Artykuł metodologiczny

Rejestrowanie odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 w wycinku hipokampa szczura

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Shetty, M. S. et al., Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni.J. Vis. Exp. (2015).

Ten film demonstruje metodę rejestrowania odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 w wycinku hipokampa szczura. Przedstawiono w nim kroki związane z umieszczeniem elektrod stymulujących i rejestrujących na wycinku hipokampa oraz pomiarem pobudzającego potencjału postsynaptycznego pola (fEPSP) w celu oceny siły odpowiedzi synaptycznej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Rejestracja odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1

UWAGA: Konfiguracja elektrofizjologiczna używana do rejestracji potencjału pola jest pokazana na rysunku 1A. Klatka Faradaya jest zdecydowanie zalecana, jeśli zakłócenia elektryczne są poza kontrolą po prawidłowym uziemieniu ustawień elektrycznych. Na rynku dostępnych jest wiele różnych typów komór zanurzeniowych i międzywystrojowych. Jednak komory interfejsu są preferowane, ponieważ plastry wykazują w nich silniejsze odpowiedzi synaptyczne.

  1. Umiejscowienie elektrod
    1. Włącz aparaturę elektryczną (stymulatory i wzmacniacze), która ma być używana. Zamontuj i zabezpiecz elektrody stymulujące i rejestrujące w uchwytach z pleksi mikromanipulatorów.
      nuta: Używamy monopolarnych, lakierowanych, nierdzewnych elektrod o rezystancji 5 MΩ zarówno do celów stymulacyjnych, jak i rejestrujących.
    2. Przed użyciem włóż te elektrody do wyciągniętych szklanych kapilar i zabezpiecz klejem epoksydowym, odsłaniając tylko niewielką część końcówki elektrody (rysunek 1E). Daje to wytrzymałość skądinąd smukłym elektrodom i pomaga je mocno zamocować w uchwytach elektrod.
    3. Prowadzony pod mikroskopem, umieść elektrodę (elektrody) stymulujące w warstwie promieniowej obszaru CA1, aby stymulować włókna poboczne Schaffera, a elektrodę rejestrującą w wierzchołkowym obszarze dendrytycznym CA1, aby zarejestrować odpowiedzi field-EPSP (fEPSP).
      nuta: Zbliżenie się elektrodami do powierzchni cieczy nad plasterkiem daje dźwięk, który pomaga szybko zlokalizować powierzchnię plastra (pod warunkiem, że amplifier jest podłączony do głośnika).
    4. W eksperymentach z tagowaniem i wychwytywaniem synaptycznym, w zależności od potrzeby eksperymentu, umieść dwie lub trzy elektrody stymulujące (S1, S2 lub S3) po obu stronach elektrody rejestrującej, aby stymulować dwa lub więcej niezależnych, ale nakładających się na siebie wejść. Umieść elektrody stymulujące i rejestrujące w odległości około 200 μm od siebie.
    5. W razie potrzeby zlokalizuj kolejną elektrodę rejestrującą w warstwie piramidalnej w celu zarejestrowania skoku populacji (rysunek 2A). Gdy obie elektrody dotkną wycinka, za pomocą oprogramowania do akwizycji, wykonaj stymulację testową, aby zapewnić prawidłowy sygnał fEPSP.
      nuta: Do stymulacji testowej wykorzystujemy dwufazowe, stałoprądowe impulsy (czas trwania impulsu 0,1 ms/półfalę).
    6. Po uzyskaniu odpowiedniego sygnału fEPSP ostrożnie opuść elektrody na głębokość około 200 μm za pomocą precyzyjnych pokręteł ruchowych manipulatorów. Odczekaj 20 minut, aż plastry się zregenerują.
  2. Relacja wejścia-wyjścia
    1. Określ zależność wejść-wyjść (stymulacja aferentna vs nachylenie fEPSP) dla każdego wejścia, mierząc wartość nachylenia w zakresie natężeń prądu. Wykonaj to w zakresie od 20 μA do 100 μA. Następnie ustaw intensywność stymulacji dla każdego wejścia, aby uzyskać 40% maksymalnego nachylenia fEPSP. Utrzymuj tę wartość na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu.
    2. Po 15-20 minutach rozpocznij nagrywanie linii bazowej. W tym okresie należy uważnie monitorować nachylenie fEPSP i zresetować intensywność bodźca, jeśli nachylenie waha się o więcej niż 10% od ustawionej wartości i rozpocząć nową linię bazową. Przed kontynuowaniem zapisz co najmniej 30 minut lub 1 godzinę stabilnej linii bazowej.
      nuta: Do testu lub stymulacji bazowej używamy czterech przemiatania dwufazowych, stałych impulsów prądu 0,2 Hz (0,1 ms na polaryzację) podawanych co 5 minut. Średnie nachylenie tych czterech odpowiedzi jest następnie traktowane jako jedno powtórzenie. Sygnały są filtrowane i wzmacniane przez wzmacniacz różnicowy, digitalizowane za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego i monitorowane online za pomocą specjalnie przygotowanego oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1.Zestaw elektrofizjologiczny do zapisów potencjału pola składający się z: (A) stymulatorów, (b) wzmacniacza różnicowego, (c) przetwornika analogowo-cyfrowego, (d) oscyloskopu, (e) komputera z oprogramowaniem do akwizycji, (f) odpornego na wibracje blatu stołowego, (g) mikroskopu z powiększeniem >4x, (h) interfejsu komory mózgowo-warstwowej, (i) systemu perfuzyjnego do za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
I. Substancje chemiczne wchodzące w skład ACSF
1. Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichZobacz materiał S5886
2. Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichZobacz materiał P9541
3. Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4,7H20)Sigma-AldrichZobacz materiał M1880
4. Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2,2H2O)Sigma-AldrichZobacz materiał C3881
5. Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichZobacz materiał P9791
6. Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichZobacz materiał S5761
7. D-glukoza bezwodna (C6H12O6)Sigma-AldrichKontroler G7021
II. Instrumenty do elektrofizjologii
1. MikroskopOlympus, Japoniamodelu SZ61
2. Regulator temperaturyScientific Systems Design Inc. KanadaZobacz materiał PTC03
3. Różnicowy wzmacniacz prądu przemiennegoAM Systems, Stany Zjednoczonenr wzoru 1700
4. Izolowany stymulator impulsówAM Systems, Stany Zjednoczonenr wzoru 2100
5. OscyloskopRhode & SchwarzZobacz materiał HM0722
6. Przetwornik cyfrowo-analogowyCambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, Wielka BrytaniaCED-Moc 1401-3
7. Interfejs Komora Brain SliceScientific Systems Design Inc. KanadaZobacz materiał BSC01
8. Pompa rurowaIsmatec, Idex Health & Science, NiemcyREGLO-Analogowy
9. Przepływomierz karbogenicznyCole'a-ParmeraNumer katalogowy: 03220-44
10. Iluminator światła światłowodowegoDolan-Jenner IndustriesŚwiatłowód Lite MI-150
11. MikromanipulatoryMarzhauser Wetzlar, Niemcy00-42-101-0000 (MM-33)
00-42-102-0000 (MM-32)
12. ElektrodyAM Systems, Stany Zjednoczone571000 (Stal nierdzewna; 0.010, 5MΩ, 8 stopni)
powiedział: powiedział: powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Polowy EPSPuk ad elektrofizjologicznyelektrody stymuluj ceelektrody rejestruj cew kna kolaterali Schafferazale no wej cie wyj ciepotencja y populacyjneznakowanie synaptyczne

Powiązane artykuły