Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe metody obrazowania żywych komórek służące do badania chemotaksji. Przedstawiamy metody mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej zdarzeń sygnalizacyjnych w migrujących komórkach. Pomiar zdarzeń sygnalizacyjnych pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna GPCR umożliwia wyczuwanie gradientu chemoatraktantów i kontroluje kierunkową migrację komórek eukariotycznych.

Streszczenie

Wiele komórek eukariotycznych potrafi wykrywać gradienty sygnałów chemicznych w swoim otoczeniu i migrować zgodnie z nimi ¹. Ta sterowana migracja komórek nazywana jest chemotaksją, która jest niezbędna dla wielu typów komórek do pełnienia ich funkcji, takich jak ruch komórek odpornościowych czy organizacja komórek neuronalnych ^{2, 3}. Duża rodzina receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) wykrywa różnorodne małe peptydy, znane jako chemokiny, aby kierować migracją komórek in vivo ⁴. Nadrzędnym celem badań nad chemotaksją jest zrozumienie, w jaki sposób mechanizm GPCR wyczuwa gradienty chemokin i kontroluje zdarzenia sygnalizacyjne prowadzące do chemotaksji. W tym celu wykorzystujemy techniki obrazowania do monitorowania w czasie rzeczywistym spatiotemporalnych stężeń chemoatraktantów, ruchu komórek w gradiencie chemoatraktanta, zależnej od GPCR aktywacji heterotrymerycznych białek G oraz wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych zaangażowanych w chemotaksję komórek eukariotycznych ^5-8. Prosty organizm eukariotyczny, Dictyostelium discoideum, wykazuje zachowania chemotaktyczne podobne do leukocytów, przez co D. discoideum stanowi kluczowy system modelowy do badania chemotaksji eukariotów. Jako wolnożyjące ameby, komórki D. discoideum dzielą się w bogatym medium. W warunkach głodu komórki wchodzą w program rozwojowy, w którym agregują poprzez chemotaksję zależną od cAMP, tworząc struktury wielokomórkowe. W D. discoideum zidentyfikowano wiele komponentów zaangażowanych w chemotaksję w kierunku cAMP. Wiązanie cAMP do GPCR (cAR1) indukuje dysocjację heterotrymerycznych białek G na podjednostki Gγ i Gβγ ^{7, 9, 10}. Podjednostki Gβγ aktywują Ras, który z kolei aktywuje PI3K, przekształcając PIP₂ w PIP₃ na błonie komórkowej ^11-13. PIP₃ służy jako miejsce wiązania dla białek z domenami homologii pleckstryny (PH), rekrutując tym samym te białka do błony ^{14, 15}. Aktywacja receptorów cAR1 kontroluje również asocjację PTEN z błoną, który defosforyluje PIP₃ do PIP₂ ^{16, 17}. Mechanizmy molekularne te są ewolucyjnie konserwatywne w chemotaksji zależnej od GPCR chemokin w komórkach ludzkich, takich jak neutrofile ¹⁸. Przedstawiamy następujące metody badania chemotaksji komórek D. discoideum: 1. Przygotowanie komórek do badań chemotaktycznych. 2. Obrazowanie chemotaksji komórek w gradiencie cAMP. 3. Monitorowanie indukowanej przez GPCR aktywacji heterotrymerycznego białka G w pojedynczych żywych komórkach. 4. Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamicznych odpowiedzi PIP₃ wywołanych chemoatraktantem w pojedynczych żywych komórkach. Opracowane przez nas metody obrazowania mogą być zastosowane do badania chemotaksji ludzkich leukocytów.

Protokół

1. Przygotowanie komórek Dictyostelium discoideum kompetentnych chemotaktycznie

1. Aby uzyskać komórki D. discoideum wykazujące chemotaksję w kierunku chemoatraktanta cAMP, należy zebrać komórki hodowane w bogatym medium D3-T z hodowli z wytrząsaniem w temperaturze 22°C.
2. Komórki należy przemyć dwukrotnie w bezodżywczym buforze rozwojowym (bufor DB zawierający 5 mM Na₂HPO₄, 5 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂ oraz 0,1 mM CaCl₂).
3. Komórki należy zawiesić ponownie w buforze DB z zagęszczeniem 2x10⁷ komórek/ml.
4. 10 ml zawiesiny komórkowej w kolbie o pojemności 250 ml należy wytrząsać z prędkością 100 rpm w temperaturze 22°C przez jedną godzinę.
5. Co sześć minut przez okres 6 godzin należy dodać 100 μl roztworu cAMP o stężeniu 7,5 μM do 10 ml zawiesiny komórek, aby osiągnąć końcowe stężenie cAMP wynoszące 75 nM; proces ten określa się jako traktowanie pulsacyjne cAMP. Po 5-6 godzinach traktowania pulsacyjnego cAMP komórki D. discoideum stają się zdolne do chemotaksji w kierunku gradientu cAMP.
6. Komórki należy zebrać poprzez wirowanie przy 200 g przez 5 min, a następnie zawiesić ponownie w buforze DB zawierającym 2,5 mM kofeiny i wytrząsać z prędkością 200 rpm w temperaturze 22°C przez 20 min, aby sprowadzić stan komórek do poziomu bazowego przed rozpoczęciem chemotaksji.

2. Obrazowanie komórek chemotaktycznych w widocznym i manipulowalnym gradiencie chemoatraktanta

1. Wypełnij mikropipetę świeżo przygotowanym 30 μl roztworem 1 μM cAMP i Alexa 594 w stężeniu 0,1 μg/μl w buforze DB.
2. Zamocuj Femtotip w uchwycie do mikropipety i podłącz rurkę do urządzenia do podawania ciśnienia, systemu Eppendorf FemtoJet.
3. Zamocuj zestaw mikropipety w zmotoryzowanym mikromanipulatorze (Eppendorf TransferMan NK2), aby zapewnić stałe ciśnienie w celu ustanowienia stabilnego gradientu.
4. Umieść jednodoborkową komorę LabTek wypełnioną 6 ml buforu DB nad obiektywem olejowym 40X w mikroskopie konfokalnym i, korzystając z optyki pola jasnego, wycentruj Femtotip w polu widzenia.
5. Włącz zasilanie ciśnieniem i ustaw ciśnienie kompensacyjne (Pc) na 70 hPa, aby utworzyć gradient mieszaniny cAMP/Alexa 594.
6. Wizualizuj gradient cAMP, monitorując mieszaninę cAMP o pożądanym stężeniu oraz fluorescencję Alexa 594 przy użyciu wzbudzania linią lasera 543 nm.
7. Użyj funkcji autopozycjonowania mikromanipulatora, aby ustawić mikropipetę w wybranych punktach i zdefiniuj je jako Pozycję 1, Pozycję 2 oraz Pozycję 3, aby manipulować gradientem, na który wystawione są komórki.

3. Unieruchomiony system komórek niepolaryzowanych ułatwia obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych związanych z wykrywaniem gradientu cAMP

1. Po traktowaniu kofeiną pobrać alikwot komórek i odwirować przy 500g przez 3 min.
2. Usunąć bufor i rozcieńczyć komórki do stężenia 5x10⁵ komórek/ml świeżym buforem DB zawierającym 2,5 mM kofeiny.
3. Nanieść 1 ml zawiesiny komórkowej do komory z jedną studnią lub 0,4 ml do każdej studni komory czterostudniowej.
4. Pozostawić komórki do przylgnięcia na 10 min, ostrożnie odpipetować bufor w celu usunięcia nieprzylgniętych komórek i zastąpić go taką samą objętością.
5. Zlokalizować wybrane komórki pod mikroskopem i rozpocząć obrazowanie.
6. W przypadku eksperymentu zaprojektowanego do monitorowania dynamiki komponentów sygnalizacyjnych w komórkach narażonych na stały gradient, traktować komórki Latrunculiną B w stężeniu 5,0 μM (stężenie końcowe) przez 10 min przed rozpoczęciem eksperymentów.

4. Jednoczesny monitoring aktywacji heterotrymerycznego białka G i produkcji PIP₃

1. Stymuluj pulsacyjnie cAMP komórki koekspresujące GαCFP i YFPGβ (komórki G) oraz komórki ekspresujące wskaźnik PIP₃ PH-GFP (komórki PH) ⁷.
2. Zmieszaj te dwa typy komórek w stosunku 1:1 i wysiej je w komorach jedno- lub czterodotworowych.
3. Utwórz i zapisz referencyjną krzywą sygnatury emisyjnej dla CFP, YFP i GFP, korzystając z trybu Lambda Stack Acquisition w zakresie widmowym od 464 do 624 nm z szerokością 10 nm.
4. Wykonaj jednoczesne obrazowanie aktywacji białka G w komórkach G oraz produkcji PIP₃ w komórkach PH, korzystając z tego samego trybu Lambda Stack Acquisition w zakresie widmowym od 464 do 544 nm z przyrostami 10 nm.
5. Zastosuj funkcję Linear Unmixing oprogramowania Zeiss 510META, wykorzystując zapisane sygnatury emisyjne CFP i YFP, aby matematycznie obliczyć udział każdego fluoroforu w Lambda Stack i rozdzielić intensywność CFP i YFP na oddzielne kanały w komórkach G.
6. Stosując tę samą strategię, użyj funkcji Linear Unmixing z zapisanymi sygnaturami emisyjnymi GFP i tła, aby matematycznie obliczyć intensywność GFP w komórkach PH.

5. Reprezentatywne wyniki:

1. Doskonały system modelowy dla D. discoideum do chemotaksji pośredniczonej przez GPCR. Ameba społeczna, *D. discoideum* wykazuje uderzającą chemotaksję w cyklu życiowym. Dzięki swoim zaletom genetycznym i biochemicznym, D. d stanowi potężny system do badania chemotaksji.
2. Chemotaksja komórek w widocznych i manipulowalnych polach chemoatraktantów. W niniejszej części przedstawiamy najpierw prostą metodologię uzyskania liniowej zależności między stężeniem cAMP a intensywnością fluorescencji barwnika Alexa 594 poprzez wykonanie serii rozcieńczeń 2 μM cAMP wymieszany z 10 μg/mL Alexa 594 (Ryc. 2A). Następnie przedstawiamy prosty sposób wizualizacji gradientu, a ponadto metodę ilościowego pomiaru stężenia cAMP w gradiencie na podstawie intensywności Alexa 594 (Ryc. 2B).
3. Motywność komórek jest rozdzielona z polaryzacją komórek i wyczuwaniem kierunku. Inhibitor polimeryzacji aktyny eliminuje istniejącą wcześniej polarność morfologiczną i zapobiega również ruchowi komórek, zachowując jednocześnie ich zdolność do wyczuwania kierunku (Ryc. 3A). Wykorzystanie światła widzialnego i podatny na manipulację Stymulacja cAMP zapewnia sygnał wejściowy, na przykład w formie równomiernie przyłożonej stymulacji lub gradientu. Metoda ta pozwala na ilościową analizę indukowanej przez cAMP redystrybucji kluczowych komponentów sygnałowych w mechanizmie wykrywania gradientu. Pomiar dynamiki czasoprzestrzennej tych komponentów sygnałowych pozwala zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnałowa osiąga adaptację do równomiernej stymulacji, generując jednocześnie spolaryzowane odpowiedzi biochemiczne na gradienty (Rys. 3B).
4. Systematyczne pomiary kinetyki sieci sygnalizacyjnej chemosensorycznej po ekspozycji na stały gradient. Kluczowe jest zmierzenie dynamiki/kinetyki komponentów sygnałowych odpowiedzialnych za wykrywanie kierunku, aby zrozumieć, w jaki sposób każdy z tych komponentów przyczynia się do ustanowienia polaryzacji wewnątrzkomórkowej w momencie, gdy komórki po raz pierwszy napotykają gradient. Wykorzystując obrazowanie żywych komórek o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej, wykazaliśmy najpierw dwufazową produkcję PIP3 w komórce poddanej działaniu stałego gradientu cAMP (Rys. 4A-C). Stosując obrazowanie żywych komórek, systematycznie zmierzyliśmy dynamikę specyficznej sieci sygnałowej wykrywania kierunku – od stymulacji cAMP do produkcji PIP3 (Rys. 4D, E).
5. Jednoczesne monitorowanie aktywacji heterotrymerycznych białek G i PIP₃ produkcja po jednorodnej stymulacji cAMP. Transfer energii rezonansowej Förstera (w skrócie FRET) stanowi wydajną metodę monitorowania aktywacji (dysocjacji) heterotrymerycznych białek G po stymulacji cAMP. W niniejszym opracowaniu opisano wygodny i łatwy do wdrożenia system do jednoczesnego pomiaru aktywacji heterotrymerycznych białek G oraz PIP₃ produkcja poprzez monitorowanie zmian FRET oraz translokacji błonowej PIP₃ sonda, odpowiednio PH-GFP w komórkach G i PH (rys. 5). Jednorodne pobudzenie cAMP wywołuje trwałą aktywację białka G, podczas gdy wywołuje przejściową odpowiedź PIP₃ produkcja

Rycina 1: Doskonały system modelowy D. discoideum dla chemotaksji pośredniczonej przez GPCR. A. Schemat przedstawia skrócony szlak sygnalizacyjny wyczuwania kierunkowego. B. Gradient cAMP indukuje szybką chemotaksję komórek D. discoideum. Komórki wykazują ekspresję sondy PIP₃, PH-GFP (zielony). Gradient (czerwony) jest wizualizowany za pomocą Alexa 594. Pasek skali=50μm.

Rycina 2: Chemotaksja komórek w widocznym i manipulowalnym polu chemoatraktantów. A. Wykres przedstawia liniową zależność między stężeniem cAMP a intensywnością barwnika fluorescencyjnego Alexa 594 w serii rozcieńczeń 2 μM cAMP zmieszanego z 10 μg/mL Alexa 594. B. Ilościowy pomiar stężenia cAMP w gradiencie na podstawie liniowej zależności między stężeniem cAMP a intensywnością barwnika fluorescencyjnego Alexa 594 przedstawionej w A.

Rycina 3: Motywność komórek jest rozsprzęgana z polaryzacją komórkową i wyczuwaniem kierunkowym. A. Obraz pokazuje, że komórki unieruchomione za pomocą inhibitora polimeryzacji aktyny Latrunculiny B zachowują zdolność do wyczuwania kierunkowego. Komórki wykazują ekspresję sondy PIP₃, PH-GFP (zielony). Gradient (czerwony) jest wizualizowany za pomocą Alexa 594. B. Możliwość manipulacji stymulacją cAMP oraz system unieruchomionych komórek pozwalają na rozstrzygnięcie kluczowych pytań dotyczących wyczuwania kierunkowego. Pasek skali=10μm.

Rycina 4: Systemowe pomiary kinetyki sieci sygnalizacyjnej chemosensacji po ekspozycji na stały gradient. A. Montaż przedstawia dwufazową produkcję PIP₃ (kolor zielony) w komórce poddanej działaniu stałego gradientu cAMP (kolor czerwony). B. Obraz przedstawia obszary zainteresowania (ROI) służące do pomiaru kinetyki produkcji PIP₃, zaprezentowanej w części C. C. Kinetyka produkcji PIP₃ w komórkach poddanych działaniu stałego gradientu. D. Schemat przedstawia sieć sygnalizacyjną wykrywania kierunkowego, od stymulacji cAMP do produkcji PIP₃. Kinetyka tych procesów po ekspozycji na stały gradient jest przedstawiona w części E za pomocą pełnych linii w odpowiadających im kolorach.

Rysunek 5: Jednoczesny monitoring wielu zdarzeń w sieciach sygnalizacyjnych GPCR. A. Schemat przedstawia jednoczesny pomiar aktywacji heterotrymerycznego białka G oraz produkcji PIP₃ poprzez monitorowanie zmiany FRET oraz translokacji błonowej sondy PIP3, PH-GFP w komórkach G i PH, odpowiednio. B. Montaż obrazów tęczowych komórek G i PH pokazuje, że jednorodna stymulacja cAMP wywołuje trwałą aktywację białka G na obwodzie komórki, podczas gdy indukuje przejściową produkcję PIP3. Punkty czasowe obejmują stan przed stymulacją (0s) oraz po stymulacji w czasie 4,9s, 10,2s i 20,4s. C. Kinetyka aktywacji białka G i produkcji PIP3 po jednorodnej stymulacji cAMP.

Dyskusja

Procesy osiągania przez komórki stanu kompetencji chemotaktycznej

W przypadku komórek typu dzikiego D. discoideum potrzeba około 5 ˜ 6 godzin pulsacyjnego rozwoju w temperaturze pokojowej, aby wprowadzić je w stan pełnej kompetencji chemotaktycznej, podczas którego komórki wykazują wyraźną polaryzację morfologiczną oraz szybką migrację (Ryc. 1). Na proces osiągania stanu kompetencji chemotaktycznej może wpływać szereg czynników, takich jak stężenie cAMP podczas pulsacji, temperatura oraz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka wzrostowa D3-T	KD Medical
Kofeina	Sigma-Aldrich
Latrunkulina B	Molecular Probes, Life Technologies
Alexa 594	Molecular Probes, Life Technologies
cAMP	Sigma-Aldrich
Programowalny timer ChronTrol XT	ChronTrol Corp
Pompa perystaltyczna Miniplus 3	Gilbson
Platformowy wstrząsarkowy
Mikrokapilarne źródło ciśnienia FemtoJet	Eppendorf
Jedno- i czterodochowe komory z nakładką szklaną Lab-Tek II	Nalge Nunc international
Mikroskop fluorescencyjny LSM 510 META lub równoważny	Carl Zeiss, Inc.		obiektyw olejowy DIC Plan-Neofluar 40X 1.3 NA lub 60X 1.4 NA
Olympus X81 lub równoważny	Olympus Corporation		Wymagany obiektyw TIRF 100X 1.47 NA