Ładowanie i rozładowywanie barwnika FM za pośrednictwem mikroelektrod w komórkach nerwowych larw Drosophila

Streszczenie

Źródło: Kopke, D. L., et al., FM cykl barwnika w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie włókna nerwowe larw Drosophila są zanurzone w barwniku FM, który wiąże się z lipidami błony komórkowej. Mikroelektroda ssąca i impulsy elektryczne stymulują proces endocytozy, wprowadzając barwnik FM do nowo powstałych pęcherzyków endocytarnych. Ta metoda, która wizualizuje presynaptyczne etapy neuroprzekaźnictwa, jest przydatna do badania funkcji synaptycznych i uwalniania neuroprzekaźników.

Protokół

1. Rozwarstwienie kleju larwalnego

1. Dokładnie wymieszaj 10 części bazy z elastomeru silikonowego z 1 częścią utwardzacza z elastomeru silikonowego z zestawu elastomerów.
2. Szkiełka nakrywkowe ze szkła o wymiarach 22 x 22 mm pokryć elastomerem i utwardzić na gorącej płycie w temperaturze 75 °C przez kilka godzin (do momentu, gdy przestaną być lepkie w dotyku).
3. Umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe pokryte elastomerem w wykonanej na zamówienie komorze preparacyjnej ze szkła pleksi w celu rozwarstwienia larw.
4. Przygotuj pipety kleju z kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą standardowego ściągacza do mikroelektrod, aby uzyskać pożądany rozmiar stożka i końcówki.
5. Delikatnie oderwij końcówkę mikropipety, a na drugim końcu przymocuj 2 stopy elastycznej rurki z tworzywa sztucznego (średnica wewnętrzna 1/32", średnica wewnętrzna; średnica zewnętrzna 3/32", średnica zewnętrzna; ścianka 1/32"; ze złączką ustną (końcówka pipety P2).
6. Przygotowując się do sekcji larw, napełnij mały pojemnik (0,6 ml nakrętki probówki Eppendorfa) niewielką objętością (~20 μl) kleju.
7. Napełnij komorę solą fizjologiczną (w mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 sacharozą i 5 kwasem 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowym (HEPES) o pH 7,2.
8. Dodać przeciwciało przeciwko peroksydazie chrzanu (HRP) sprzężone z Alexa Fluor 647 (anty-HRP:647; rozcieńczyć 1:10 z 1 mg / ml bulionu) w celu znakowania zakończenia presynaptycznego NMJ podczas sekcji21,22.
9. Za pomocą cienkiego pędzla (rozmiar 2) usuń wędrujący trzeci stopień z fiolki z jedzeniem i umieść go na pokrytym elastomerem szkle nakrywkowym.
10. Napełnij szklaną końcówkę mikropipety niewielką ilością kleju, korzystając z podciśnienia powietrza wytwarzanego przez usta z nasadką (krok 1.5).
11. Ułóż larwę grzbietową do góry za pomocą kleszczy i przyklej głowę do szkiełka nakrywkowego pokrytego elastomerem za pomocą małej kropli kleju, używając dodatniego ciśnienia powietrza ustami.
12. Powtórz tę procedurę z tylnym końcem larwy, upewniając się, że zwierzę jest napięte między dwoma nasadkami kleju.
13. Za pomocą nożyczek (ostrza 3 mm) wykonaj poziome cięcie (~ 1 mm) z tyłu i pionowe cięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej.
14. Za pomocą cienkich kleszczy (#4) delikatnie usuń tchawicę grzbietową, jelita, ciało tłuszczowe i inne narządy wewnętrzne pokrywające mięśnie.
15. Powtórz procedurę klejenia dla czterech klap ścian korpusu; delikatnie rozciągnij ścianę korpusu w poziomie i w pionie.
16. Podnieś brzuszny rdzeń nerwowy (VNC) za pomocą kleszczy, ostrożnie przetnij nerwy ruchowe nożyczkami, a następnie całkowicie usuń VNC.
17. Aby zatrzymać cykl SV, zastąp sól fizjologiczną z rozwarstwiania solą fizjologiczną wolną od Ca²⁺ (taką samą jak powyższa sól fizjologiczna bez CaCl₂).

2. Stymulacja elektryczna FM Ładowanie barwnika

1. Przygotuj pipetę ssącą za pomocą ściągacza do mikroelektrod, aby uzyskać wymagany rozmiar stożka i końcówki.
2. Wypoleruj na gorąco końcówkę mikroelektrody za pomocą mikrokuźni, aż pojedynczy nerw ruchowy będzie mógł zostać zaessany przy ciasnym dopasowaniu.
3. Wsuń pipetę ssącą na uchwyt elektrody na mikromanipulatorze i przymocuj ją do długiej, elastycznej plastikowej rurki i strzykawki.
4. Ustaw parametry stymulatora (np. 15 V, częstotliwość 20 Hz, czas trwania 20 ms, czas 5 min lub 1 min.
5. Zastąp sól fizjologiczną wolną od Ca²⁺ w preparacie larwalnym powyższym soli fizjologicznej FM1-43 (4 μM; 1 mM CaCl₂) w urządzeniu do elektrofizjologii.
6. Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym i podnosić stolik, aż larwa i pipeta ssąca zostaną zogniskowane (obiektyw 40X zanurzenie w wodzie).
7. Zassać pętlę przeciętego nerwu ruchowego unerwiającego wybrany półsegment za pomocą podciśnienia powietrza wytwarzanego przez strzykawkę do elektrody ssącej.
8. Przetestuj działanie elektrody ssącej za pomocą krótkiej serii stymulacji, jednocześnie wizualnie monitorując skurcz mięśni w wybranym półsegmencie.
9. Stymuluj nerw ruchowy za pomocą wybranych parametrów (krok 2.4) w celu stymulowania endocytozy SV i wychwytu barwnika FM1-43.
10. Szybko przemyć solą fizjologiczną bez Ca²⁺ (5x przez 1 min), aby całkowicie usunąć roztwór barwnika FM1-43.
11. Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca²⁺ w celu natychmiastowego obrazowania przy użyciu protokołu obrazowania konfokalnego od góry.
12. Zwróć uwagę na obraz NMJ (segment, bok i mięsień), aby zapewnić dostęp do tego samego NMJ po rozładowaniu barwnika FM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SylGard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Fisher Naukowy	NC9644388	Do zakładania szkła nakrywkowego do sekcji
Szklana osłona mikroskopu 22x22-1	Marka rybacka	12-542-B	Zakładanie leku SylGard do sekcji
Aluminiowa górna płyta grzejna typu 2200	Termolyna	HPA2235M	Aby wyleczyć SylGard
Komora preparcyjna ze szkła plexi	N/a	N/a	Ręcznie
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Wskaźnik WPI	Numer katalogowy: 1B100F-4	Do wykonywania mikropipet ssących i klejowych
Laserowy ściągacz do mikropipet	Instrument Suttera	Zobacz materiał P-2000	Do wykonywania mikropipet ssących i klejowych
Rurki laboratoryjne Tygon E-3603	Dostawa komponentów Co.	TET-031A	Do pipety doustnej i ssącej
Końcówka do pipet P2	USA Naukowe	Nr kat. 1111-3700	Do pipety doustnej
Nasadka probówki Eppendorf 0,6 ml	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 05-408-120	Służy do nakładania kleju do preparacji
Obligacja weterynaryjna 3M	Wskaźnik WPI	Obligacja weterynaryjna	Klej używany do rozwarstwiania
Chlorek potasu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał P-217	Forsalina
chlorek sodu	Millipore Sigma	Zobacz materiał S5886	Do soli fizjologicznej
Chlorek magnezu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał M35-500	Do soli fizjologicznej
Chlorek wapnia dwuwodny	Millipore Sigma	Zobacz materiał C7902	Do soli fizjologicznej
sacharoza	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S5-3	Do soli fizjologicznej
HEPESY	Millipore Sigma	H3375	Do soli fizjologicznej
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 123-605-021	Do oznaczania błon neuronalnych
pędzel	Winsor & Newton	94376864793	Aby manipulować larwami
Pęseta Dumont Dumostar #5	Wskaźnik WPI	500233	Używany podczas sekcji
7 cm mikronożyczki McPherson-Vannas (ostrza 3 mm)	Wskaźnik WPI	Numer katalogowy: 14177	Używany podczas sekcji
FM1-43	Fisher Naukowy	Zobacz materiał T35356	Fluorescencyjny barwnik styrylowy
Zegar cyfrowy	Firma VWR	Nr kat. 62344-641	Do pomiaru czasu załadunku/rozładunku barwnika FM
Mikrokuźnia	Wskaźnik WPI	MF200	Do wypalania mikropipet szklanych do polerowania
Końcówka strzykawki 20 ml	Bd	301625	Aby zassać akson do stymulacji elektrycznej.
Mikromanipulator (podstawa magnetyczna)	Narishige powiedział:	Zobacz materiał MMN-9	Do sterowania elektrodą ssącą do stymulacji elektrycznej
Stymulator	trawa	Zobacz materiał S48	Do sterowania diodą LED i stymulacją elektryczną
Mikroskop Zeiss Axioskop	Zeiss		Stosowany podczas elektrostymulacji.
40-krotny obiektyw Achroplan do zanurzenia w wodzie	Zeiss		Stosowany podczas elektrostymulacji i obrazowania konfokalnego
Mikroskop Zeiss Stemi z portem kamery	Zeiss	2000-C	Stosowany podczas stymulacji rodopsyny kanałowej
Sterownik LED T-Cube	ThorLabs powiedział:	Dioda LEDD1B	Do sterowania diodą LED
Zasilacz LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Do zasilania diody LED
Miernik mocy optycznej i energii	ThorLabs powiedział:	Pył zawieszony PM100D	Aby zmierzyć natężenie diody LED