Zapisy elektrofizjologiczne z Drosophila sensilla w odpowiedzi na lotne substancje zapachowe

Streszczenie

Źródło: Ng, R., et al. Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila Trichoid sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności. J. Vis. Exp. (2017).

W tym filmie żywa mucha Drosophila jest zamontowana w tubie do badań elektrofizjologicznych. Elektrody są umieszczone u podstawy czułki, aby rejestrować specyficzne odpowiedzi neuronalne na feromony za pomocą neuronów receptorów węchowych muchy.

Protokół

1. Przygotowanie sprzętu do nagrywania at4

1. Za pomocą ściągacza do pipet przygotuj elektrody z kapilarami ze szkła glinokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1.0 mm, średnica wewnętrzna 0.64 mm). Lekko stępić końcówkę elektrody referencyjnej parą cienkich kleszczy, aby ułatwić wprowadzenie do clypeusa muchy (tj. zaokrąglonej płytki z przodu głowy muchy, nad aparatem gębowym).
   UWAGA: W tym badaniu wykorzystano 7-dniowe samce WT (typ dziki) (Berlin). Użyj roztworu soli fizjologicznej AHL jako elektrolitu dla obu elektrod.
2. Przygotować 1 l AHL (Adult Hemolymph-Like) mieszając 900 ml wody destylowanej z 6,312 g NaCl, 0,373 g KCl, 0,337 g NaHCO₃, 0,1120 g NaH₂PO₄, 1,892 g trehalozy ּ2H₂O, 3,423 g sacharozy, 1,192 g kwasu HEPES(N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego), i 8,2 ml 1M MgCl₂. Używając wody destylowanej, zwiększyć całkowitą objętość do 1 l. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 1 N NaOH i wysterylizować roztwór za pomocą systemu filtrów napędzanych próżnią. W przypadku długotrwałego przechowywania porcje AHL należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Stałe dostawy kwasu oleopalmitynowego są uzależnione od jednorodności między wkładami. Każdy wkład musi być zmontowany w powtarzalny sposób.
3. Za pomocą żyletki usuń 0,9 cm z końcówki końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby utworzyć pierwszą sekcję wkładu o długości 4,1 cm; zapoznaj się z wymiarami wyszczególnionymi na rysunku 1A. Użyj kolejnej końcówki pipety o pojemności 200 μl i usuń 1,7 cm i 1,5 cm z końcówki i podstawy, aby utworzyć drugą sekcję wkładu, o wymiarach 1,8 cm (Rysunek 1A). Użyj linijki, aby zapewnić powtarzalność.
4. Użyj dziurkacza 1/8", aby wyciąć krążki z bibuły filtracyjnej.
5. Za pomocą kleszczy umieść krążek z bibuły filtracyjnej na końcu drugiej sekcji wkładu. Wizualnie potwierdź otwór w końcówce wkładu, przez który może przepływać powietrze.
6. Przymocuj pierwszą i drugą sekcję naboju, jak pokazano na rysunku 1A. Ustaw drugą sekcję naboju pod kątem w dół, aby ułatwić prostopadłe celowanie w przygotowanie (Rysunek 1B).
7. Połączyć wkład z rurką doprowadzającą zapach zamontowaną na mikromanipulatorze.
   UWAGA: Taka konstrukcja umożliwia obracanie wkładu na zewnątrz w celu ułatwienia wymiany (Rysunek 1C).
8. Ustaw stały przepływ nawilżonego powietrza na 2 l/min w jednym regulatorze masy, a przepływ nawaniacza na 500 ml/min w innym regulatorze masy.
9. Korzystając z oprogramowania (patrz tabela materiałów), zaprogramuj procedurę podawania 500 ms zaciągnięcia się zapachem.

2. Przygotowanie roztworów odorantu kwasu oleopalmitynowego do dostawy

UWAGA: Orny Or47b reagują zarówno na kwas cis-, jak i trans-palmitynowy. Ponieważ kwas oleopalmitynowy jest niestabilny w temperaturze pokojowej, zapasy są przechowywane w temperaturze -20 °C i zużywane w ciągu miesiąca od otwarcia. Etanol jest rozpuszczalnikiem z wyboru dla kwasu oleopalmitynowego.

1. Za pomocą mieszalnika wirowego dokładnie wymieszaj 10 μl bulionów lub rozcieńczeń kwasu cis- lub trans-palmitynowego z 90 μl 100% etanolu w celu dziesięciokrotnego seryjnego rozcieńczenia w mikroprobówkach o pojemności 1,7 ml. Codziennie przed eksperymentami należy przygotowywać świeże roztwory kwasu oleopalmitynowego i zużyć w ciągu jednego dnia.
   UWAGA: Szklana fiolka jest zalecana do substancji zapachowych nierozpuszczalnych w etanolu do przygotowania rozcieńczeń zapachowych z innymi rodzajami rozpuszczalników organicznych.
2. Za pomocą mikropipety P10 nanieść 5 μl roztworów kwasu cis-palmitynowego o pożądanych rozcieńczeniach na bibułę filtracyjną w każdym odpowiednim wkładzie.
   UWAGA: Najwyższa dawka (^10-1) zawiera 450 μg związku. W przypadku roztworów kwasu trans-palmitynowego należy zamiast tego zastosować 4,5 μl, tak aby najwyższa dawka (^10-1 ) zawierała 450 μg związku.
3. Umieścić wkłady z kwasem oleopalmitynowym w eksykatorze próżniowym na 1 godzinę w temperaturze pokojowej i ciśnieniu 7,59 mmHg, aby całkowicie odparować rozpuszczalnik.
   UWAGA: Wkłady mogą być używane do 4 godzin przy RT.

3. Przygotowanie Drosophila do szybkiego dostępu do at4 Sensilla do nagrań elektrofizjologicznych in vivo

UWAGA: Muchy WT (Berlin) są hodowane na standardowym podłożu z mąki kukurydzianej w temperaturze 25°C w cyklu 12:12 jasno-ciemnym. Po eklacji muchy są dzielone według płci na grupy po dziesięć, przy czym są trzymane w grupach do 7 dnia życia. Or47b ORN (neurony receptorów węchowych) zarówno u samców, jak i samic much reagują na kwas oleopalmitynowy. Dla uproszczenia w obecnym badaniu badane są tylko samce much.

1. Zamontuj szkiełko podstawowe: na szkiełku podstawowym umieść szklane szkiełko nakrywkowe (18 x 18 mm2) na niewielkiej ilości plasteliny, tworząc ze szkiełkiem pod kątem ~3°. Umieść taśmę dwustronną na wewnętrznej krawędzi szkiełka nakrywkowego i w obszarze szkiełka bezpośrednio poniżej. Wymień na nową taśmę na każdy dzień nagrywania (Rysunek 2A).
2. Użyj aspiratora muchowego15, aby zebrać interesującą muchę w rurce, a następnie umieść końcówkę pipety o pojemności 200 μl na końcu rurki. Jednocześnie przesuń rurkę do przodu, wdmuchując do niej powietrze, aby wepchnąć muchę do końca końcówki pipety. Użyj żyletki, aby ciąć tuż pod ciałem muchy i 2 długości głowy nad muchą.
3. Ubij spód końcówki pipety plasteliną, popychając muchę w górę, aż zarówno czułki, jak i clypeus zostaną odsłonięte (ryc. 2B). Aby uniknąć zabicia muchy, dodaj tylko tyle gliny, aby odsłonić czułki i aristae, ponieważ zapobiega to zmiażdżeniu brzucha muchy. Ponadto dodawaj glinkę powoli i delikatnie, aby zapobiec nagłemu zwężeniu. Upewnij się, że mucha żyje, sprawdzając ruch anteny lub trąbki.
4. Użyj kleszczy, aby manewrować końcówką pipety, w której znajduje się mucha. Ustaw głowę tak, aby clypeus był skierowany w prawo od obserwatora. Wyreguluj preparat wzdłuż szkiełka nakrywkowego za pomocą drobnych kleszczyków, aż boczna strona anteny będzie przylegać do zaklejonej taśmą powierzchni szkiełka nakrywkowego (Rysunek 2B).
5. Umieść pręt przytrzymujący na aristę, aby przymocować antenę do taśmy dwustronnej, aby zapobiec ruchowi (Rysunek 2B).
   UWAGA: Pręt przytrzymujący jest wyciągany z kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do pipet i utrzymywany w odpowiedniej pozycji za pomocą plasteliny (rysunek 2A).
6. Umieść preparat na stoliku platformy (Rysunek 2C). Za pomocą mikroskopu upewnij się, że trychoid jest widoczny wzdłuż dystalno-bocznej krawędzi trzeciego segmentu anteny.
   UWAGA: Sylwetka sensilla powinna być wkomponowana w tło, co ułatwi ich identyfikację i ułatwi nagrywanie (ryc. 3). W tym preparacie najbardziej dostępnymi czujnikami trychoidowymi są typu at4.
7. Jak opisano wcześniej, 2, 15, utrzymuj preparat pod stałym nawilżonym przepływem powietrza (2 l/min) dostarczanym przez oddzielną rurkę doprowadzającą powietrze około 2 cm od przygotowania (Rysunek 4).

4. Rejestracja aktywności at4 Sensillum z Ornów Orn Orn w at4 Trichoids w odpowiedzi na kwas palmitynowy

1. Włóż elektrodę referencyjną do clypeusa (Rysunek 3A). Szybkim i płynnym ruchem upewnij się, że elektroda jest włożona tuż pod powierzchnię, gdzie może stykać się z hemolimfą pod naskórkiem, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
2. Powoli opuszczaj elektrodę rejestrującą, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie view co czujnik celu (Rysunek 3B). Nagrywaj pod obiektywem 50x.
   nuta: Twardy naskórek trychoidalny wymaga włożenia elektrody rejestrującej do podstawy czujnika, której szerszy obszar zapewnia większy cel, co zmniejsza prawdopodobieństwo odchylenia elektrody (ryc. 3B, wstawka).
3. Przed zastosowaniem bodźców zapachowych do czułki należy przestrzegać następujących kryteriów wyboru: każdy trichoid, który nie spełnia tych norm, powinien zostać odrzucony, a zamiast niego należy wybrać inny sensilum.
   1. Zwróć uwagę na wysoki stosunek sygnału do szumu (patrz rysunek 3C, aby zapoznać się z przykładem).
   2. Obserwuj możliwe do zidentyfikowania skoki z neuronów at4A i at4C (ryc. 3C).
      UWAGA: Amplituda skoku at4B wydaje się bardzo podobna do at4A10 i nie można jej łatwo zidentyfikować bez stymulacji zapachem.
   3. Zauważ, że podstawowa szybkość wypalania neuronów at4A wynosi około lub mniej niż 20 Hz.
      UWAGA: To kryterium jest specyficzne dla at4A, ponieważ podstawowa szybkość wystrzeliwania neuronu jest wyższa niż w przypadku bazikonicznych ORN. Znacznie wyższe wypalanie podstawowe wskazuje, że neurony mogły zostać uszkodzone podczas wprowadzania elektrod.
4. Podłącz wkład do rurki doprowadzającej nawaniacz. Zacznij od kontroli rozpuszczalnika, a następnie środków zapachowych, od niskich do wysokich stężeń. Użyj mikromanipulatora, aby manewrować wkładem w kierunku preparatu, jednocześnie kierując wkład prosto w głowicę preparatu. Upewnij się wzrokowo, że wkład jest skierowany bezpośrednio na antenę (Rysunek 4) z odległości kilku milimetrów.
   UWAGA: Celem jest zorientowanie otworu wkładu bezpośrednio na antenę i umieszczenie go w pobliżu tkanki docelowej.
5. Upewnij się, że wkład nawaniający jest oddzielony od elektrody rejestrującej po jej prawej stronie na 1 - 2 mm, a od szkiełka przygotowawczego poniżej na około 1 mm.
   nuta: W opisanej tutaj konfiguracji wkład nawaniający jest ściśle otoczony przez elektrodę rejestrującą, elektrodę odniesienia i szkiełko do przygotowania muchy (rysunek 4).
   UWAGA: Weź pod uwagę odległość między wkładem a elektrodami nagrywającymi/referencyjnymi. Zalecana odległość około 4 mm. Niezamierzony kontakt może przerwać sygnał i złamać końcówkę elektrody rejestrującej, uszkadzając neuron prądu i komplikując dalsze nagrania.
   UWAGA: Weź pod uwagę odległość między wkładem a szkiełkiem do przygotowania muchy. Dotknięcie szkiełka nakrywkowego może również spowodować przemieszczenie elektrody nagrywającej, zakłócając nagranie.
6. Naciśnij "Nagraj" w oprogramowaniu do akwizycji danych, aby rozpocząć nagrywanie.
   UWAGA: Dla każdego nagrania trwającego 10 sekund pojedynczy impuls zapachowy o długości 500 ms jest dostarczany bezpośrednio do anteny, jak opisano w kroku 1.9.
7. Po nałożeniu środka zapachowego ostrożnie wycofaj wkład przed zastąpieniem go wkładem o kolejnym najwyższym stężeniu. Kontynuuj, aż do uzyskania całego zakresu dawkowania.
   UWAGA: Zaleca się zarejestrowanie tylko jednego Or47b ORN z każdej muchy, aby uniknąć możliwych skutków adaptacji.
8. Dokładnie wypłucz elektrodę nagrywającą wodą destylowaną po zakończeniu nagrywania na cały dzień.
9. Analizuj i wykreślaj dane za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do analizy offline.

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja wkładu i olfaktometru. (A) Przygotowanie wkładów zapachowych. Od lewej do prawej: standardowa końcówka do pipet o pojemności 200 μl, pierwsza i druga sekcja wkładu oraz kompletny wkład ze środkiem zapachowym. (B) Nabój podłączony do olfaktometru, pokazujący kąt pochylenia drugiej sekcji w dół. (C) Konfiguracja olfaktometru przedstawiająca rurkę doprowadzającą zapachy zamontowaną na mikromanip...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przygotowanie Konfiguracja i Różne materiały
Przyrząd do ściągania pipet	Sutter Instruments, Novato, CA, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał P97	Ściągacz do pipet
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	World Precision Instruments, Sarasota, Floryda, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 1B100F-4	do wykonania prętów mocujących
Kapilary ze szkła glinokrzemianowego	Sutter Instruments, Novato, CA, Stany Zjednoczone	AF100-64-10	do wykonania elektrod
Szkiełka mikroskopowe Superfrost	Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensylwania, Stany Zjednoczone	12-550-143	Do stacji fly-prep
Trwała taśma dwustronna	Szkocka St. Paul, MN, Stany Zjednoczone	nie	Do stacji fly-prep
Mikroskop pionowy	Olympus, Shinjuku, Tokio, Japonia	Zobacz materiał BX51	do sprzętu do nagrywania
Plastelina modelinowa Plastalina	Van Aken, North Charleston, Karolina Południowa, Stany Zjednoczone	B0019QZMQQ	do stacji przygotowawczej i do stabilizacji pręta mocującego
Sterylny jednorazowy filtr o szybkim przepływie z membraną SFCA, 0,45 mm	Nalgene, Rochester, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy #156-4045	do sterylizacji roztworu AHL
Końcówka do pipety 200 μl	VWR Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone	Nr kat. 53508-810	do produkcji wkładów zapachowych i przygotowania do muchy
Bibuła filtracyjna	Whatman, Maidstone, Kent, Wielka Brytania	740-E	do produkcji wkładów zapachowych
Eksykator próżniowy	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, Stany Zjednoczone	VX-06514-30	do odparowania rozpuszczalnika etanolowego
Kwas cis-palmitynowy	Cayman Chemical, Ann Arbor, Stany Zjednoczone	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Środek zapachowy Or47b
Kwas trans-palmitynowy	Cayman Chemical, Ann Arbor, Stany Zjednoczone	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Środek zapachowy Or47b
etanol	Spectrum Chemical MFG. Nowy Brunszwik, NJ, Stany Zjednoczone	E1028-500MLGL	do rozcieńczania kwasu oleopalmitynowego
Mikromanipulator wkładu zapachowego	Siskiyou, Grants Pass LUB USA	MX130R (Sterownik MX130R	Aby ustawić olfaktometr
Oprogramowanie Flow Vision	Alicat, Tuscon, Stany Zjednoczone	FLOWVISIONSC	oprogramowanie do kontroli natężenia przepływu
Kontroler masy	Alicat, Tuscon, Stany Zjednoczone	MC-2SLPM-D	do sterowania natężeniem przepływu nawilżonego powietrza
Kontroler masy	Alicat, Tuscon, Stany Zjednoczone	MC-500SCCM-D	do kontrolowania natężenia przepływu w celu stymulacji zapachu
Zacisk	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Stany Zjednoczone	Wersja 10.4	Oprogramowanie do akwizycji danych
Rura doprowadzająca powietrze	Ace Glass, Vineland, NJ, Stany Zjednoczone	8802-936	do dostarczania nawilżonego powietrza
Soczewka obiektywowa 50X	Olympus, Shinjuku, Tokio, Japonia	LMPLFL50X	Sprzęt do nagrywania
Dopasowanie zacisku 10	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Stany Zjednoczone	Wersja 10.4	oprogramowanie do analizy spajków
Igor Pro 6	WaveMetrics, jezioro Oswego OR Stany Zjednoczone	Wersja 6.37	oprogramowanie do analizy danych
Monitor dźwięku	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	NPIEXB-AUDIS-08B	Słuchowo zgłasza pojedyncze skoki
Wzmacniacz zewnątrzkomórkowy	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	NPIEXT-02F	w celu zwiększenia amplitudy sygnałów elektrycznych
Sterownik zaworu	Instrumenty Warnera	VC-8	do sterowania otwieraniem zaworu w celu stymulacji zapachu
Mikromanipulator elektrody rejestrującej	Sutter Instruments, Novato, CA, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał MP-285	do pozycjonowania elektrody rejestrującej
Wzmacniacz czołowy	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	Korektor EQ-16.0008	w celu zwiększenia amplitudy sygnałów elektrycznych
Oscyloskop	Tektronix, Beaverton OR Stany Zjednoczone	TDS2000C	Wizualny raport poszczególnych skoków

)