów, którym podawano pilokarpinę, choroba zachoruje.
2. Wstrzyknąć dawkę metyloskopolaminy (1 mg/kg mc., podskórnie [podskórnie]), a 30 minut po niej pojedyncze wstrzyknięcie pilokarpiny (350 mg/kg mc., i.p.) w celu wywołania stanu padaczkowego (SE). Wstrzyknąć metyloskopolaminę i nośnik (sól fizjologiczną) szczurom kontrolnym. Do wszystkich podań dożylnych należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 25G.
   1. Sprawdź wzrokowo, czy zwierzęta zaczynają mieć napady behawioralne (poruszanie wibrysami w ciągu 5 minut, głową, klonowanie kończyn) i w ciągu 25 minut, ciągłe klonowanie całego ciała (SE).
3. Zatrzymaj SE 2 godziny po wystąpieniu, aby mieć śmiertelność około 25% i średni okres utajenia wynoszący około 10 dni po podaniu diazepamu (20 mg/kg, i.p.). Należy obserwować i rejestrować wszelkie napady drgawkowe, które rozpoczynają się bezpośrednio po wstrzyknięciu pilokarpiny i kontynuują przez co najmniej 6 godzin po wstrzyknięciu.
4. Podawać zwierzętom sól fizjologiczną (1 ml, i.p.) za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 25 g i roztworem sacharozy (1 ml, p.o.) za pomocą strzykawki 1 ml i elastycznej igły do karmienia 17G przez 2-3 dni po SE, aby przyspieszyć utratę masy ciała.
   1. Z badania należy wykluczyć zwierzęta, które nie osiągnęły początkowej masy ciała w ciągu pierwszego tygodnia po zastosowaniu pilokarpiny SE (z wyjątkiem grupy z ostrą postacią uśmierconą 24 godziny po SE, w której obserwacja masy ciała nie jest możliwa).
5. Zwierzęta po SE należy losowo przydzielić do różnych grup eksperymentalnych (ryc. 3): faza ostra (w której mikrodializa odbywa się 24 godziny po SE), latencja (7-9 dni po SE), pierwszy spontaniczny napad padaczkowy (około 11 dni po SE) i okres przewlekły (rozpoczyna się około 22-24 dni po SE, tj. około 10 dni po pierwszym napadzie). Monitorować zwierzęta pod kątem występowania napadów samoistnych.
   nuta: Stosować następujące kryteria włączenia/wykluczenia do dalszych doświadczeń na szczurach z padaczką: rozwój konwulsyjnego SE w ciągu 1 godziny po podaniu pilokarpiny; przyrost masy ciała w pierwszym tygodniu po SE i prawidłowe ustawienie sondy i elektrody do mikrodializy.

4. Monitorowanie i analiza zachowania epilepsji

1. Długoterminowe monitorowanie zachowań padaczkowych
   1. Po około 6 godzinach od podania pilokarpiny (tj. po zakończeniu bezpośredniej obserwacji przez badaczy) należy umieścić zwierzęta w czystych klatkach domowych i rozpocząć 24-godzinny monitoring wideo.
   2. Kontynuuj 24-godzinny monitoring wizyjny do 5 dnia, korzystając z cyfrowego systemu nadzoru wizyjnego.
   3. Począwszy od 5 dnia, podłącz szczury w ich domowych prostokątnych klatkach do systemu rejestracji EEG na uwięzi i kontynuuj 24-godzinny monitoring wideo.
   4. Ustaw parametry na wzmacniaczu umieszczonym na zewnątrz klatki Faradaya (ustaw współczynnik wzmocnienia na każdym kanale zgodnie ze specyfiką sygnału EEG każdego zwierzęcia) i rozpocznij akwizycję EEG obserwując sygnał EEG wytwarzany przez niepodłączone. Użyj częstotliwości próbkowania 200 Hz i filtra dolnoprzepustowego ustawionego na 0,5 Hz.
   5. Podłącz zwierzę do trzymających głowę zwierzęcia między dwoma rozciągniętymi palcami jednej ręki i przykręcając złącza do cokołu elektrody drugą wolną ręką. Rozpocznij pobieranie.
      ostrożność: Upewnij się, że sygnał jest wolny od artefaktów. Typowymi artefaktami są skoki znacznie przekraczające skalę.
   6. Dzień przed eksperymentem mikrodializy przenieś zwierzęta do systemu EEG na uwięzi wyposażonego w cylindry z pleksiglasu do mikrodializy. Odłącz zwierzęta od systemu uwięzi EEG w domowej klatce, przykręcając łączniki od elektrody bez krępowania zwierzęcia. Umieść zwierzę w wysokich cylindrach z pleksi.

Rysunek 1. Przygotowanie urządzenia do wszczepienia krok po kroku. (A) 3-kanałowa elektroda z elektrodą uziemiającą o długości 10 cm w tulei ochronnej po lewej stronie i kaniulą prowadzącą do mikrodializy po prawej potrzebnej do montażu urządzenia. (B). Konkretnie goła elektroda i kaniula prowadząca. Pierwszym krokiem jest kilkukrotne wyjęcie (C) i włożenie (D) metalowej kaniuli prowadzącej z plastikowego manekina i do jego plastikowego manekina, aby ułatwić jej uwolnienie po wszczepieniu w głowę zwierzęcia. Drugim krokiem jest dwukrotne zgięcie skręconej elektrody rejestrującej, która ma być wyrównana z kaniulą prowadzącą dializę (E, F). (G) Końcówkę elektrody należy przyciąć tak, aby była o 0,5 mm dłuższa niż końcówka metalowej kaniuli prowadzącej. (H) Sprawdź precyzję cięcia za pomocą suwmiarki cyfrowej. Następnie należy użyć silikonowego kółka o długości około 1 mm, aby ustalić wyrównanie elektrody do prowadzenia stopki kaniuli (I). (J) Fotografia pokazująca, jak zadzwonić elektrodą i poprowadzić trzon kaniuli. Ostatnim krokiem jest nałożenie kropli żywicy lub kleju na cokół kaniuli prowadzącej, przymocowując do niego silikonowy kółko (K). (L) Zmontowane urządzenie gotowe do sterylizacji.

Rysunek 2. Fotografie różnych typów urządzeń do mikrodializy-EEG u szczurów używane (A) oraz fotografia uchwytu klipsa do sondy (B) używanego do wszczepiania tych urządzeń. (A) Kaniulę prowadzącą (w kolorze zielonym) zastępuje się kaniulą do mikrodializy, zwykle 24 godziny przed eksperymentem. Złącze elektryczne urządzenia (pierwsze po lewej używane było do nagrań opisanych w tym rękopisie) pozwala na podłączenie przewodów przewodzących sygnał elektryczny do wzmacniacza i sprzętu do zbierania danych. Urządzenie jest chirurgicznie przymocowane do czaszki znieczulonych szczurów, a nagrania można uzyskać później bez powodowania bólu lub dyskomfortu u swobodnie zachowujących się szczurów.

Rysunek 3. Projekt eksperymentalny. Tydzień przed indukcją stanu padaczkowego (SE) szczurom wszczepia się urządzenie. SE jest wywoływane przez pilokarpinę, a zwierzęta (jeśli nie są dializowane i zabijane po 24 godzinach od SE; szczury z grupy ostrej) są monitorowane wideo przez 5 dni (niebieska linia), a następnie monitorowane wideo EEG w celu oceny częstotliwości i czasu trwania napadów w ich klatkach domowych (zielona linia). W eksperymencie mikrodializy szczury z padaczką i odpowiednie szczury kontrolne bez padaczki są przenoszone do innego zestawu EEG wyposażonego w klatki cylindryczne w ciągu 24 godzin przed sesją mikrodializy i nadal monitorowane wideo EEG (jasnozielona linia). Pionowe czerwone linie reprezentują sesje dializ w różnych punktach czasowych rozwoju choroby padaczkowej. Poziome czerwone linie reprezentują różne grupy zwierząt z padaczką (i odpowiednie zwierzęta niecierpiące na padaczkę), gdzie strzałka wskazuje ostatni dzień mikrodializy i dzień śmierci zwierzęcia.