Stymulacja korzeni nerwów słuchowych i nagrania prądu postsynaptycznego w klinie mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Fischl, M. J., et al. In Vitro Wedge Slice Preparation for Immicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp.(2020)

Ten film demonstruje protokół stymulacji korzenia nerwu słuchowego i rejestrowania prądów postsynaptycznych w przyśrodkowych neuronach olivocochlear w wycinkach klina mózgu myszy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Konfiguracja i rejestracja elektrofizjologii

1. Umieść plasterek klinowy w komorze nagrywającej i zabezpiecz plasterek harfą lub systemem stabilizującym. Perfaktorować tkankę w sposób ciągły z szybkością 7-10 ml/min ciepłym (35 °C) ACSF z bąbelkami karbogenu.
2. Zidentyfikuj genetycznie znakowane przyśrodkowe neurony MOC olivocochlear w jądrze brzusznym ciała trapezoidalnego VNTB za pomocą epifluorescencji z filtrami emisyjnymi 561 nm do nagrań typu patch-clamp. Odwróć plasterek, jeśli nie ma komórek, które można potencjalnie załatać.
3. Korzystając z optyki DIC, skup się na korzeniu nerwu słuchowego na grubej stronie plastra i użyj mikromanipulatora, aby przesunąć bipolarną elektrodę stymulującą wolfram w dół do korzenia nerwu słuchowego i delikatnie w powierzchnię tkanki.
   nuta: Elektrody ssące były używane w eksperymentach stymulacji nerwów słuchowych w innych laboratoriach. Elektrody ze szkła Theta lub metody stymulacji optycznej mogą być stosowane, jeśli ma to zastosowanie do innych specyficznych preparatów.
4. Przesuń pole widzenia z powrotem do VNTB, aby wybrać neuron MOC, który ma być celem elektrofizjologii klamry krosowej.
5. Napełnij pipetę rejestrującą odpowiednim roztworem wewnętrznym dla proponowanego eksperymentu.
6. Łatka i zapis z neuronu MOC w konfiguracji całej komórki. W razie potrzeby skompensuj pojemność membrany i rezystancję szeregową.
7. Dostosuj amplitudę stymulacji elektrycznej korzenia nerwu słuchowego, aby uzyskać spójne zdarzenia postsynaptyczne w neuronie MOC.
   nuta: Może być konieczne przesunięcie elektrody stymulacyjnej.
8. Uruchom odpowiednie protokoły stymulacji, aby obserwować wywołane prądy synaptyczne w MOC (cęgi napięciowe).
   nuta: Preparat do cięcia klinów może być używany z dowolnymi typowymi narzędziami do zaciskania plastrów, takimi jak luźne zapisy plastrów, farmakologia, optogenetyka, obrazowanie wapnia, odblokowywanie neuroprzekaźników itp.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pionowy mikroskop konfokalny A1R	Instrumenty firmy Nikon		Mikroskop elektrofizjologiczny i obrazowy, może to być dowolny mikroskop zgodny z elektrofizjologią
Elektroda ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem o średnicy zewnętrznej 1,5 mm, średnica wewnętrzna 1,1 mm, długość 10 cm	Instrument Suttera	Zobacz materiał BF150-110-10 Zobacz materiał BF150-110	Szkło do pipet z mocowaniem punktowym
Wypełniacz elektrod MicroFil	Wskaźnik WPI	Zobacz materiał CMF20G	Napełniacz do pipet z elektrodą krosową
Podgrzewacz roztworu w linii	Warner Instruments (GSAdvantage)	Zobacz materiał SH-27B	Grzałka systemu perfuzyjnego Slice
Systemy wielomikromanipulacyjne	Instrumenty Suttera	MPC-200 z MP285	Mikromanipulatory do umieszczania elektrod krosowych i elektrod stymulacyjnych
Ściągacz do pipet poziomych P-1000 do mikropipet szklanych	Instrumenty Sutter	FG-P1000	Ściągacz do pipet z zaciskiem krosowym
Wzmacniacz patch-clamp i oprogramowanie	HEKA powiedział:	EPC-10 / Patchmaster Następny	Może to być dowolny wzmacniacz / oprogramowanie
Komora nagraniowa	Instrumenty Warnera	Kontroler RC26G	Plastr "kąpiel" podczas nagrywania
Harfa komorowa nagraniowa	Instrumenty Warnera	640253	Stabilizuje przekrój podczas rejestracji elektrofizjologicznej
Komora inkubacyjna Slice	Budowa niestandardowa		Podgrzewana, natleniona komora przetrzymywania plastrów podczas rekonwalescencji po krojeniu
Jednostka izolacji bodźców	A.M.P.I.	Iso-Flex (Izo-Elastyczny	Jednostka izolacji bodźców do elektrofizjologii
Strzykawka 60CC	Fischer Scientific (centra handlowe)	Numer katalogowy: 14-820-11	Elektrofizjologia obchodzenie się z płynem perfuzyjnym
Regulator temperatury	Warner Instruments (GSAdvantage)	TC-324C	Regulator temperatury systemu perfuzji Slice
Rurka 1/8 OD 1/16 ID	Fischer Scientific (centra handlowe)	14-171-129	Elektrofizjologia obchodzenie się z płynem perfuzyjnym
Koncentryczna mikroelektroda bipolarna szarpnięta	Wskaźnik WPI	TM33CCINS	Elektroda stymulująca do elektrofizjologii

)