$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Konfiguracja do wycinania plasterków mózgu
- Przygotować roztwór tnący składający się z (mM) 125 Choliny-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 D-glukozy nasyconej gazowym karbogenem (95% O2–5% CO2) i roztworu do zapisu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) składającego się z (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 D-glukoza, nasycona karbogenem. Umieść roztwór tnący na lodzie, aby był zimny.
- Zamrozić około 400 ml roztworu do krojenia i zmieszać ze 100 ml niezamrożonego roztworu do krojenia, aby uzyskać zawiesinę lodu. Pęcherzyki z karbogenem (95 % O,2–5 % CO2 ) przy przepływie około 0,5 l/min przez rurki małego kalibru lub szkło spiekane w celu uzyskania stałego, ale delikatnego przepływu pęcherzyków.
- Przygotuj zlewkę o pojemności 250 ml z wypukłą wkładką z nylonowej siatki, na której zostaną umieszczone plastry mózgu. Napełnij płynem CSF, aby przykryć siatkę na około 2 cm i bąbelkować karbogenem, upewniając się, że pęcherzyki nie zakłócają bezpośrednio obszaru trzymania plastrów. Ważne jest również, aby w nylonowej siatce nie było pęcherzyków powietrza, więc jeśli takie są, usuń je. Jest to komora przetrzymywania, która jest utrzymywana w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C).
- Ułóż narzędzia preparacyjne, w tym dużą parę nożyczek, małą parę nożyczek, małe i duże mikroszpatułki oraz duże i małe pary kleszczy i schłodź je na lodzie. Umieść klocek do cięcia tkanek wibratomu na lodzie na kwadracie folii aluminiowej. Zaopatrz się w 2 kawałki bibuły filtracyjnej o długości 6 cm, żyletkę z pojedynczą krawędzią i zlewkę o pojemności 25 ml wypełnioną zawiesiną roztworu tnącego.
- Napełnij drugi pojemnik lodem, połóż kawałek bibuły na lodzie i umieść na nim naczynie hodowlane o średnicy 12 cm. Napełnij naczynie hodowlane roztworem do cięcia, zawiesiną lodu i bąbelkami karbogenu. Jest to pojemnik, w którym przeprowadza się sekcję mózgu.
- Przygotuj wibratom. Wyjmij świeżą obosieczną żyletkę (za każdym razem używaj nowego ostrza) z opakowania i spryskaj 80% etanolem, a następnie wodą dejonizowaną. Przeciąć plastikową pipetę transferową o pojemności 3 ml w miejscu, w którym zaczyna się zwężać. Zostanie to wykorzystane do przeniesienia wycinków mózgu. Zegnij igłę 27 G u podstawy pod kątem około 45° i podłącz do strzykawki o pojemności 1 ml. Zostanie to wykorzystane do manipulowania plasterkami podczas krojenia.
2. Wycinanie plasterków mózgu
- Znieczulić mysz (P16-P18) 2% izofluranem lub lokalnie zatwierdzoną metodą. Po indukcji odetnij głowę zwierzęciu za pomocą dużej pary nożyczek i wrzuć głowę do naczynia hodowlanego o średnicy 12 cm, które zawiera bąbelkową zawiesinę roztworu do cięcia. Gnojowica musi całkowicie zanurzyć głowicę, aby zapewnić szybkie schłodzenie.
- Jedną ręką przytrzymaj przód głowy, złuszczając skórę i tkankę łączną do przodu w kierunku nosa. Za pomocą małych nożyczek przetnij tkankę łączną, aby odsłonić leżącą pod spodem czaszkę. Następnie usuń mięśnie leżące nad grzbietową częścią czaszki i szyi.
- Usuń mózg z czaszki, najpierw zabezpieczając przód czaszki dużymi kleszczami, a następnie wykonaj dwa boczne nacięcia przez kość po obu stronach otworu wielkiego za pomocą małych nożyczek (ryc. 1, nacięcia oznaczone jako A1 i A2).
- Wykonaj kolejne nacięcie między oczami (tuż przed bregmą) (ryc. 1, cięcie oznaczone jako B), a następnie ostrożnie przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego do przodu i odbić przecięte sekcje czaszki, aby odsłonić mózg (ryc. 1, cięcie oznaczone jako C).
- Użyj małej szpatułki, aby zgarnąć mózg i umieścić na naczyniu hodowlanym. Należy pamiętać o nerwach czaszkowych w dolnej części mózgu, które będą musiały zostać przecięte, można to zrobić za pomocą mniejszej mikroszpatułki. Za pomocą większej szpatułki przenieś mózg do zlewki o pojemności 25 ml wypełnionej zawiesiną roztworu tnącego.
- Przygotowanie półkuli mózgu do krojenia.
- Umieść jeden kawałek bibuły filtracyjnej o grubości 6 cm na dnie świeżego naczynia hodowlanego, a następnie napełnij świeżym roztworem do cięcia, zawiesiną i bąbelkami. Użyj większej szpatułki, aby umieścić mózg brzuszną stroną do dołu na bibule filtracyjnej. Weź nową i oczyszczoną żyletkę z pojedynczą krawędzią i przetnij mózg, aby usunąć móżdżek, a następnie wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej, aby rozdzielić mózg na dwie półkule.
- Przygotowanie bloku tkankowego wibratomu.
- Weź schłodzony blok tkanki wibratomowej, osusz powierzchnię i umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na środku i rozprowadź równomiernie do przybliżonej wielkości mózgu. Użyj małej szpatułki, aby manipulować jedną z półkul mózgowych na dużej mikroszpatułce, tak aby przyśrodkowa strona mózgu była w dół.
- Dotknij krawędzi szpatułki na styku mózgu na drugim kawałku bibuły filtracyjnej, aby usunąć jak najwięcej roztworu. Zsuń mózg z większej szpatułki za pomocą mniejszej szpatułki, aby poprowadzić go na klej.
- Przymocuj blok tnący do komory wibratomu i napełnij komorę zawiesiną i pęcherzykami roztworu tnącego, upewniając się, że mózg jest całkowicie zanurzony. Obróć blok tnący tak, aby brzuszna strona mózgu była skierowana w stronę ostrza.
- Krojenie mózgu.
nuta: Każdy wibratom jest unikalny, więc postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
- Ustaw grubość plastra na 450 μm i upewnij się, że ostrze wibruje, gdy porusza się po mózgu z prędkością około 0,3 mm/s. Przecięcie w całości przez mózg od strony brzusznej do powierzchni kory mózgowej, spowoduje to powstanie całych wycinków strzałkowych mózgu, które można wykorzystać do zapisów elektrofizjologicznych. Plastry będą produkowane bocznie lub przyśrodkowo i zazwyczaj można wyciąć 3-4 plasterki z każdej półkuli.
- Jeśli podstawa plastra uniesie się, użyj wygiętej igły 27 G, aby delikatnie docisnąć plasterek z powrotem w dół. Podczas krojenia każdej kropelki należy użyć pipety transferowej, aby przesunąć ją na platformę w komorze przetrzymywania, gdzie są żywotne przez okres do 8 godzin.
3. Zapisy elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej
- Montaż plastra w komorze nagrywania.
- Za pomocą pipety transferowej umieścić wycinek mózgu w zanurzonej komorze rejestracyjnej wypełnionej płynem CSF płynącym z prędkością 1 - 2 ml/min i podgrzanym do temperatury 32 °C. ACSF używany do nagrań różni się od tego w komorze przetrzymywania, ponieważ stężenieMg2+ wzrasta z 2 mM do 4 mM.
- Zabezpiecz plasterek za pomocą "harfy" (półokrągłej stali nierdzewnej z nylonowymi pasmami rozciągniętymi w poprzek w odstępach 2-3 mm). Umieść harfę tak, aby pasma biegły równolegle do CA1. Zwiększyć prędkość perfuzji do 8 - 10 ml/min w temperaturze 32 °C.
- Pod mikroskopem preparacyjnym umieścić elektrodę stymulującą i elektrodę rejestrującą (elektrodę szklaną wypełnioną roztworem rejestrującym aCSF) na powierzchni warstwy promieniowej CA1 (ryc. 2A). Najpierw umieść elektrodę stymulującą, a następnie elektrodę nagrywającą.
- Stymuluj zabezpieczenia Schaffera impulsem testowym o amplitudzie 120 - 150 μA i czasie trwania 0,1 ms i obserwuj wynikowy przebieg fali pobudzającego potencjału postsynaptycznego (fEPSP) w celu określenia stanu warstwy (Rysunek 2B). Elektrody stymulujące i rejestrujące mogą wymagać przesunięcia do warstwy około 50 - 100 μm od powierzchni warstwy, aby uzyskać zapis fEPSP z małą salwą włókien i dużą amplitudą. Zabezpieczenia Schaffera przywołane przez fEPSP są stereotypowe i stanowią dobry wskaźnik zdrowia plastrów. Zdrowe plastry zazwyczaj wykazują stosunek amplitudy włóknistej do fEPSP mniejszy niż 0,3.
- Zmiana położenia elektrod.
- Za pomocą mikroskopu preparacyjnego przesunąć elektrodę stymulującą do środka warstwy oriens i przesunąć elektrodę rejestrującą do warstwy ogniwa piramidalnego jak najbliżej elektrody rejestrującej, jak pokazano na rysunku 3A. Może być konieczne wsunięcie elektrod stymulujących i rejestrujących w warstwę o wielkości około 50 - 100 μm, tak aby amplituda odpowiedzi fEPSP na impuls testowy 120 - 150 μA wynosiła około 1 mV.
- Generowanie oscylacji γ.
- Aby wygenerować γ oscylacje, stymuluj tkankę ciągiem impulsów o długości 20 x 0,1 ms dostarczanych z częstotliwością 200 Hz. Ten bodziec tężcowy może dawać powtarzalne odpowiedzi, gdy jest dostarczany co 5 minut.
- Użyj następujących parametrów nagrywania.
- Przeskaluj wzmocnienie sygnału wyjściowego, aby dopasować je do zakresu napięcia wejściowego przetwornika analogowo-cyfrowego. Upewnij się, że maksymalny oczekiwany skok sygnału wykorzystuje co najmniej 30% zakresu napięcia wejściowego. Zachowaj ostrożność przy ustawianiu zbyt wysokich wzmocnień, ponieważ sygnały mogą się zaciąć. Typowa szerokość pasma potrzebna do nagrań terenowych wynosi 500 Hz ze sprzężeniem AC przy 0,1 Hz w celu usunięcia dryfu linii bazowej.
- Digitalizuj co najmniej 4 - 5 razy szybciej niż częstotliwość narożna filtra dolnoprzepustowego, aby uniknąć aliasowania sygnału.
