In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Streszczenie

Źródło: Hancock, C. E. et al., Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

Protokół

1. Transgeniczne muszki owocowe, Drosophila melanogaster

1. Krzyżuj samice dziewic i samców much (hodowane w temperaturze 25 °C przy 60% wilgotności względnej w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności) niosące pożądane konstrukty Gal4 i UAS, odpowiednio, w celu wyprodukowania much, w których określone neurony zainteresowania wyrażają genetycznie zakodowany wskaźnik wapnia.
2. Żeńskie potomstwo powyższej krzyżówki należy postarzać do momentu, gdy znajdą się w przedziale 3-6 dni po eklozji. Samice much są preferowane ze względu na ich nieco większy rozmiar.

2. Przygotowanie muszki owocowej do obrazowania wapnia in vivo

1. Wybierz pojedynczą samicę muchy i znieczulaj ją na lodzie nie dłużej niż 5 minut.
2. Za pomocą cienkich kleszczyków umieść muchę w komorze obrazowania (pokazano na rysunku 1c). Upewnij się, że klatka piersiowa i nogi stykają się z przewodami elektrycznymi na dnie komory i że głowa leży płasko. Ustal pozycję rozporka za pomocą przezroczystej taśmy klejącej.
   nuta: Protokół ten wymaga specjalnie zbudowanej komory, w której muchy są zamocowane, z kapsułą głowy dostępną do otwarcia, a muchy mogą odbierać zarówno stymulację zapachową czułków, jak i wstrząsy elektryczne klatki piersiowej i nóg (ryc. 1).
3. Za pomocą ostrza skalpela chirurgicznego przymocowanego do rękojeści skalpela (patrz Tabela materiałów), wytnij okienko w taśmie wokół głowy muchy, pozostawiając zakryte czułki i odsłoniętą tylko najbardziej wysuniętą do przodu część klatki piersiowej.
4. Otocz boki i tył głowy klejem utwardzanym niebieskim światłem, ostrożnie manipulowanym za pomocą szpilki do owadów trzymanej przez wklęsło-wypukłe szczęki. Utrwal klej za pomocą lampy LED emitującej niebieskie światło.
5. Sprawdź, czy klej jest całkowicie związany i usuń resztki nieutwardzonego kleju z grzbietowej powierzchni głowicy muchy.
6. Nałóż kroplę roztworu Ringera (patrz Tabela Materiałów), aby pokryć odsłonięty naskórek głowy.
7. Za pomocą noża o bardzo cienkim ostrzu przetnij naskórek. Aby jak najskuteczniej usunąć naskórek, najpierw przetnij tylną część głowy, używając oczek jako punktu wyjścia. Następnie przetnij każdą stronę, przyśrodkowo do oczu, aby utworzyć płat naskórka, który można łatwo oderwać za pomocą kleszczy.
8. Usuń nadmiar naskórka, który może blokować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania.
9. Ostrożnie oczyść powierzchnię grzbietową tchawicy za pomocą cienkich kleszczy, unikając uszkodzenia samej tkanki mózgowej. Usuń i odśwież roztwór Ringera (patrz tabela materiałów) zgodnie z wymaganiami, aby oczyścić obszar z resztek tkanki.
10. Umieść igłę do dostarczania zapachu podskórnego w odległości około 1 cm od głowy muchy. Upewnij się, że nic nie utrudnia dostarczania zapachu do anten.
11. Pod mikroskopem podłączyć komorę obrazowania do systemu dostarczania zapachu za pomocą igły do dostarczania zapachu podskórnego.
12. Aby mucha mogła w pełni wyzdrowieć po znieczuleniu i operacji oraz dostosować się do przepływu powietrza, na tym etapie należy wprowadzić 10-minutowy okres odpoczynku.

3. Obrazowanie wapnia in vivo

1. Użyć mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień i obiektyw zanurzeniowy w wodzie (patrz Tabela materiałów), zainstalowanego na stole z izolacją drgań. W celu wizualizacji wskaźników wapnia opartych na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) należy dostroić laser do długości fali wzbudzenia 920 nm i zainstalować filtr pasmowo-przepustowy GFP.
2. Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej Z przeskanuj oś Z mózgu i zlokalizuj interesujący Cię obszar mózgu. Użyj funkcji kadrowania, aby ustawić ostrość skanowania tylko na tym obszarze, aby zminimalizować czas skanowania i obrócić widok skanowania tak, aby przednia część głowy była skierowana w dół.
3. Dostosuj rozmiar klatki do 512 x 512 px, prędkość skanowania do > 4 Hz i obszar skanowania (w wymiarze Y) tak, aby interesujące Cię neurony były zakryte.

4. Wizualizacja stanów przejściowych wapnia wywołanych zapachem poprzez warunkowanie węchowe

1. Użyj systemu dostarczania zapachów, który może dostarczyć kilka bodźców zapachowych w czasowo precyzyjny sposób.
   1. Użyj dodatkowego komputera do sterowania urządzeniem i do komunikacji z oprogramowaniem mikroskopu obrazowego, aby skoordynować stymulację zapachu z przechwytywaniem obrazu podczas eksperymentów.
   2. Zainicjuj wstępnie zaprogramowany pakiet makr zdolny do połączenia oprogramowania do akwizycji obrazu i programu dostarczania zapachu (np. pakiet makr VBA zainstalowany w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, patrz Tabela materiałów), który reaguje na zewnętrzny wyzwalacz wejściowy zapewniony przez zainicjowanie protokołu dostarczania zapachu w oddzielnym programie).
2. Rozpocznij pomiar od monitorowania "przed treningiem"/naiwnych stanów przejściowych wapnia wywołanych zapachem w rozdzielczości 512 x 512 px i częstotliwości odświeżania 4 Hz. Dostarcz 2,5-sekundowy bodziec zapachowy otoczony dodatkową akwizycją obrazu przez 6,25 s poprzedzający początek zapachu (w celu ustalenia wartości bazowej F₀) i 12,5 s po przesunięciu zapachu. Powtórz to z drugim środkiem zapachowym, a następnie z trzecim środkiem zapachowym.
3. Kontynuuj 3 minuty po tym pomiarze z klasycznym kondycjonowaniem ("treningiem") muchy.
   1. Wybierz jeden z zapachów prezentowanych w fazie "przedtreningowej", aby stał się zapachem bodźca kondycyjnego (CS⁺), a drugi, aby stać się zapachem CS^-. Prezentuj zapach CS⁺ za pomocą sterowanego komputerowo systemu dostarczania zapachów przez 60 sekund wraz z dwunastoma wstrząsami elektrycznymi 90 V.
   2. Po 60 s przerwie prezentuj sam zapach CS przez 60 s. Stosować jako substancje zapachowe 4-metylocykloheksanol i 3-oktanol. Nie należy podawać trzeciego środka zapachowego (np. 1-octen-3-ol) podczas tego treningu, ponieważ jest on stosowany tylko jako kontrola przed (krok 4.2.) i po (krok 4.4) fazie treningu.
4. Ponownie zmierz stany przejściowe wapnia wywołane zapachem "po treningu", powtarzając protokół stymulacji zapachu "przed treningiem" (krok 4.2.) 3 minuty po zakończeniu fazy treningu (krok 4.3).
   nuta: Czas wykonania tego kroku powinien odzwierciedlać interesujący czas po utworzeniu pamięci (np. wykonaj ten krok 3-4 minuty po etapie kondycjonowania, aby zbadać pamięć krótkotrwałą). Zazwyczaj muchy mogą przetrwać kilka godzin w tym preparacie.
5. Zapisz pliki obrazów w odpowiednim formacie (np. Tiff) do późniejszej analizy obrazu.

5. Analiza obrazu

1. Aby przeanalizować obrazy, otwórz pliki Tiff (lub podobne) w oprogramowaniu do analizy obrazów, takim jak Fidżi.
2. Wyrównaj stosy za pomocą algorytmu korekcji ruchu, aby zapewnić minimalny ruch w kierunkach X i Y. Odrzuć wszystkie nagrania, które pokazują silny ruch w osi Z.
3. Wybierz narzędzie programowe używane do oznaczania obszaru zainteresowania (ROI) wokół obszaru, który ma być badany. Powinno to być tak precyzyjne, jak to tylko możliwe, aby ograniczyć wpływ fluorescencji tła.
4. Użyj odpowiedniego narzędzia programowego, aby wyodrębnić dane o czasowej intensywności fluorescencji jako pliki danych z wybranego ROI, tak aby wartość została wygenerowana dla każdej klatki nagrania.
5. Otwórz dane za pomocą programu do analizy danych, aby obliczyć wartości ΔF/F₀ dla każdego śladu zapachu. F₀ = średnia fluorescencja w ciągu 2 s przed pojawieniem się zapachu. ΔF = różnica między surową fluorescencją w danej ramce a F₀. Na podstawie tych wartości oblicz wartość ΔF/F₀ dla każdej klatki, którą można wykreślić w funkcji czasu, aby odzwierciedlić względną fluorescencję przez cały okres bodźca zapachowego.

Wyniki

Ryc. 1: Budowa komory montażowej i przygotowanie muchy do obrazowania.a) Etapy budowy komory montażowej much. Podstawa składa się ze standardowego szkiełka mikroskopowego (1) pokrytego drobną siatką z tworzywa sztucznego (2). Dwa przewody elektryczne przenoszące przeciwstawne ładunki (3) są przyklejone do zamka po obu stronach. Przewody są zdejmowane i wyginane, aby przeciąć suwak (...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-okten-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	Numer telefonu O5284	Substancja chemiczna stosowana jako środek nawaniający
3-oktanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	218405	Substancja chemiczna stosowana jako środek nawaniający
4-metylocykloheksanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	153095	Substancja chemiczna stosowana jako środek nawaniający
Filtr pasmowo-przepustowy dla EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Niemcy
Przezroczysta taśma klejąca	Tesa SE, Norderstedt, Niemcy		Standardowa przezroczysta taśma klejąca
Szczęki wklęsło-wypukłe	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	Numer katalogowy 10053-09	Uchwyty ostrzy z wklęsło-wypukłymi szczękami
Cienkie kleszcze	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	Numer katalogowy: 11412-11	Kleszczyki z końcówką 0,1 x 0,06mm
Igła podskórna	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Niemcy	4665120	1,20x40mm
Szpilki do owadów Minutien	Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada	26002-10	Średnica 0,1 mm, końcówka 0,0125 mm
Przepływ Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, Wielka Brytania	953683	Niebieski klej światłoutwardzalny
Szkiełko mikroskopowe	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Niemcy	656,1	Standardowy szkiełko obiektywu 76 x 26 mm
olej mineralny	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał M8410	Stosowany jako rozcieńczalnik do substancji zapachowych
Laser Ti-Sapphire z blokadą trybu Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, Kalifornia, Stany Zjednoczone		Przestrajalny laser femtosekundowy na podczerwień
Mikroskop wielofotonowy LSM 7MP wyposażony w detektory BiG	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Niemcy		Mikroskop wielofotonowy, wiele firm dostarcza podobne urządzenia.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0) obiektyw zanurzeniowy w wodzie	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Niemcy	Numer telefonu 421452-9900-000	Obiektyw W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Rozwiązanie Ringera	nie dotyczy	nie dotyczy	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sacharoza, pH = 7,4
Nóż kłujący	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, Pensylwania, Stany Zjednoczone	72-1551	5,0 mm Prosta ograniczona głębokość ostrza
Ostrze skalpela chirurgicznego	Swann-Morton, Sheffield, Wielka Brytania	Rozdział 303	Nr produktu 11
Rękojeść do skalpela chirurgicznego	Swann-Morton, Sheffield, Wielka Brytania	Okręg wyborczy 907	Nr produktu 7S/S
Oprogramowanie Visual Basics of Applicatons (VBA) do odbierania wyzwalacza z urządzenia dostarczającego zapach i urządzenia aplikacyjnego do porażenia prądem (zasilacza) w celu interakcji z oprogramowaniem ZEN firmy Zeiss, które steruje mikroskopem.	Napisane na zamówienie i dostępne na życzenie	nie dotyczy	nie dotyczy

szt. szt. Rozdział TGL