Zapisy elektrofizjologiczne preparatów pnia mózgu i rdzenia kręgowego od nowonarodzonego gryzonia

Streszczenie

Źródło: Rousseau, J., et al. Elektrofizjologia na izolowanych preparatach rdzenia kręgowego od nowonarodzonych gryzoni pozwala na rejestrację danych wyjściowych sieci nerwowej układu oddechowego. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film pokazuje nagrania elektrofizjologiczne izolowanych preparatów rdzenia mózgowo-rdzeniowego od nowonarodzonych gryzoni. Preparat umieszcza się w komorze rejestracyjnej, a wyrzuty wdechowe z pnia mózgu rejestruje się w warunkach natlenienia i niedotlenienia za pomocą czwartego korzenia nerwu brzusznego w rdzeniu kręgowym.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Konfiguracja i przygotowanie

1. Rozwiązania
   1. Przygotować roztwory podstawowe sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) zgodnie z poniższymi przepisami. W literaturze dostępne są inne przepisy z różnymi stężeniami. Roztwory podstawowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
      1. Roztwór soli: dodać 75,39 g NaCl (129 mM końcowy), 2,5 g KCl (3,35 mM końcowy), 0,81 g NaH₂PO4 (0,58 mM końcowy), 2,33 g MgCl₂ (1,15 mM końcowy), 1,85 g CaCl₂ (1,26 mM). Rozpuścić w 800 ml wody destylowanej, a następnie napełnić do 1 l wodą destylowaną.
      2. Roztwór wodorowęglanu: dodać 17,65 g NaHCO₃ (21 mM końcowy). Rozpuścić w 900 ml wody destylowanej, a następnie napełnić do 1 l wodą destylowaną. Zmiany stężenia wodorowęglanów spowodują zmiany pH.
      3. Roztwór glukozy: dodać 54,06 g glukozy (30 mM wersja ostateczna). Rozpuścić w 400 ml wody destylowanej, a następnie napełnić do 500 ml wodą destylowaną.
   2. Przygotować płyn mózgowo-rdzeniowy, rozcieńczając 100 ml roztworu soli, 100 ml roztworu wodorowęglanu i 50 ml roztworu glukozy w 1 litrze wody destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
   3. Przygotuj szklaną elektrodę, podgrzewając i rozciągając szklaną rurkę, aż pęknie. Przeszlifuj końcówkę przed użyciem. Elektroda może być wielokrotnie używana, o ile pozostaje czysta.
2. Konfiguracja eksperymentalna
   nuta: Szczegóły konfiguracji przedstawiono na rysunku 1.
   1. Włącz wzmacniacz, średnią ruchomą, system akwizycji danych, regulator temperatury i pompę. Sprawdź wzmocnienie sygnału (wzmocnienie = 10 000), filtrację (niski próg, 10 Hz; wysoki próg, 5 kHz) oraz częstotliwość próbkowania konwersji analogowo-cyfrowej surowego sygnału (2,5 kHz).
   2. Napełnij butelkę płynem CSF i bąbelkuj ją karbogenem (95%_O2, 5% CO₂). Indukować bąbelkowy i podgrzany przepływ płynu CSF w komorze rejestracyjnej (objętość 5 ml) z prędkością 4 ml/min. Utrzymywać temperaturę w komorze rejestracyjnej na poziomie 26 (± 1) °C. pH powinno wynosić 7,4 w tych standardowych warunkach.
   3. Przechowywać 50 ml płynu CSF o temperaturze pokojowej (RT) i pęcherzyków karbogenu w strzykawce o pojemności 50 ml w pobliżu komory rozwarstwiania.
   4. Włącz komputer i uruchom oprogramowanie do nagrywania.

2. Sekcja

1. Zważ i wizualnie określ płeć zwierzęcia (samce mają większą odległość odbytowo-płciową, podczas gdy samice mają krótką odległość odbytowo-płciową; męskie genitalia są często ciemne, podczas gdy żeńskie genitalia są różowe).
2. Znieczulenie nowonarodzonych gryzoni należy zastosować jedną z następujących opcji: krioanestezjologia (całkowite zanurzenie zwierzęcia w lodzie na 4 – 5 minut), wstrzyknięcie (equitenzyna w dawce 4 ml/kg) lub wdychanie lotnych środków znieczulających (izofluran lub eter). Potwierdź odpowiednią płaszczyznę znieczulenia przy braku odruchu wycofania łapy.
3. Połóż zwierzę na ławce, brzusznie twarzą w dół. Przeciąć rostralną część głowy na poziomie bregmy (widocznym przez skórę i czaszkę). Wykonaj ten krok natychmiast po znieczuleniu zwierzęcia.
4. Przeciąć ciało koronalnie skalpelem pod przednimi członkami.
5. Usuń skórę, mięśnie, tkankę tłuszczową i viscus za pomocą chirurgicznych i cienkich nożyczek i szczypiec. Ponieważ kości są miękkie w tym wieku, należy uważać, aby nie uszkodzić układu nerwowego. Wykonaj ten krok na ławce.
6. Umieścić preparat w komorze rozwarstwiającej. Użyć płynu CSF przechowywanego w strzykawce w celu natlenienia preparatu. Od tego momentu do końca nagrania należy użyć mikroskopu.
7. Na grzbietowej powierzchni preparatu przeciąć czaszkę i kręgi od części rostralnej do ogonowej wzdłuż osi środkowej za pomocą chirurgicznych i cienkich cienkich nożyczek i szczypiec. Otwórz przeciętą czaszkę i kręgi, aby odsłonić tkankę nerwową. Użyć płynu CSF przechowywanego w strzykawce w celu natlenienia preparatu.
8. Za pomocą szczypiec usuń błonę pajęczynówki, cienką tkankę pokrywającą powierzchnię tkanki nerwowej. Utrzymuj pia mater i naczynia krwionośne przy tkance nerwowej. Użyć płynu CSF przechowywanego w strzykawce w celu natlenienia preparatu.
9. Umieść preparat grzbietem do dołu i ostrożnie opuść pień mózgu i rdzeń kręgowy, przecinając nerwy i tkankę łączną nożyczkami, przytrzymując preparat na miejscu. Możliwe jest również podejście grzbietowe. Utrzymuj korzenie i nerwy tak długo, jak to możliwe. Usuń kości, aby odizolować pień mózgu i rdzeń kręgowy. Użyć płynu CSF przechowywanego w strzykawce w celu natlenienia preparatu.
10. Usuń móżdżek i pozostałe struktury rostralne, dzieląc je skalpelem. Użyć aCSF przechowywanego w igle do natlenienia preparatu.
11. Opcjonalnie, w zależności od projektu eksperymentalnego, usunąć most za pomocą skalpela przez odcinek koronalny przed tętnicą móżdżkową dolną. Należy pamiętać, że utrzymanie całego mostu spowolni rytm u szczurów i całkowicie go zahamuje u myszy. Preparaty, które obejmują tylko ogonową część mostu, wykazują aktywność podobną do oddechowej ze stabilną częstotliwością u nasady C4.

3. Nagrywanie

1. Umieścić preparat w komorze rejestracyjnej brzusznie do góry. Preparat należy przymocować za pomocą szpilek w najniższej części rdzenia kręgowego i najbardziej rostralnej części pnia mózgu.
2. Za pomocą strzykawki połączonej igłą z elektrodą wywołać wgłębienie w elektrodzie (średnica szklanej końcówki: 150 - 225 μm) poprzez wyciągnięcie tłoka strzykawki, w celu częściowego napełnienia elektrody płynem CSF.
3. Za pomocą mikromanipulatora ostrożnie umieść elektrodę blisko jednego z czwartych korzeni brzusznych. Inne korzenie brzuszne mogą również wykazywać aktywność podobną do oddechowej (np. XII nerw czaszkowy, korzeń brzuszny C1).
4. Wywołaj wgłębienie w zbiorniku elektrody za pomocą strzykawki, wyciągając tłok, aby delikatnie zassać korzeń nerwowy. Następnie ostrożnie przesuń elektrodę, aby przyłożyć ją do rdzenia kręgowego.
   nuta: Idealnie rozmiar korzonka odpowiada rozmiarowi otworu elektrody, a tym samym tworzy uszczelnienie między wewnętrznymi i zewnętrznymi komorami elektrody. Ponieważ wzmacniacze różnicowe są powszechnie stosowane do takich nagrań, każdy otwór między wnętrzem elektrody a komorą nagraniową obniża jakość sygnału i utrudnia eliminację szumów tła.
5. Rozpocznij nagrywanie.
6. Rejestrować rytm wytwarzany przez preparat w warunkach normoksyjnych (tj. płyn mózgowo-rdzeniowy bąbelkowany karbogenem: 95%_O2 i 5% CO_{2 )} przez co najmniej 20 minut w celu określenia podstawowych parametrów preparatu.
7. Zmień perfuzję z bąbelkowego aCSF z karbogenem na bodziec aCSF (tj. bąbelkowany 95% N₂ i 5% CO₂ dla bodźca hipoksji) na 15 minut. Zmień czas ekspozycji w zależności od protokołu eksperymentalnego. Zapisz czas ekspozycji w zapisie i karcie charakterystyki zwierzęcia. Jeśli to możliwe, należy używać rurek ze stali nierdzewnej między butelką CSF a komorą, aby uniknąć dyfuzji gazu na zewnątrz rurki.
8. Przełącz perfuzję z powrotem na standardowy aCSF z pęcherzykami karbogenu na co najmniej 15 minut, aby uzyskać zapis regeneracji. Zapisz to w karcie danych dotyczących nagrywania i zwierzęcia.
9. Zakończ nagrywanie.

Wyniki

Rysunek 1. Podsumowujący schemat konfiguracji.Bąbelkowany aCSF jest podgrzewany i wysyłany przez pompę do komory nagrywającej. Nadmiar płynu CSF w komorze zapisu jest zasysany przez pompę i usuwany. Komora zapisu jest połączona z ziemią i regulatorem temperatury. Wyjście elektrody jest bezpośrednio przekazywane do wzmacniacza, następnie do średniej ruchomej i systemu akwizycji danych, a na końcu do ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	Zastosowanie pod maską
Zawartość NaCl	Sklep biologiczny	SOD002
Kcl	Sklep biologiczny	Zobacz materiał POC888
CaCl2	Sklep biologiczny	Zobacz materiał CCL444
MgCl2	Sklep biologiczny	Zobacz materiał MAG510
NaHCO3	Sklep biologiczny	SOB999 powiedział
NaH2PO4	Sklep biologiczny	Zobacz materiał SPM306
D-glukoza	Sklep biologiczny	GLU501
Karbogen	Linde (Przedsiębiorstwo Linde	343-02-0006
Regulator temperatury	Warner Instruments, Hamden, CT, Stany Zjednoczone	TC-324B
Elektroda ssąca	A-M Systems, Everett, WA, Stany Zjednoczone	nr kat. 573000
Różnicowy wzmacniacz prądu przemiennego	A-M Systems, Everett, WA, Stany Zjednoczone	nr wzoru 1700
Średnia ruchoma	CWE, Ardmore, Pensylwania, Stany Zjednoczone	model MA-821
System akwizycji danych	Dataq Instruments, Akron, OH, Stany Zjednoczone	model DI-720
Oprogramowanie LabChart	ADInstruments, Colorado Springs, Kolorado, Stany Zjednoczone
Oprogramowanie pryzmatyczne	Graphpad, La Jolla, CA, Stany Zjednoczone
Komora nagraniowa	Domowej roboty
baza	Kanetec, Bensenville, IL, Stany Zjednoczone
Mikromanipulator	World Precision Instrument Inc, Sarasota, Floryda, Stany Zjednoczone	Mb
baza	Kanetec, Bensenville, IL, Stany Zjednoczone	KITE-R
Pompa perystaltyczna	Gilson, Middleton, Wisconsin, Stany Zjednoczone	Mb
Klatka Faradaya	Domowej roboty	MINIPULS 3
komputer

powiedział: powiedział: : powiedział: