1. Rozwarstwienie kleju larwalnego
- Dokładnie wymieszaj 10 części bazy z elastomeru silikonowego z 1 częścią utwardzacza z elastomeru silikonowego z zestawu elastomerów (tabela materiałów).
- Szkiełka nakrywkowe ze szkła o wymiarach 22 x 22 mm pokryć elastomerem i utwardzić na gorącej płycie w temperaturze 75 °C przez kilka godzin (do momentu, gdy przestaną być lepkie w dotyku).
- Umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe pokryte elastomerem w specjalnie wykonanej komorze preparacyjnej z pleksiglasu (Rysunek 1, na dole) w celu przygotowania do rozwarstwienia larw.
- Przygotuj pipety kleju z kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą standardowego ściągacza do mikroelektrod, aby uzyskać pożądany rozmiar stożka i końcówki.
- Delikatnie oderwij końcówkę mikropipety, a do drugiego końca przymocuj 2 stopy elastycznej rurki z tworzywa sztucznego (średnica wewnętrzna 1/32", średnica wewnętrzna; średnica zewnętrzna 3/32", średnica zewnętrzna; ścianka 1/32"; Tabela materiałów) z końcówką do ust (końcówka pipety P2).
- Napełnij mały pojemnik (0,6 ml nakrętki probówki Eppendorfa) niewielką objętością (~20 μl) kleju (Tabela materiałów) w ramach przygotowań do rozwarstwienia larw.
- Napełnij komorę solą fizjologiczną (w mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sacharozą i 5 kwasem 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowym (HEPES) o pH 7,2.
- Dodać przeciwciało przeciwko peroksydazie chrzodwinowej (HRP) sprzężone z Alexa Fluor 647 (anty-HRP: 647; rozcieńczyć 1:10 z 1 mg / ml bulionu) w celu znakowania zakończenia presynaptycznego połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) podczas sekcji.
- Za pomocą cienkiego pędzla (rozmiar 2) usuń wędrującą larwę trzeciego stadium z fiolki z pokarmem i umieść ją na pokrytym elastomerem szkle nakrywkowym.
- Napełnij szklaną końcówkę mikropipety niewielką ilością kleju, korzystając z podciśnienia powietrza wytwarzanego przez usta z nasadką (krok 1.5).
- Ułóż larwę grzbietową do góry za pomocą kleszczy i przyklej głowę do szkiełka nakrywkowego pokrytego elastomerem za pomocą małej kropli kleju, używając dodatniego ciśnienia powietrza ustami.
- Powtórz tę procedurę z tylnym końcem larwy, upewniając się, że zwierzę jest napięte między dwoma nasadkami kleju.
- Za pomocą nożyczek (ostrza 3 mm; Tabela materiałów), wykonaj cięcie poziome (~1 mm) z tyłu i cięcie pionowe wzdłuż grzbietowej linii środkowej.
- Za pomocą cienkich kleszczy (#5, Tabela materiałów) delikatnie usuń tchawicę grzbietową, jelita, ciało tłuszczowe i inne narządy wewnętrzne pokrywające mięśnie.
- Powtórz procedurę klejenia dla czterech klap ścian korpusu, upewniając się, że delikatnie rozciągasz ścianę korpusu zarówno w poziomie, jak i w pionie.
- Podnieś brzuszny rdzeń nerwowy (VNC) za pomocą kleszczy, ostrożnie przetnij nerwy ruchowe nożyczkami, a następnie całkowicie usuń VNC.
- Zastąp sól fizjologiczną z preparacji solą fizjologiczną wolną od Ca2+ (taką samą jak powyższa sól fizjologiczna bez CaCl2), aby zatrzymać cykl pęcherzyków synaptycznych (SV).
2. Obrazowanie: Mikroskopia konfokalna
- Użyj pionowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40-krotnym zanurzeniem w wodzie, aby zobrazować fluorescencję barwnika NMJ (można użyć innych mikroskopów).
- Zobrazuj mięsień 4 NMJ segmentów brzucha 2-4 (można zobrazować inne NMJ) i zbierz obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (Tabela materiałów).
- Użyj lasera HeNe 633 nm do wzbudzenia HRP: 647 (z filtrem długoprzepustowym > 635 nm) i lasera Argon 488 nm do wzbudzenia FM1-43 (z filtrem pasmowo-przepustowym 530-600 nm).
- Operacyjnie określ optymalne wzmocnienie i przesunięcie dla obu kanałów.
nuta: Te ustawienia pozostaną niezmienne przez pozostałą część eksperymentu.
- Weź konfokalny stos Z przez cały wybrany NMJ od góry do dołu zakończenia synaptycznego oznaczonego przez HRP.
- Zwróć uwagę na zobrazowany NMJ (segment, bok i mięsień), aby zapewnić nadmiar do dokładnie tego samego NMJ po rozładowaniu barwnika FM.
3. Stymulacja rodopsyny kanałowej FM Ładowanie barwnika
- Hodować larwy wykazujące ekspresję ChR2 na żywności zawierającej kofaktor ChR2 all-trans retinal (rozpuszczony w etanolu; końcowe stężenie 100 μM).
- Preparat larwalny umieścić w komorze z pleksi na stoliku mikroskopu preparacyjnego wyposażonym w port kamery.
- Podłącz niebieską diodę LED (470 nm; Tabela materiałów) do programowalnego stymulatora za pomocą koncentrycznego i umieść diodę LED w porcie kamery.
- Skoncentruj niebieską wiązkę światła LED na funkcji wypreparowanej larwy za pomocą funkcji zoomu mikroskopu.
- Zastąp sól fizjologiczną wolną od Ca2+ w preparacie larwalnym solą fizjologiczną powyżej FM1-43 (4 μM; 1 mM CaCl2) na etapie optogenetycznym.
- Ustaw parametry diody LED za pomocą stymulatora (np. 15 V, częstotliwość 20 Hz, czas trwania 20 ms i czas 5 min (rysunek 2)).
- Rozpocznij stymulację światłem i śledź z timerem przez określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej (np. 5 min; Rysunek 2).
- Gdy timer się zatrzyma, szybko usuń roztwór barwnika FM i zastąp go solą fizjologiczną wolną od Ca2+, aby zatrzymać cykl SV.
- Umyj w krótkich odstępach czasu solą fizjologiczną bez Ca2+ (5x przez 1 min), aby upewnić się, że roztwór barwnika FM został całkowicie usunięty.
- Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca2+ w celu natychmiastowego obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu protokołu obrazowania.
- Zwróć uwagę na zobrazowany NMJ (segment, bok i mięsień), aby zapewnić dostęp do dokładnie tego samego NMJ po rozładowaniu barwnika FM.
4. Stymulacja rodopsyny kanałowej: Rozładunek barwnika FM
- Zastąp sól fizjologiczną wolną od Ca2+ zwykłą solą fizjologiczną (bez barwnika FM1-43) na stoliku mikroskopu preparacyjnego z diodą LED portu kamery skupioną na larwie.
- Ustaw parametry stymulatora rozładunku (np. 15 V, częstotliwość 20 Hz, czas trwania 20 ms i czas 2 min (rysunek 2).
- Rozpocznij stymulację światłem i śledź za pomocą timera przez z góry określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej (np. 2 min; Rysunek 2).
- Po upływie okresu odliczania szybko usuń roztwór barwnika FM i zastąp go solą fizjologiczną wolną od Ca2+, aby zatrzymać cykl SV.
- Umyj w krótkich odstępach czasu solą fizjologiczną bez Ca2+ (5x przez 1 min), aby upewnić się, że zewnętrzny barwnik został całkowicie usunięty.
- Preparat larwalny należy przechowywać w świeżej soli fizjologicznej wolnej od Ca2+ w celu natychmiastowego obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego.
- Upewnij się, że obrazujesz fluorescencję barwnika FM1-43 w tym samym NMJ, jak wspomniano powyżej, przy użyciu tych samych ustawień konfokalnych.
