Analiza recyklingu pęcherzyków synaptycznych i wychwytu barwnika fluorescencyjnego przez larwy Drosophila

Streszczenie

Źródło: Kopke, D. L., et al., FM Dye Cycling at the Synapse: Comparison High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje protokół badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila wykazujących ekspresję rodopsyny kanałowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Niebieskie światło aktywuje rodopsyny kanałowe, powodując napływ wapnia i egzocytozę pęcherzyków synaptycznych. Barwnik integruje się z błonami neuronalnymi i jest internalizowany podczas endocytozy, co powoduje zwiększoną fluorescencję. Dalsza stymulacja światłem niebieskim indukuje egzocytozę i uwalnianie barwnika, co objawia się zmniejszoną fluorescencją.

Protokół

1. Rozwarstwienie kleju larwalnego

1. Dokładnie wymieszaj 10 części bazy z elastomeru silikonowego z 1 częścią utwardzacza z elastomeru silikonowego z zestawu elastomerów (tabela materiałów).
2. Szkiełka nakrywkowe ze szkła o wymiarach 22 x 22 mm pokryć elastomerem i utwardzić na gorącej płycie w temperaturze 75 °C przez kilka godzin (do momentu, gdy przestaną być lepkie w dotyku).
3. Umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe pokryte elastomerem w specjalnie wykonanej komorze preparacyjnej z pleksiglasu (Rysunek 1, na dole) w celu przygotowania do rozwarstwienia larw.
4. Przygotuj pipety kleju z kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą standardowego ściągacza do mikroelektrod, aby uzyskać pożądany rozmiar stożka i końcówki.
5. Delikatnie oderwij końcówkę mikropipety, a do drugiego końca przymocuj 2 stopy elastycznej rurki z tworzywa sztucznego (średnica wewnętrzna 1/32", średnica wewnętrzna; średnica zewnętrzna 3/32", średnica zewnętrzna; ścianka 1/32"; Tabela materiałów) z końcówką do ust (końcówka pipety P2).
6. Napełnij mały pojemnik (0,6 ml nakrętki probówki Eppendorfa) niewielką objętością (~20 μl) kleju (Tabela materiałów) w ramach przygotowań do rozwarstwienia larw.
7. Napełnij komorę solą fizjologiczną (w mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 sacharozą i 5 kwasem 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowym (HEPES) o pH 7,2.
8. Dodać przeciwciało przeciwko peroksydazie chrzodwinowej (HRP) sprzężone z Alexa Fluor 647 (anty-HRP: 647; rozcieńczyć 1:10 z 1 mg / ml bulionu) w celu znakowania zakończenia presynaptycznego połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) podczas sekcji.
9. Za pomocą cienkiego pędzla (rozmiar 2) usuń wędrującą larwę trzeciego stadium z fiolki z pokarmem i umieść ją na pokrytym elastomerem szkle nakrywkowym.
10. Napełnij szklaną końcówkę mikropipety niewielką ilością kleju, korzystając z podciśnienia powietrza wytwarzanego przez usta z nasadką (krok 1.5).
11. Ułóż larwę grzbietową do góry za pomocą kleszczy i przyklej głowę do szkiełka nakrywkowego pokrytego elastomerem za pomocą małej kropli kleju, używając dodatniego ciśnienia powietrza ustami.
12. Powtórz tę procedurę z tylnym końcem larwy, upewniając się, że zwierzę jest napięte między dwoma nasadkami kleju.
13. Za pomocą nożyczek (ostrza 3 mm; Tabela materiałów), wykonaj cięcie poziome (~1 mm) z tyłu i cięcie pionowe wzdłuż grzbietowej linii środkowej.
14. Za pomocą cienkich kleszczy (#5, Tabela materiałów) delikatnie usuń tchawicę grzbietową, jelita, ciało tłuszczowe i inne narządy wewnętrzne pokrywające mięśnie.
15. Powtórz procedurę klejenia dla czterech klap ścian korpusu, upewniając się, że delikatnie rozciągasz ścianę korpusu zarówno w poziomie, jak i w pionie.
16. Podnieś brzuszny rdzeń nerwowy (VNC) za pomocą kleszczy, ostrożnie przetnij nerwy ruchowe nożyczkami, a następnie całkowicie usuń VNC.
17. Zastąp sól fizjologiczną z preparacji solą fizjologiczną wolną od Ca²⁺ (taką samą jak powyższa sól fizjologiczna bez CaCl₂), aby zatrzymać cykl pęcherzyków synaptycznych (SV).

2. Obrazowanie: Mikroskopia konfokalna

1. Użyj pionowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40-krotnym zanurzeniem w wodzie, aby zobrazować fluorescencję barwnika NMJ (można użyć innych mikroskopów).
2. Zobrazuj mięsień 4 NMJ segmentów brzucha 2-4 (można zobrazować inne NMJ) i zbierz obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (Tabela materiałów).
3. Użyj lasera HeNe 633 nm do wzbudzenia HRP: 647 (z filtrem długoprzepustowym > 635 nm) i lasera Argon 488 nm do wzbudzenia FM1-43 (z filtrem pasmowo-przepustowym 530-600 nm).
4. Operacyjnie określ optymalne wzmocnienie i przesunięcie dla obu kanałów.
   nuta: Te ustawienia pozostaną niezmienne przez pozostałą część eksperymentu.
5. Weź konfokalny stos Z przez cały wybrany NMJ od góry do dołu zakończenia synaptycznego oznaczonego przez HRP.
6. Zwróć uwagę na zobrazowany NMJ (segment, bok i mięsień), aby zapewnić nadmiar do dokładnie tego samego NMJ po rozładowaniu barwnika FM.

3. Stymulacja rodopsyny kanałowej FM Ładowanie barwnika

1. Hodować larwy wykazujące ekspresję ChR2 na żywności zawierającej kofaktor ChR2 all-trans retinal (rozpuszczony w etanolu; końcowe stężenie 100 μM).
2. Preparat larwalny umieścić w komorze z pleksi na stoliku mikroskopu preparacyjnego wyposażonym w port kamery.
3. Podłącz niebieską diodę LED (470 nm; Tabela materiałów) do programowalnego stymulatora za pomocą koncentrycznego i umieść diodę LED w porcie kamery.
4. Skoncentruj niebieską wiązkę światła LED na funkcji wypreparowanej larwy za pomocą funkcji zoomu mikroskopu.
5. Zastąp sól fizjologiczną wolną od Ca²⁺ w preparacie larwalnym solą fizjologiczną powyżej FM1-43 (4 μM; 1 mM CaCl₂) na etapie optogenetycznym.
6. Ustaw parametry diody LED za pomocą stymulatora (np. 15 V, częstotliwość 20 Hz, czas trwania 20 ms i czas 5 min (rysunek 2)).
7. Rozpocznij stymulację światłem i śledź z timerem przez określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej (np. 5 min; Rysunek 2).
8. Gdy timer się zatrzyma, szybko usuń roztwór barwnika FM i zastąp go solą fizjologiczną wolną od Ca²⁺, aby zatrzymać cykl SV.
9. Umyj w krótkich odstępach czasu solą fizjologiczną bez Ca²⁺ (5x przez 1 min), aby upewnić się, że roztwór barwnika FM został całkowicie usunięty.
10. Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca²⁺ w celu natychmiastowego obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu protokołu obrazowania.
11. Zwróć uwagę na zobrazowany NMJ (segment, bok i mięsień), aby zapewnić dostęp do dokładnie tego samego NMJ po rozładowaniu barwnika FM.

4. Stymulacja rodopsyny kanałowej: Rozładunek barwnika FM

1. Zastąp sól fizjologiczną wolną od Ca²⁺ zwykłą solą fizjologiczną (bez barwnika FM1-43) na stoliku mikroskopu preparacyjnego z diodą LED portu kamery skupioną na larwie.
2. Ustaw parametry stymulatora rozładunku (np. 15 V, częstotliwość 20 Hz, czas trwania 20 ms i czas 2 min (rysunek 2).
3. Rozpocznij stymulację światłem i śledź za pomocą timera przez z góry określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej (np. 2 min; Rysunek 2).
4. Po upływie okresu odliczania szybko usuń roztwór barwnika FM i zastąp go solą fizjologiczną wolną od Ca²⁺, aby zatrzymać cykl SV.
5. Umyj w krótkich odstępach czasu solą fizjologiczną bez Ca²⁺ (5x przez 1 min), aby upewnić się, że zewnętrzny barwnik został całkowicie usunięty.
6. Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca²⁺ w celu natychmiastowego obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego.
7. Upewnij się, że obrazujesz fluorescencję barwnika FM1-43 w tym samym NMJ, jak wspomniano powyżej, przy użyciu tych samych ustawień konfokalnych.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat blokowy protokołu ładowania barwnika FM1-43 w Drosophila NMJ. Rozwarstwienie kleju larwalnego wytwarza spłaszczony preparat nerwowo-mięśniowy, w którym brzuszny rdzeń nerwowy (VNC) wystaje z nerwów segmentowych z brzusznej linii środkowej (Vm) do półsegmentalnie powtarzających się układów mięśni ściany ciała (krok a). VNC jest odcinany, a cała sekcja larwalna jest następnie inkubo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SylGard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Fisher Naukowy	NC9644388	Do zakładania szkła nakrywkowego do sekcji
Szklana osłona mikroskopu 22x22-1	Marka rybacka	12-542-B	Zakładanie leku SylGard do sekcji
Aluminiowa górna płyta grzejna typu 2200	Termolyna	HPA2235M	Aby wyleczyć SylGard
Komora preparcyjna ze szkła plexi	N/a	N/a	Ręcznie
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Wskaźnik WPI	Numer katalogowy: 1B100F-4	Do wykonywania mikropipet ssących i klejowych
Laserowy ściągacz do mikropipet	Instrument Suttera	Zobacz materiał P-2000	Do wykonywania mikropipet ssących i klejowych
Rurki laboratoryjne Tygon E-3603	Dostawa komponentów Co.	TET-031A	Do pipety doustnej i ssącej
Końcówka do pipet P2	USA Naukowe	Nr kat. 1111-3700	Do pipety doustnej
Nasadka probówki Eppendorf 0,6 ml	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 05-408-120	Służy do nakładania kleju do preparacji
Obligacja weterynaryjna 3M	Wskaźnik WPI	Obligacja weterynaryjna	Klej używany do rozwarstwiania
Chlorek potasu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał P-217	Forsalina
chlorek sodu	Millipore Sigma	Zobacz materiał S5886	Do soli fizjologicznej
Chlorek magnezu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał M35-500	Do soli fizjologicznej
Chlorek wapnia dwuwodny	Millipore Sigma	Zobacz materiał C7902	Do soli fizjologicznej
sacharoza	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S5-3	Do soli fizjologicznej
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 123-605-021	Do oznaczania błon neuronalnych
HEPESY	Millipore Sigma	H3375	Do soli fizjologicznej
pędzel	Winsor & Newton	94376864793	Aby manipulować larwami
Pęseta Dumont Dumostar #5	Wskaźnik WPI	500233	Używany podczas sekcji
7 cm mikronożyczki McPherson-Vannas (ostrza 3 mm)	Wskaźnik WPI	Numer katalogowy: 14177	Używany podczas sekcji
FM1-43	Fisher Naukowy	Zobacz materiał T35356	Fluorescencyjny barwnik styrylowy
Zegar cyfrowy	Firma VWR	Nr kat. 62344-641	Do pomiaru czasu załadunku/rozładunku barwnika FM
LSM 510 META laserowo-skaningowy mikroskop konfokalny	Zeiss		Do obrazowania markerów fluorescencyjnych
Zen 2009 SP2 wersja 6.0	Zeiss		Oprogramowanie do obrazowania konfokalnego
Laser HeNe 633nm	Lasos (Lasos)	Aby wzbudzić HRP:647 podczas obrazowania
Laser argon 488nm	Lasos (Lasos)		Aby wzbudzić barwnik FM podczas obrazowania
Mikrokuźnia	Wskaźnik WPI	MF200	Do wypalania mikropipet szklanych do polerowania
Stymulator	trawa	Zobacz materiał S48	Do sterowania diodą LED i stymulacją elektryczną
Siatkówka All-trans	Millipore Sigma	Czynnik R2500	Niezbędny kofaktor dla ChR2
Mikroskop Zeiss Stemi z portem kamery	Zeiss	2000-C	Stosowany podczas stymulacji rodopsyny kanałowej
Dioda LED 470nm	ThorLabs powiedział:	Zobacz materiał M470L2	Służy do aktywacji ChR
Sterownik LED T-Cube	ThorLabs powiedział:	Dioda LEDD1B	Do sterowania diodą LED
Zasilacz LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Do zasilania diody LED
Miernik mocy optycznej i energii	ThorLabs powiedział:	Pył zawieszony PM100D	Aby zmierzyć natężenie diody LED
40-krotny obiektyw Achroplan do zanurzenia w wodzie	Zeiss	Stosowany podczas elektrostymulacji i obrazowania konfokalnego