$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie zwierzęcia:
- Znieczulić szczura za pomocą środka wziewnego (izofluranu) w dawce 1-2% dostarczanego do efektu lub we wstrzyknięciu (ketamina, ksylazyna, acepromazyna). Dawkowanie znieczulenia iniekcyjnego jest następujące: 95,0 mg/kg ketaminy, 10,0 mg/kg ksylazyny, 0,075 mg/kg acepromazyny.
nuta: Podczas przeprowadzania tego protokołu nagrywania CMAP z powodzeniem stosujemy zarówno metody wziewne, jak i znieczulające do wstrzykiwań, bez żadnych preferencji.
- Zwierzę musi być utrzymywane na odpowiedniej głębokości znieczulenia przed rozpoczęciem zabiegu, do zakończenia operacji i do momentu zadziałania buprenorfiny po operacji. Potwierdź prawidłowe znieczulenie przez krótkie uszczypnięcie palca u nogi, aby ustalić, czy nie wywołuje reakcji odstawienia. Dodatkowo przetestuj odruch rogówkowy wacikiem. Podczas zabiegu chirurgicznego należy stwierdzić, że częstość akcji serca i częstość oddechów nie wzrosły, co sugeruje, że głębokość znieczulenia stała się zbyt mała.
- Nałóż maść weterynaryjną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Chirurg powinien umyć ręce środkiem dezynfekującym (peeling z chlorheksydyną) przed rozpoczęciem operacji. Chirurg powinien nosić sterylne rękawiczki, maskę na twarz i fartuch lub czysty fartuch laboratoryjny. Wszystkie narzędzia powinny być umyte i autoklawowane przed zabiegiem. Dodaj pasek wskaźnika sterylizacji do zestawu narzędzi przed autoklawowaniem na poziomie narzędzi, aby sprawdzić, czy sterylizacja została zakończona. Chirurg powinien sprawdzić, czy cała linia na pasku jest przed rozpoczęciem operacji. Zaklej również zewnętrzną część pudełka taśmą wskazującą do autoklawu. Jeśli operacja ma być przeprowadzona na kilku zwierzętach tego samego dnia, wyczyść narzędzia między operacjami i wysterylizuj w sterylizatorze z kulkami szklanymi. W razie potrzeby należy wysterylizować oba końce instrumentu w sterylizatorze z kulkami szklanymi, umieszczając uchwyt narzędzia w sterylizatorze na odpowiedni czas, wyjmując instrument sterylnym hemostatem, schładzając go w sterylnym polu, a następnie umieszczając sprawną końcówkę instrumentu w sterylizatorze z kulkami szklanymi na odpowiedni okres.
- Po znieczuleniu zwierzęcia należy je umieścić na tablicy operacyjnej powierzchnią grzbietową do dołu i brzuchem skierowanym do góry, tak aby można było użyć taśmy do przymocowania przednich kończyn zwierzęcia do deski chirurgicznej.
- Ogolić powierzchnię brzuszną doogonowo, zaczynając od podstawy czaszki i upewnij się, że obszar wokół brzucha po obu stronach linii środkowej jest ogolony w zależności od tego, która półmembrana jest rejestrowana. Nałóż powidon-jod na ogoloną powierzchnię skóry.
2. Przygotowanie do nagrań CMAP:
- Po przygotowaniu zwierzęcia umieść elektrodę uziemiającą podskórnie w ogonie (ryc. 1).
- Umieścić elektrodę odniesienia podskórnie w przeciwległym dolnym odcinku brzucha.
- Umieść żel przewodzący na samoprzylepnym pasku powierzchniowym lub elektrodzie rejestrującej dysk (wymiary powierzchniowej elektrody taśmowej: 0,5 x 3 cm), a następnie umieść elektrodę powierzchniową poprzecznie wzdłuż jednostronnego brzegu żebrowego.
- Elektrody stymulujące należy umieścić przezskórnie w odległości 0,5 cm od tchawicy i powyżej obojczyka. Wprowadzić elektrody na głębokość około 1,0 cm przez skórę. Zabezpiecz elektrody ręcznie, aby ich położenie nie zmieniało się wraz z kolejnymi stymulacjami.
nuta: Elektrody stymulujące kąt 90° względem skóry w miejscu wprowadzenia.
3. Zapisy złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP):
- Uzyskanie zapisów elektrofizjologicznych za pomocą stymulatora/wzmacniacza, a następnie komputerowa analiza danych.
- Parametry bodźca stymulacji pojedynczym pociągnięciem powinny wynosić 0,5 ms, impulsy supramaksymalne 1,0 Hz. Amplituda bodźca powinna wynosić od 6,0 do 8,0 V (rysunek 2A).
nuta: W eksperymencie użyj intensywności bodźca o tej samej amplitudzie u wszystkich zwierząt. Celem jest maksymalizacja amplitudy odpowiedzi poprzez zastosowanie minimalnej amplitudy stymulacji. Ważne jest, aby pamiętać, że początkowa reakcja, która występuje w momencie stymulacji, jest artefaktem stymulacji. Ponadto należy zadbać o uzyskanie odpowiedzi CMAP, która jest poprzedzona stabilną/płaską linią wyjściową po artefakcie stymulacji, po której następuje szybka odpowiedź CMAP. Aby uzyskać taką odpowiedź, może być konieczna zmiana położenia elektrod stymulacyjnych i/lub rejestrujących.
- Odczekaj 30 sekund między stymulacjami i powtórz 10 stymulacji z rzędu, aby uzyskać średnią odpowiedź (Rysunek 2B-C). Zmierz amplitudę od linii podstawowej do wartości szczytowej (rysunek 2A). Przeprowadzić stymulację nerwu przeponowego w fazie cyklu oddechowego zwierzęcia, kiedy nerw przeponowy/przepona nie jest aktywowany. Procedurę można powtórzyć na tym samym zwierzęciu w przypadku przeciwległej półmembrany.
- Po ostatniej sesji zapisu CMAP należy wykonać perfuzję zwierzęcia, jeśli zostanie przeprowadzone barwienie połączenia przeponowego nerwowo-mięśniowego (NMJ). Zapisy CMAP należy przeprowadzać wielokrotnie na tym samym zwierzęciu mniej więcej raz w tygodniu (lub w wybranych odstępach czasu).
- Po nagraniach CMAP dotyczących przeżycia, pozwól zwierzęciu dojść do siebie na podkładce grzewczej z ciepłą wodą w krążącej ciepłej wodzie i stale monitoruj podczas rekonwalescencji, aż się obudzi i znajdzie się w pozycji rufowej. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
- Po położeniu na rufie należy monitorować zwierzę co 12 godzin przez pierwsze 48 godzin (następnie raz dziennie). Jeśli zwierzę wydaje się być odwodnione (wiotka skóra, apatia), należy podawać płyny (roztwór Ringera z mleczanami; podskórnie; 1-2 ml na wstrzyknięcie, z obróconymi miejscami; 2 razy dziennie) do momentu ustabilizowania się masy ciała i utraty płynów po operacji. W ostrym okresie pooperacyjnym należy podawać zwierzętom zmiękczony pokarm w małych naczyniach, jeśli to konieczne, aby zachęcić do jedzenia, jeśli nie mogą dosięgnąć karmnika z drucianą pokrywą.
- Buprenorfinę należy podawać w dawce 0,05 mg/kg mc. przed zakończeniem zabiegu, a następnie w odstępach 12-godzinnych przez pierwsze 24 godziny (i w zależności od objawów bólu/stresu po zabiegu) we wstrzyknięciu podskórnym (obrócenie miejsca). Jeśli później zauważy się oznaki bólu lub niepokoju, należy leczyć zwierzęta buprenorfiną. Objawy wskazujące na ból/niepokój obejmują brak aktywności, wokalizacje, brak jedzenia lub picia (odwodnienie), nadmierną utratę masy ciała, pilnowanie, nadmierne gryzienie lub drapanie w miejscu nacięcia. Dodatkowe kryteria stosowane w określaniu bólu i dystresu obejmują brak reakcji na bodźce zewnętrzne, przejściową lub niesprowokowaną wokalizację, ciężki lub nieprawidłowy oddech, uporczywą czerwono-brązową wydzielinę z nosa i oka, wyraźną piloerekcję. Monitoruj również dowody złej higieny, które sugerowałyby chore zwierzęta. Jeśli po 72 godzinach leczenia zaobserwuje się, że zwierzę nadal znajduje się w niebezpieczeństwie, (zgodnie z kryteriami bólu/stresu opisanymi powyżej i po otrzymaniu opisanego powyżej protokołu przeciwbólowego), należy poddać zwierzę eutanazji.
