Neuromodulacja indukowana ultradźwiękami za pomocą systemu mikroelektrod

Abstract

Źródło: Liang, R. et al., Focused ultrasound neuromodulation of human in vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrod Arrays. J. Vis. Exp. (2024)

Ten film demonstruje metodę indukowania modulacji aktywności neuronalnej w hodowanych ludzkich neuronach pochodzących z iPSC w wielodołkowym układzie mikroelektrod lub systemie MEA za pomocą skoncentrowanego przetwornika ultradźwiękowego.

Protocol

1. Przygotowanie materiałów

1. Odessać pożywkę hodowlaną i użyć jej do wypełnienia pojedynczego dołka w 24-dołkowej płytce do hodowli neuronów z wbudowanym układem mikroelektrod (MEA) (ryc. 1A).
2. Wysterylizuj interfejs parafilmu, gumkę i stożek zogniskowanych ultradźwięków (FUS) z gumową membraną przy użyciu 70% etanolu przez 10 minut i umieść je w dygestoriach w celu późniejszego montażu.
3. Odgazuj 300 ml wody dejonizowanej i 50 ml żelu sprzęgającego. Odwirować wodę i żel o sile 160 x g przez 5 minut, aby uniknąć indukowania kawitacji w medium sprzęgającym.
   nuta: Pierwotnym źródłem ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (HiPSC) są linie komórkowe GM01582 i CIPS. Średnio można osiągnąć gęstość 5 x 10⁴ neuronów ruchowych i 2,5 x 10⁴ astrocytów na studzienkę.

2. Podłączenie i konfiguracja urządzeń peryferyjnych

1. Przymocuj stożek FUS do przetwornika za pomocą i uszczelnij stożek elastyczną gumową membraną w wentylowanym, sterylnym kapturze. Napełnij stożek odgazowaną i zdejonizowaną (DG-DI) wodą z kroku 1.3 i upewnij się, że w stożku nie ma pęcherzyków, aby uniknąć kawitacji.
2. Użyj niestandardowego pręta gwintowanego, aby przymocować uchwyt wydrukowany w 3D do ramy (Rysunek 1B). Ustaw ramę tak, aby głowica przetwornika FUS znajdowała się nad studzienką, która będzie stymulowana.
3. Za pomocą gumki przymocować parafilm do dołka na 24-dołkowej płytce MEA zawierającej pożywkę i HiPSC.
4. Przygotuj system FUS, podłączając elektronikę sterownika końcowego przetwornika ultradźwiękowego, w tym przypadku wyjście mocy przetwornika (TPO), do gniazdka elektrycznego 100-240 V i podłączając pasującą sieć do TPO i przetwornika FUS. Dopasowana sieć zapewnia wydajne sprzężenie elektryczne między przetwornikiem a TPO.
5. Podłącz system MEA do gniazdka elektrycznego (100-240 V) (Rysunek 2B, Połączenie 5). Podłącz port synchronizacji systemu MEA do TPO (Rysunek 2B, Połączenie 3). To połączenie zsynchronizuje akwizycję danych przez system MEA ze stymulacją FUS.
6. Umieść 24-dołkową płytkę MEA w systemie MEA i zdejmij pokrywę, aby umożliwić bezpośredni kontakt między przetwornikiem a studzienką. Umieść przetwornik 5-10 mm nad płytą studzienki, aby zrobić miejsce na odgazowany żel sprzęgający, jak opisano w kroku 3.2 (rysunek 2A i rysunek 1B).

3. Stymulacja i akwizycja sygnałów neuronalnych

1. Ustaw parametry FUS na panelu sterowania TPO (Tabela 1).
2. Nałóż żel sprzęgający na wierzch parafilmu i opuść przetwornik FUS do żelu sprzęgającego, zapewniając kontakt z żelem przy minimalnych pęcherzykach powietrza (rysunek 1A).
3. Rozpocznij nagrywanie systemu MEA, klikając przycisk Start w interfejsie użytkownika.
4. Rozpocznij sonikację FUS, naciskając prawy dolny przycisk na TPO (Rysunek 2A, etykieta 7) i odczekaj co najmniej 5 minut między każdą rundą sonikacji, aby umożliwić neuronom powrót do stanu wyjściowego.
5. Użyj impulsu wyzwalającego generowanego przez system FUS, aby dostosować sekwencję stymulacji FUS do zapisu MEA (Rysunek 1B, Połączenie 3).

Tabela 1: Parametry zogniskowanego ultrasonografu (FUS) ustawione na TPO

parametr	wartość
Maksymalna moc/kanał	1.200 W
Fakty	0,749 W/kanał
Międzynarodowa Agencja Bezpieczeństwa (ISPPA)	10,79 W/cm2
Międzynarodowa Agencja Bezpieczeństwa (ISPTA)	0,05 W/cm2
Długość serii	0,100 ms
częstotliwość	250,00 kHz
ognisko	39.800 mm
okres	20.000 ms
minutnik	60.000 s

Results

Rysunek 1: Neuromodulacja FUS za pomocą wielodołkowego układu mikroelektrod (MEA). (A) Schemat układu do neuromodulacji FUS z wielodołkowym MEA. Fale akustyczne generowane przez przetwornik FUS rozchodzą się przez stożek FUS wypełniony odgazowaną wodą i są sprzężane za pomocą żelu ultradźwiękowego. Parafilm jest przymocowany do studni za pomocą gumowej opaski, aby zapobiec zanieczys...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
System MEA	Axion Biosystem Sp. z o.o.	Ostrze Maestro	Częstotliwość próbkowania: 11500 Hz
Płyta MEA	Axion Biosystem Sp. z o.o.	CytoView MEA	Elektroda i studzienka: 16 elektrod w 24 dołkach
Interfejs płytki studziennej	Amcor Inc.	Parafilm PM996; Zobacz materiał P7793	Grubość: 127 μm
Zbiornik CO2 i regulator do hodowli	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296NC (wersja angielska	Stężenie: 5%
Pożywki hodowlane	ThermoFisher Inc.	Laminina; 23017-015	Stężenie: 1 μg/ml
Neurony HiPSC	Peprotech	CIPS i GM01582 pochodne; 450-10	Stężenie: 10 ng/ml (patrz Taga i wsp. [2021]13)
przetwornik	Koncepcje dźwiękowe Inc.	CTX250; 008	Częstotliwość środkowa: 250 kHz
Pasująca sieć	Koncepcje dźwiękowe Inc.	CTX250; NFS102v2 (wersja angielska	Impedancja: 50 Ω
Moc wyjściowa przetwornika (TPO)	Koncepcje dźwiękowe Inc.	Wersja 4.1; 020	Częstotliwość: od 250 kHz do 2,5 MHz
błona	McMaster Inc.	Guma silikonowa; 5542N115	Grubość: 0,0127 cm
Żel sprzęgający	Parker Laboratory Inc.	Aquasonic 100; B08DDWG GXB	Lepkość: 130 000–185 000 policjantów
Podłączenie do uchwytu sondy	McMaster Inc.	Pręt gwintowany Steal; 90322A661	Długość: 1–1/2" długości
Hydrofon	Koncepcje dźwiękowe Inc.	Y-104; 009	Zakres: 50 kHz–1,9 MHz
Zbiornik na wodę	Koncepcje dźwiękowe Inc.	Wt	Wymiary: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Jednostka uzdatniania wody	Koncepcje dźwiękowe Inc.	WCU; Zobacz materiał SN006	Prędkość przepływu: maksymalnie 50 ml / s
Oscyloskop	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	Częstotliwość próbkowania: do 50 MHz
scena	Koncepcje dźwiękowe Inc.	Mikroetap; 2	Dokładność: 1 μm
Blacha termochromowa	TIPTEMP Sp. z o.o.	Blacha ciekłokrystaliczna; TLCSEN337	Zakres: 22–24 °C
komputer	Microsoft Surface	Surface Pro	Procesor i5 1035G4: 3,7 GHz
Oprogramowanie do przesyłania danych	Mathworks Inc.	MATLAB (MATLAB)	Wersja 2021b
Oprogramowanie do przetwarzania	Fundacja oprogramowania Python	pyton	Wersja 3.7.10