Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie chirurgiczne
- Wyczyść i przygotuj nadajnik, aby zapewnić bezpieczną i sterylną operację. Wyjmij nadajnik z opakowania antystatycznego i spryskaj lub namocz w 70% etanolu. Opłucz nadajnik sterylną solą fizjologiczną i umieść między sterylnymi bawełnianymi gąbkami nasączonymi sterylną solą fizjologiczną lub trzymaj zanurzony w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
- Zbierz i wysterylizuj narzędzia potrzebne do operacji, autoklaw parowy do sterylizacji. Zobacz tabelę materiałów i odczynników, aby zapoznać się z listą narzędzi chirurgicznych.
2. Implantacja chirurgiczna
- Znieczulać zwierzęta i utrzymywać znieczulenie zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC. Na początku i w trakcie operacji należy sprawdzać odruch szczypania palców u nóg co 15 minut. Brak odpowiedzi wskazuje na wystarczający poziom znieczulenia.
- W przypadku szczeniąt należy zastosować znieczulenie izofluranem (4%) zO2 (100%). U dorosłych należy stosować ketaminę (100 mg/kg) z ksylazyną (10 mg/kg).
- Ustal pozycję w ramce stereotaktycznej. Umieść końcówki paska dousznego w przewodzie słuchowym. Nie dokręcaj nadmiernie nauszników, ponieważ czaszka jest bardzo miękka u młodych szczeniąt szczurów. Zabezpiecz stożek nosowy do znieczulenia.
- Utrzymuj zwierzę w cieple podczas operacji, umieszczając je na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C. U dorosłych zwierząt nałóż maść nawilżającą na oczy zwierzęcia.
- Sterylizuj miejsce nacięcia i utrzymuj sterylne pole operacyjne.
- Przetrzyj skórę głowy naprzemiennie 70% etanolem i betadyną. Zacznij od środka skóry głowy i wykonuj coraz szersze koncentryczne kręgi.
- Przykryj zwierzę zasłoną i przeprowadź operację na udrapowanym zwierzęciu. Utrzymuj sterylne pole operacyjne, wykładając zestaw chirurgiczny sterylnymi serwetami, spryskując sprzęt 70% etanolem.
- Nosić sterylne rękawice chirurgiczne i fartuch (lub zgodnie z wymaganiami instytucji). Aby pomóc w utrzymaniu sterylnego pola, użyj asystenta chirurgicznego.
- Wykonaj nacięcie na skórze głowy zwierzęcia nieco za oczami wzdłuż linii środkowej, około 2 cm. Zachowaj ostrożność podczas wkładania skalpela, ponieważ czaszka jest nadal bardzo miękka u młodych szczeniąt szczurów. Wykonaj pojedyncze cięcie, aby nacięcie mniej krwawiło i szybciej się goiło.
- Odsłoń czaszkę. Przygotuj czysty i suchy obszar, aby zmaksymalizować wiązanie między nadajnikiem a kośćmi czaszki. Użyj klipsów do tętniaka, aby chwycić skórę głowy.
- Delikatnie odciągnij skórę głowy od linii środkowej w czterech rogach. Szukaj anatomicznych punktów orientacyjnych, takich jak bregma i lambda w czaszce. Pamiętaj, że kości czaszki nie są zrośnięte u zwierząt w tym wieku. Użyj atlasu współrzędnych stereotaktycznych Paxinos, aby znaleźć prawidłowe położenie otworu na zadziory.
- Użyj narzędzia typu Dremel z wiertłem z zadziorami. Utwórz dwa otwory zadziorów w żądanych pozycjach nagrywania, przy czym otwory o średnicy większej niż 300 μm. Umieść otwór na elektrodę odniesienia nad móżdżkiem za lambdą czaszki.
- Upewnij się, że przewody nadajnika są wyrównane z otworami na zadziory. Jeśli druty elektrod nie są wyrównane, prawdopodobne jest zanieczyszczenie elektrod klejem, co spowoduje słaby sygnał. Aby wyrównać przewody, sprawdź dopasowanie nadajnika i delikatnie zegnij elektrody, aby ustawić się w linii nad przewidzianymi miejscami na otwory na zadziory.
- Przyciąć przewody elektrod. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przyciąć elektrody do żądanej długości. Głębokość elektrody jest ważna dla rodzaju zapisu wymaganego w eksperymencie (tj. umieść elektrody powyżej opony twardej dla zapisów EEG lub użyj współrzędnych stereotaktycznych dla zdefiniowanych struktur mózgu).
- Obficie nałóż cyjanoakrylan na podstawę nadajnika, aby pokryć obszar, upewniając się, że elektrody nie są powlekane. Klej cyjanoakrylowy jest izolatorem elektrycznym, zanieczyszczenie elektrod klejem nie spowoduje powstania sygnału.
- Jeśli nagrywasz z głębokich struktur mózgu, zamontuj nadajnik na uchwycie kaniuli i umieść go w ramieniu stereotaktycznym w celu sterowania osią z. Opuść nadajnik za pomocą ramienia stereotaktycznego na odpowiednią głębokość i umieść żel cyjanoakrylowy wokół nadajnika.
- Dokładnie wysusz czaszkę przed umieszczeniem nadajnika, aby zapewnić mocne wiązanie klejowe. Nałóż nadajnik pokryty cyjanoakrylanem na czaszkę. Uważaj, aby wyrównać elektrody z odpowiednimi otworami na zadziory.
- Staraj się unikać uszkodzenia głównych struktur naczyniowych. Przytrzymaj nadajnik na miejscu z lekkim naciskiem przez jedną minutę. Użyj lekkiego nacisku, aby utworzyć silne połączenie między nadajnikiem a czaszką.
- Zastosuj dodatkowy cyjanoakrylan wystarczający do całkowitego uszczelnienia interfejsu nadajnik/czaszka. Aby zapewnić dobre dopasowanie i mocne połączenie, zmaksymalizuj powierzchnię kleju, który styka się z czaszką. Nałóż klej cyjanoakrylowy w kółko wokół nadajnika, upewniając się, że zarówno czaszka, jak i ściana nadajnika są zakryte.
- Nanieść akcelerator chemiczny (0,1 ml) przez strzykawkę wokół cyjanoakrylanu u podstawy wszczepionego nadajnika. Przyspieszacz należy stosować oszczędnie, uważając, aby nie nakładać go na sąsiednie tkanki.
nuta: Chemiczne przyspieszenie utwardzania cyjanoakrylanem zapewnia szybkie tworzenie silnego wiązania między nadajnikiem a czaszką. Akcelerator cyjanoakrylowy jest przydatny do przyspieszania utwardzania kleju, ale nie jest konieczny.
- Usuń przyspieszacz, dokładnie myjąc obszar sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Akcelerator cyjanoakrylanu może powodować podrażnienie tkanek, jeśli nie zostanie zmyty z obszaru nacięcia. Aby umyć obszar, napełnij strzykawkę o pojemności 1,0 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej i przepłukaj obszar za pomocą igły strzykawki. Ogólnie rzecz biorąc, 0,5 ml soli fizjologicznej wystarcza do wypłukania akceleratora.
- Zszyj skórę wokół podstawy nadajnika, ale nie zakrywaj nadajnika. Górna część nadajnika musi znajdować się nad skórą, aby skutecznie przesyłać sygnały neuronowe. Skóra powinna być odpowiednio napięta wokół nadajnika, a klej wokół urządzenia. Użyj Vicryl lub jedwabnego szwu (miękka nić); Skóra u niedojrzałych zwierząt jest miękka i łatwo ulega uszkodzeniu, jeśli nie stosuje się miękkich szwów. W przypadku dorosłych zwierząt należy użyć dowolnego materiału do szycia.
- Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i połóż je na podgrzewanym kocu w celu odzyskania.
- Upewnij się, że zwierzętom jest ciepło (37 °C) i w stanie chodzenia (tj. są całkowicie wyleczone) przed powrotem do matki. Upewnij się, że zwierzę jest nawodnione, szczypiąc skórę na grzbiecie zwierzęcia (jeśli zwierzę jest odwodnione, skóra pozostanie zdeformowana). Jeśli zwierzę jest odwodnione, należy podać podskórne wstrzyknięcie buforu Ringera z mleczanami. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku.
- Zwierzętom należy podawać buprenorfinę (0,05 mg/kg) w celu leczenia bólu pooperacyjnego oraz we wstrzyknięciu podskórnym 0,1 ml bupiwakainy w miejsce wstrzyknięcia.
nuta: Od początku do końca cała procedura powinna zostać zakończona w ciągu 5-10 minut dla zwierząt w tym wieku (6 dzień po urodzeniu). W przypadku starszych zwierząt czas operacji może potrwać dłużej.
3. Opieka i zakwaterowanie
Uwaga: Niektóre matki mogą nie tolerować szczeniąt z wszczepionym urządzeniem. Być może trzeba będzie wybrać tamy, które są tolerancyjne. Dopuszczalne jest, aby matka poruszała młodymi po klatce, podnosząc je przez nadajnik.
- Po odsadzeniu zwierząt należy je trzymać pojedynczo, aby uniknąć wyjmowania urządzeń z ich partnera w klatce.
- Eutanazja zwierząt za pomocą śmiertelnej dawki pentobarbitalu (25 mg/kg) lub izofluranu (w słoiku), gdy występują oznaki niepokoju.
- Uwaga: niektóre klatki w pomieszczeniach dla zwierząt z wkładkami drucianymi mogą zakłócać działanie wszczepionych nadajników. Pamiętaj, aby sprawdzić wysokość wkładki drucianej, aby upewnić się, że zwierzęta nie mogą dostać nadajnika uwięzionego między "prętami" wkładki drucianej.
4. Zapis EEG
- Umieść zwierzę w klatce samodzielnie lub w jednym pomieszczeniu z rodzeństwem z miotu i matką. Jednak w jednej klatce należy umieścić tylko jedno wszczepione zwierzę. Nie zostawiaj szczeniąt samych w komorze rejestracyjnej na dłużej niż 2 godziny. Monitoruj zwierzęta pod kątem oznak niepokoju i odwodnienia.
- Podłącz dostarczony zasilacz do podstawy odbiornika i sprawdź, czy świeci się kontrolka zasilania. Podłącz bazę odbiornika do systemu akwizycji danych za pomocą Bayonet Neil-Concelman (BNC).
- Umieść klatkę dla zwierząt na górze podstawy odbiornika (Rysunek 1). Lampka "sygnalizacyjna" powinna się zaświecić, wskazując, że wykryto nadajnik. Dane mogą być teraz rejestrowane.
- Aby rejestrować dane, podłącz bazę odbiornika do przetwornika analogowo-cyfrowego i podłącz konwerter do komputera (Rysunek 2).
- Ustaw częstotliwość próbkowania nagrania. Upewnij się, że dane są prawidłowo próbkowane. Wybierz częstotliwość próbkowania co najmniej 250 Hz (zalecane 500 Hz) do nagrywania (szerokość pasma nadajnika wynosi 0.1-100 Hz).
- Zapisuj zdigitalizowane dane i analizuj je za pomocą pakietów oprogramowania do przetwarzania sygnałów, takich jak Matlab.
