Wykrywanie reakcji fizjologicznych neuronów czuciowych u Drosophila

1. Przygotowanie próbki

1. Przekrocz linię kierowcy Gal4 do UAS-GCaMP5G Muchy Drosophila melanogaster (w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Pozwól krzyżowi rosnąć w temperaturze 25 °C.
   nuta: Generowanie much z wieloma kopiami transgenów Gal4 lub UAS-GCaMP może pomóc w zwiększeniu intensywności sygnału fluorescencyjnego. Wcześniejsza wersja transgenu UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) wykazywała bardzo słabą intensywność fluorescencji, gdy była eksprymowana pod kontrolą sterownika Gr68a-Gal4.
   1. Zebrać i oddzielić według płci nowo zamknięte dorosłe muchy i wyhodować w temperaturze 25 °C.
      UWAGA: Wyjściowy poziom fluorescencji GCaMP5G jest optymalny u much w wieku od 14 do 28 dni. Izolowanie much według płci wyklucza możliwość interakcji społecznych, które mogą wpływać na reakcje neuronalne.
2. Znieczulić muchę pod łagodnym strumieniem CO₂ .
3. Przymocuj rozporek do szklanego szkiełka nakrywkowego, najpierw umieszczając małą kroplę lakieru do paznokci na środku szkiełka nakrywkowego o średnicy 0,17 mm. Delikatnie połóż muchę na boku na kropli przezroczystego lakieru do paznokci i upewnij się, że mucha zakrywa całą kroplę.
4. Wykonaj kroki 1.5 i 1.6 pod mikroskopem stereoskopowym używanym przy 8-krotnym powiększeniu.
5. Użyj mokrego pędzla, aby przedłużyć przednią nogę muchy. Zabezpiecz przednią nogę na miejscu, umieszczając dwa cienkie paski taśmy na pierwszym i piątym segmencie stępu (ryc. 1A). Spowoduje to odsłonięcie segmentów stępu T2-T4 do obrazowania (ryc. 1B).
6. Aby zobrazować neurony na trąbce, umieść cienki pasek taśmy na mównicy trąbki, aby odsłonić labellum (ryc. 1C, D).
7. Narysuj hydrofobową barierę wokół muchy za pomocą pisaka PAP (peroksydaza-antyperoksydaza), aby zapobiec przepływaniu roztworu po powierzchni szkiełka nakrywkowego. Zmierz w ciągu 30 minut od montażu.

2. Przygotowanie roztworu stymulującego

1. Rozcieńczyć ligandy lipofilowe (takie jak CH_{50 3}, użyte w tym badaniu) w roztworze PBST (sól fizjologiczna buforowana fosforanem z Tritonem X-100): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 0,1% Triton X-100 (v/v); pH 7,4.
   1. Przygotować roztwór podstawowy liganda o stężeniu 1 mg/ml przy użyciu PBST. Przygotować wszystkie kolejne rozcieńczenia roztworu podstawowego za pomocą PBST.
      nuta: W zależności od rozpuszczalności interesującego liganda, do jego rozpuszczenia mogą być potrzebne różne rozpuszczalniki. Tabela 1 opisuje rozpuszczalność CH₅0₃ w różnych rozpuszczalnikach. W przeciwieństwie do innych rozpuszczalników, PBST nie zwiększał fluorescencji.

3. Stymulacja neuronów smakowych i akwizycja obrazu

1. Za pomocą pipetora o pojemności 10 μl umieścić 10 μl PBST na segmentach stępu.
   nuta: Ten krok nawilża nogę i zapobiega dryfowaniu segmentów stępu.
2. Użyj układu optycznego, który jest wyposażony w kamerę o wystarczającej szybkości i czułości, aby uzyskać dobry sygnał fluorescencji w wysokiej rozdzielczości czasowej.
   nuta: Do tego badania użyliśmy mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i kamery sCMOS (patrz Lista materiałów).
3. Wybierz konkretny segment stępu i neurony, które mają być zobrazowane. Zdobądź trzy konfokalne stosy Z przed stymulacją.
   1. Najlepiej używać ustawień akwizycji, które są wystarczająco szybkie, aby umożliwić maksymalną rozdzielczość czasową przy jednoczesnym przechwytywaniu całej objętości komórki. Przykładowe ustawienia akwizycji to: ekspozycja 200 ms, grupowanie 2 x 2 i 6 x 0,5 μm2 sekcji optycznych, rejestrowane co 2 sek.
      UWAGA: Unieruchomione nogi były z powodzeniem obrazowane przez okres do 10 minut, w odstępach 30 sekund, bez zauważalnego wybielenia sygnału GCaMP. W przypadku dłuższych czasów nagrywania upewnij się, że nogi są bardzo mocno przytwierdzone do szkiełka nakrywkowego.
   2. Zoptymalizuj moc lasera, aby uzyskać najwyższy możliwy do osiągnięcia stosunek sygnału do szumu przy minimalnym fotowybielaniu podczas całego reżimu obrazowania. Do opisanych tutaj eksperymentów użyj lasera diodowego o długości fali 491 nm (100 mW) przy 30% transmisji, aby zobrazować zarówno neurony smakowe Gr68a, jak i ppk23 na nogach i trąbce. Użyj binningu 2 x 2, aby umożliwić krótsze czasy naświetlania przy jednoczesnym osiągnięciu wystarczającej rozdzielczości przestrzennej.
      nuta: Ustawienia mocy lasera zostały zoptymalizowane pod kątem wykrywania zmian fluorescencji w zakresie od 1,2 do 4,5-krotnego wzrostu.
4. Pobrać pipetą 10 μl roztworu stymulującego na segmenty stępu. Dodaj kolejne 10 μl PBST do eksperymentów kontrolnych. Natychmiast uzyskaj 117 obrazów po stymulacji.
   nuta: Liczba uzyskanych obrazów po stymulacji opiera się na czasie potrzebnym do osiągnięcia maksymalnej zmiany fluorescencji (około 2 min).
   1. ETAP KRYTYCZNY: Podczas pipetowania roztworu na preparat nie należy dotykać rozporka końcówką pipety, ponieważ spowoduje to przesunięcie przedniej nogi z pozycji.
      nuta: Alternatywnie użyj mikromanipulatora, aby dokładnie ustawić szklaną kapilarnę zawierającą bodziec w pobliżu segmentu stępu, który ma być zobrazowany. Dostarczyć kontrolowane objętości bodźca za pomocą wewnątrzkomórkowego dozownika do mikroiniekcji zgodnie z instrukcjami producenta.

Rycina 1: Montaż żywej muchy w celu zobrazowania neuronów kończyny przedniej lub trąbki. (A) Montaż przedniej nogi: 3,2-krotny obraz żywego samca muchy, pokazujący przednie kończyny przymocowane do szkiełka nakrywkowego taśmą. (B) 40-krotny obraz muchy pokazuje każdy z segmentów stępu (T1-5) oraz umieszczenie taśmy nad pierwszym segmentem stępu i na piątym segmencie stępu. (C) Montaż trąbki: kawałek taśmy umieszcza się na mównicy, aby odsłonić końcówkę trąbki. (D) Końcówka pipety do dodawania bodźca jest trzymana nieco powyżej muchy i nie styka się bezpośrednio z preparatem.

Tabela 1: Rozpuszczalność CH503 w różnych rozpuszczalnikach. DMSO: Dimetylosulfotlenek. Roztwory etanolu, heksanu i DMSO rozcieńczono dH2O (v/v). Rozpuszczalność CH503 w 0,2% DMSO była ograniczona tylko do 250 ng/ml. Wzrost ΔF/F przy użyciu samego rozpuszczalnika był równoważny wzrostowi obserwowanemu po stymulacji feromonem.