Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Streszczenie

Źródło: Kinnavane, L., et al. Ex Vivo Optogenetyczne Badanie Dalekiego Zasięgu Transmisji Synaptycznej i Plastyczności od Przyśrodkowej Kory Przedczołowej do Bocznej Kory Śródwęchowej. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Elektrofizjologia i stymulacja optogenetyczna

1. Identyfikacja komórki docelowej.
   1. Umieścić plasterek w zanurzonej komorze rejestracyjnej w temperaturze 34 °C ukrwionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) z szybkością 2 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej. Unieruchomić plasterek za pomocą kotwicy do cięcia.
   2. Pod obiektywem o małym powiększeniu (4x) mikroskopu szerokokątnego wykorzystującego ukośne oświetlenie w podczerwieni przejdź do warstwy 5 bocznej kory śródwęchowej (LEC). Zmierz odległość od powierzchni powierzchni do wymaganej warstwy.
      nuta: Ukośne oświetlenie w podczerwieni uzyskano poprzez umieszczenie diody LED bliskiej podczerwieni około 3 mm poniżej szkiełka nakrywkowego komory nagraniowej pod kątem ~55° do płaszczyzny szkiełka nakrywkowego (rysunek 1B). Różnicowy kontrast interferencyjny jest alternatywną i powszechnie stosowaną techniką obrazowania w elektrofizjologii warstw.
   3. Zmień na obiektyw do zanurzenia w wodzie o dużym powiększeniu (40x) i zidentyfikuj neurony piramidowe. Zaznacz położenie komórki na monitorze komputera za pomocą taśmy.
      nuta: Neurony piramidalne mają z grubsza trójkątną morfologię z wydatnymi dendrytami wierzchołkowymi wystającymi w kierunku powierzchni wycinka (ryc. 2A). Zdrowie komórek można ocenić na podstawie braku skondensowanego, widocznego jądra i kontroli błony plazmatycznej, która powinna wydawać się gładka. Jest mało prawdopodobne, że wyraźne znakowanie fluorescencyjne aksonów przez białko fuzyjne opsyny i fluoroforu będzie widoczne przy użyciu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego. Aby uwidocznić projekcje aksonalne, należy przeprowadzić immunohistochemię post hoc przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko fluoroforowi opsyny i amplifikować przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem o tej samej lub podobnej długości fali.
2. Tworzenie klamry krosowej dla całej komórki.​
   1. Wykonać mikropipetę ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do pipet i napełnić ją przefiltrowanym wewnątrzkomórkowym roztworem rejestrującym (120 mM k-glukonianu, 40 mM HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy), 10 mM KCl (chlorek potasu), 2 mM NaCl (chlorek sodu), 2 mM MgATP (trifosforan adenozyny magnezu), 1 mM MgCl (chlorek magnezu), 0,3 mM NaGTP (trifosforan guanozyny sodu), 0,2 mM EGTA (kwas tetraoctowy glikolu etylenowego), oraz 0,25% biocytyny wytwarzanej w wodzie ultraczystej o pH 7,25, 285-300 mOsm). Umieść napełnioną mikropipetę w uchwycie elektrody na patch-clamp amplifier headstage, upewniając się, że drut elektrody styka się z roztworem wewnątrzkomórkowym.
   2. Zastosować nadciśnienie doustnie, mocno w ustnik (taki jak strzykawka o pojemności 1 ml z usuniętym tłokiem) podłączonej rurką do bocznego portu uchwytu elektrody i utrzymuj ciśnienie, zamykając wbudowany zawór trójdrogowy. Podnieś obiektyw mikroskopu tak, aby utworzyła się menisk i włóż elektrodę do menisku, aż będzie widoczny pod mikroskopem.
   3. Otwórz okno Seal Test (Test uszczelnienia) w programie WinLTP16 (lub innym oprogramowaniu do akwizycji/oscyloskopie) i gdy wzmacniacz znajduje się w trybie cęgów napięcia, zastosuj impuls kwadratowy o napięciu 5 mV, aby określić, czy rezystancja pipety wynosi 3-6 MΩ.
   4. Zbliżyć się do zidentyfikowanej komórki i dotknąć jej końcówką pipety, co powinno spowodować wgłębienie w błonie komórkowej (rysunek 2A; prawy panel) i niewielki wzrost oporu pipety (0,1 MΩ).
   5. Zwolnij nadciśnienie i zastosuj podciśnienie, stosując umiarkowane ssanie ustnika; powinno to spowodować znaczny wzrost oporu pipety (>1000 MΩ). Ciśnienie można teraz pozostawić neutralne. Zastosuj podciśnienie w stopniowo rosnącej rampie, aż do pęknięcia błony komórkowej, co spowoduje stany przejściowe pojemności całej komórki.
3. Rejestruj optogenetycznie wywołane zdarzenia synaptyczne.
   1. Wprowadź konfigurację cęgów prądowych.
      UWAGA: W większości przypadków transmisja synaptyczna dalekiego zasięgu jest glutaminergiczne, dlatego zapis przy potencjałach błonowych zbliżonych do potencjału odwrócenia chlorków najlepiej wyizoluje transmisję za pośrednictwem receptora AMPA (AMPAR) i zminimalizuje pomiar wywołanego hamowania sprzężenia zwrotnego (FFI). Odwrócenie chlorków zależy od składu wewnątrzkomórkowego roztworu zapisującego i aCSF i można je obliczyć za pomocą równania Goldmana-Hodgkina-Katza; dla powyższych rozwiązań było to -61,3 mV. Neurony piramidowe warstwy 5 LEC miały średni spoczynkowy potencjał błonowy wynoszący -62 mV i, w razie potrzeby, były utrzymywane na tym poziomie przez wstrzyknięcie stałego prądu. Alternatywnie, ogniwa mogą być napięte do pożądanego potencjału. Do rejestrowania dalekosiężnych projekcji hamujących16 lub do rejestrowania FFI, zacisk napięcia przy potencjale odwrócenia kationów w celu wyizolowania przewodnictwa chlorku GABA-ergicznego. Gdy neurony zaciskają napięcie przy potencjałach błonowych powyżej progu potencjału czynnościowego, stosuje się wewnątrzkomórkowy roztwór na bazie cezu zawierający bramkowane napięciem blokery kanałów sodowych w celu poprawy zacisku napięcia i zapobieżenia inicjacji potencjałów czynnościowych (130 mM CsMeSO4 (metanosulfonian cezu), 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM chlorek QX 314, 4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% biocytyny wytwarzanej w UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
   2. Korzystając z oprogramowania do akwizycji danych, wyślij sygnały logiki tranzystor-tranzystor (TTL) do sterownika LED (diody elektroluminescencji), aby aktywować zamontowaną diodę LED 470 nm. Zamontowana dioda LED jest kierowana na ścieżkę światła mikroskopu za pomocą kostek filtrujących i odpowiedniego układu optycznego (rysunek 1B) w celu przyłożenia impulsów świetlnych do warstwy za pomocą obiektywu 40x w celu wywołania optogenetycznych pobudzających potencjałów postsynaptycznych (oEPSPs).
      nuta: Impulsy świetlne mogą być stosowane perysomatycznie / nad dendrytami, co spowoduje aktywację opsyn w aksonach i bulionie presynaptycznym lub badacz może przesunąć cel na aksony z dala od zarejestrowanej komórki, aby uniknąć nadmiernej stymulacji. Maksymalna amplituda oEPSP zależy od siły projekcji synaptycznej, skuteczności zastrzyków wirusowych i zastosowanej opsyny. oEPSP można miareczkować do pożądanej amplitudy poprzez zmianę natężenia i/lub czasu trwania światła18; zmiana czasu trwania impulsów świetlnych (typowy czas trwania od 0,2 do 5 ms przy maksymalnej mocy wyjściowej diody LED, co daje gęstość światła 4,4 mW/mm19) daje bardziej spójne amplitudy oEPSP niż zmiana mocy wyjściowej diody LED.
   3. Zbadaj właściwości uwalniania presynaptycznego (zmiana napięcia) poprzez dostarczanie ciągów wielu impulsów świetlnych o różnych odstępach między bodźcami (ryc. 2E); należy zachować ostrożność podczas interpretacji transmisji wywołanej optogenetycznie.
   4. Zbadaj długoterminową plastyczność poprzez powtarzalne wywoływanie oEPSPs19 lub stosowanie ligandów. Monitoruj amplitudę oEPSP przez 5-10 minut, aby zapewnić stabilność przed indukcją plastyczności, a następnie monitoruj, aż do osiągnięcia stabilnej amplitudy (zwykle 30-40 min).
      nuta: Większość obecnych opsyn nie jest w stanie niezawodnie wywołać wielu potencjałów czynnościowych przy wysokich częstotliwościach, np. 100 bodźców dostarczanych przy 100 Hz, jak to jest zwykle używane do indukowania LTP.
   5. Aby potwierdzić, że oEPSP są monosynaptyczne, należy przeprowadzić nadmierną aktywację transdukowanego szlaku, umieszczając obiektyw nad trzpieniem dendrytycznym i stymulując w obecności 0,5 μM tetrodotoksyny i 100 μM aminopirydyny. Zastosowanie tetrodotoksyny zniesie transmisję, jeśli odpowiedzi są zależne od potencjału czynnościowego, a późniejsze włączenie aminopirydyny częściowo przywróci transmisję, jeśli oEPSP są generowane monosynaptycznie19,20.
   6. Aby biocytyna mogła wypełnić neuron, odczekaj co najmniej 15 minut po wejściu w konfigurację całej komórki. W zacisku napięciowym monitoruj pojemność membrany i rezystancję wejściową.
   7. Powoli wyjmij pipetę wzdłuż kąta natarcia z dala od somy komórki, obserwując powolny zanik stanów przejściowych pojemności i prądu membranowego, co wskazuje na ponowne uszczelnienie błony komórkowej i utworzenie łaty na zewnątrz na końcówce pipety. Zwróć uwagę na orientację wycinka i położenie komórek w wycinku. Umieścić plaster w PFA (paraformaldehydzie) na 24-dołkowej płytce, inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przenieść do 0,1 M PB.
      nuta: Plastry można przechowywać do tygodnia. Jeśli wymagane jest dłuższe przechowywanie, należy regularnie zmieniać PB (bufor fosforanowy) lub używać PB zawierającego azydek sodu (0,02%-0,2% azydku sodu).

Wyniki

Ryc. 1: Komora zbiorcza Slice i konfiguracja optyczna do wizualizacji zapisów całych komórek, wzbudzenia optogenetycznego i identyfikacji neuronów tdTomato-dodatnich. (A) Komora do zbierania plastrów14 jest wykonana na zamówienie ze stojaka na probówki mikrowirówkowe przyklejonego do arkusza nylonowej siatki i umieszczonego w zlewce, w której jest zanurzony w aCSF (B

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-drogowy zawór luer	Cole'a-Parmera	WZ-30600-02
Obiektyw 40x	Olympus	LUMPLFLN40XW
4-aminopirydyna	Witaj Bio	Zobacz materiał HB1073
4x obiektyw	Olympus	4X/0,1 zł
Soczewka achromatyczna	Edmund Optyka	Numer telefonu 49363	Skupia się na widmie widzialnym i bliskiej podczerwieni
Mikrowirówka stołowa	Benchmark naukowy	Zobacz materiał C1005*
Biocytyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał B4261
Kapilara ze szkła borokrzemianowego	Instrumenty Warnera	G150F-6
CaCl2	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C5670
Aparat fotograficzny - Qimaging Retiga Electro	Fotometria	01-ELEKTRO-M-14-C
Karbachol	Tocris powiedział:	2810
Peeling chirurgiczny z chlorheksydyną	Vetasept	Zobacz materiał XHG008
Clippers	Andis powiedział:	Numer katalogowy: 22445	AGC Super 2-biegowa odłączana maszynka do strzyżenia ostrzy
Soczewka kondensatora kolimacyjnego	ThorLabs powiedział:	ACL2520-A
Szkiełka nakrywkowe	Fisher Scientific Sp. z o.o	10011913
Kriostat	Księga Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C1426
Klej cyjanoakrylowy	Rapid Electronics Sp. z o.o	Numer katalogowy: 84-4557
Urządzenie do akwizycji danych	Instrumenty krajowe	Złącze USB-6341 BNC
D-glukoza	Sigma-Aldrich	Kontroler G8270
Lustro dichroiczne 500 nm długoprzepustowe	Edmund Optyka	Numer katalogowy: 69899
Lustro dichroiczne 600 nm długoprzepustowe	Edmund Optyka	Numer katalogowy: 69901
Dichroiczny sześcian lustrzany	ThorLabs powiedział:	CM1-DCH/M
EGTA (EGTA)	Młyn	324626
Uchwyt elektrody z portem bocznym	HEKA powiedział:	Numer katalogowy: 895150
Filtr emisji spalin	Chroma	59022m
Filtr wzbudzenia	Chroma	ET570/20x
Żel pod oczy	Dechra (Głuch)	Lubrithal
Drobny pędzel	Zaopatrzenie laboratoriów naukowych	BRU2052
gilotyna	Światowe instrumenty precyzyjne	Protokół DCAP (DCAP
HEPESY	Sigma-Aldrich	H3375
Roztwór nadtlenku wodoru	Sigma-Aldrich	H1009	30% (w/w)
Izofluran	Henryk Schein	Numer katalogowy: 988-3245
Izopentan	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M32631
Kcl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3911
K-glukonian	Sigma-Aldrich	Klasa G4500
Kostka filtra fluorescencyjnego kinematycznego	ThorLabs powiedział:	Zobacz materiał DFM1T1
Sterownik LED	ThorLabs powiedział:	Dioda LEDD1B
MgATP (MgATP)	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M7506
Ściągacz do mikroelektrod	Instrumenty Sutter	P-87 (samolot P-87
Strzykawka do mikroiniekcji	Hamilton	7634-01/00
Igła do mikroiniekcji strzykawki	Hamilton	7803-05	Specyfikacja niestandardowa: rozstaw 33, długość 15 mm, styl punktu 4 - 12 °
Pompa strzykawkowa do mikroiniekcji	Światowe instrumenty precyzyjne	Zobacz materiał UMP3T-1
Zamontowana niebieska dioda LED	ThorLabs powiedział:	Zobacz materiał M470L5
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S9390
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy S9888
NaGTP (Protokół NaGTP)	Sigma-Aldrich	Telefon komórkowy G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S5761
Dioda NIR	Firma OSRAM	SFH4550	Inną powszechnie stosowaną metodą, używaną do załamywania w podczerwieni warstw, jest optyka z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC)
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P6148
Wzmacniacz z zaciskiem krosowym	Urządzenia molekularne	Zobacz materiał 700A
Pompa perystaltyczna	Światowe instrumenty precyzyjne	Gwiazda Ministar
Szkiełka mikroskopowe pokryte poli-L-lizyną	Fisher Scientific Sp. z o.o	23-769-310
Komora nagraniowa	Instrumenty Warnera	RC-26G
Kotwica plasterka	Instrumenty Warnera	SHD-26-GH/15
Stereotaktyczny uchwyt do mikrowiertarki	Aparatura Harvarda	75-1874
sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389
Mikroskop chirurgiczny	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Filtr strzykawkowy do roztworu do zapisu wewnątrzkomórkowego	Thermo Scientific Nalgene	Numer katalogowy: 171-0020
Pionowy mikroskop fluorescencyjny	Księga Leica	DM6 B
rozwiązanie
Płyn CSF
Roztwór do cięcia sacharozy
PFA (Biuro Ochrony Środowiska