1. Konfiguracja przed nagraniami
- Przygotować roztwory rejestrujące o stężeniach jonów, jak wskazano w tabeli 1.
- Przygotować 15 ml 2 M roztworów podstawowych w wodzie ultraczystej dla MgCl2, CaCl2, KCl i CsCl.
- Zważyć składniki stałe dla 100 ml roztworów buforowych wewnątrzkomórkowych i 500 ml roztworów buforowych zewnątrzkomórkowych zgodnie z tabelą 1 do oddzielnych zlewek, a następnie dodać odpowiednią ilość przygotowanych roztworów podstawowych. Na przykład jako bufor wewnątrzkomórkowy użyj 0,3803 g (10 mM) EGTA (kwas tetraoctowy glikolu etylenowego), 0,2383 g (10 mM) kwasu HEPES(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego) i 0,6428 g (110 mM) NaCl i dodaj 100 μl 2 M MgCl2 i CaCl2 oraz 50 μl 2 M roztworów podstawowych KCl i CsCl.
- Dodaj ultraczystą wodę i ostrożnie dostosuj pH za pomocą kwasów i zasad, które nie zakłócają pomiaru, tj. nie są przeprowadzane przez ChR (rodopsyny kanałowe), takie jak kwas cytrynowy i N-metylo-D-glukamina (NMG+).
- Dostosuj osmolarność do 290 mOsm dla roztworów wewnątrzkomórkowych i do 320 mOsm dla roztworów zewnątrzkomórkowych z glukozą.
nuta: Lekko hipoosmotyczne roztwory wewnątrzkomórkowe zwiększają skuteczność łatania.
- Sterylne przefiltruj wszystkie roztwory przez filtry 0,22 μm. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie lub zamrażać w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
- Oblicz potencjały złączy cieczy i przygotuj protokoły zapisu.
UWAGA: Zmiana stężenia chlorku zewnątrzkomórkowego po ustaleniu konfiguracji całej komórki powoduje znaczny potencjał połączenia cieczy (LJP), który należy skorygować. LJP można bezpośrednio mierzyć lub obliczać, tutaj używana jest ta druga opcja. W tym protokole zostanie zastosowana korekta online, wymagająca jednego protokołu nagrywania dla każdego bufora zewnętrznego. Jednak w przypadku większego zestawu rozwiązań zewnętrznych zaleca się post-korektę LJP, aby uniknąć fałszywej korekty.
- Otwórz kalkulator potencjału skrzyżowania (JPC) i otwórz okno dialogowe "Nowy eksperyment". Następnie wybierz "Pomiary zacisku krosowego". Wybierz "pomiary całej komórki" i "Standardowa elektroda roztworu soli" i wprowadź temperaturę 25 °C. Pomiędzy każdym krokiem idź dalej, akceptując wybór, naciskając przycisk "dalej".
UWAGA: Eksperymenty wykonywane są w temperaturze pokojowej 25 °C w klimatyzowanym laboratorium. Upewnij się, że roztwory buforowe mają temperaturę pokojową przed rozpoczęciem eksperymentów. Aby zmienić temperaturę próbki, można użyć stopnia inkubacji lub komory. Temperaturę kąpieli można często mierzyć za pomocą termometru.
- Dodać wszystkie indywidualne stężenia anionów i kationów w odpipetowanym roztworze i buforze o wysokiej zawartości chlorków zgodnie ze stężeniami podanymi w tabeli 1.
nuta: JPC obliczy LJP na poziomie -0,5 mV dla warunków początkowych.
- Kliknij "Nowy roztwór do kąpieli", aby wprowadzić anionowy i kationowy skład buforu o niskiej zawartości chlorków.
nuta: JPC obliczy teraz nowy LJP na poziomie +12,6 mV zgodnie ze zmienionym rozwiązaniem do nagrywania zewnątrzkomórkowego.
- Przygotuj dwa protokoły z korektą LJP dla dwóch warunków pomiaru, odejmując obliczoną LJP od zastosowanego potencjału utrzymywania; -0,5 mV dla roztworów zewnętrznych o wysokiej zawartości chlorków i +12,6 mV dla roztworów zewnętrznych o niskiej zawartości chlorków. W związku z tym protokoły zaczynają się odpowiednio od -79,5 mV (wysoka zawartość chlorku) i -92,6 mV (niska chlorkowa), aby uzyskać skorygowany o LJP początkowy potencjał podtrzymania -80 mV w obu przypadkach.
nuta: Poniższe kroki dotyczą oprogramowania do akwizycji danych wymienionego w wykazie materiałów.
- Otwórz edytor protokołów w oprogramowaniu do akwizycji. Z menu "Tryb" wybierz "Stymulacja epizodyczna" i dołącz 7 przeciągnięć.
- Przełącz się na menu "Przebieg" w edytorze i uwzględnij okres 200 ms z potencjałem podtrzymania 0 mV, a następnie okres 2 s ze zmiennym potencjałem utrzymywania, zaczynając od -79,5 mV dla wysokiego chlorku. Uwzględnij "poziom delta" wynoszący 20 mV dla drugiego okresu, aby zwiększyć potencjał utrzymywania o 20 mV w każdym przebiegu.
- W krokach napięcia edytora przebiegów zastosuj 500 ms okresu oświetlenia światłem 540 nm (3.10 mW/mm²). W tym celu należy zmienić "cyfrowy wzorzec bitowy" podłączonej migawki, który steruje aktywnym źródłem światła 500 ms po drugim okresie opisanym powyżej (patrz 1.2.6).
nuta: Natężenie światła może wpływać na właściwości biofizyczne prądów kanałowych, takie jak amplituda lub inaktywacja. W związku z tym należy zawsze podawać gęstości mocy światła. Aby zmierzyć moc światła po przejściu przez wszystkie układy optyczne i szkiełko nakrywkowe, należy użyć skalibrowanego optometru. Aby obliczyć gęstość mocy, należy określić oświetlone pole obiektywu za pomocą mikrometru obiektowego i podzielić zmierzoną moc światła przez wyznaczone oświetlone pole.
- Zachowaj protokół dla roztworu zewnątrzkomórkowego o wysokiej zawartości chlorków. Zmodyfikuj protokół i zastąp potencjał utrzymywania pierwszego poziomu przez -92,6 mV (niski poziom chlorku zewnętrznego). Zapisz ten drugi protokół, aby zmierzyć stan zewnątrzkomórkowy o niskim poziomie chlorków.
- Powlekanie lizyną szklanych szkiełek nakrywkowych zgodnie z dostosowanym protokołem.
- Umieścić kilka 100 szkiełek nakrywkowych na szklanej szalce Petriego i dodać 250 ml HCl (1 N).
- Umieść szalkę Petriego z szkiełkami nakrywkowymi na wytrząsarce liniowej. Wstrząsaj z prędkością 120 obr./min przez 72 godziny, aby wyczyścić szkiełka nakrywkowe, a następnie spłucz ultraczystą wodą, aby zneutralizować pH.
- Namocz je w niewielkiej objętości 95% etanolu w celu dalszego czyszczenia.
UWAGA: Czyste szkiełka nakrywkowe można przechowywać w 70% etanolu przed kontynuowaniem. Pracuj pod okapem z przepływem laminarnym, aby wykonać następujące kroki.
- Za pomocą palnika Bunsena i pęsety wypal każde szkiełko nakrywkowe i przenieś je na nową szalkę Petriego.
- Szkiełka nakrywkowe inkubować w sterylnym roztworze poli-D-lizyny o stężeniu 50 μg/ml przez co najmniej 1 godzinę (lub przez noc) w temperaturze pokojowej, wytrząsając wytrząsarką liniową z prędkością 150 obr./min.
- Umyj szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą, aby usunąć nadmiar poli-D-lizyny.
- Rozłóż szkiełka nakrywkowe na sterylnym papierze do wyschnięcia na 10 minut i wystaw je na działanie światła UV (ultrafioletowego) w celu sterylizacji (co najmniej 20 minut).
- Zbierz szkiełka nakrywkowe na sterylną szalkę Petriego pokrytą folią aluminiową do czasu użycia.
- Przygotuj DNA genu PsACR1 połączonego z mCherry przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej.
- Sklonuj ludzką sekwencję genów kodującą PsACR1 do plazmidu peGFP-C1 (promotor CMV (wirus cytomegalii), oporność na kanamycynę) w ramce z fluoroforem mCherry przy użyciu enzymów restrykcyjnych lub innych ustalonych metod klonowania.
Uwaga: Można również użyć innych fluoroforów, ale upewnij się, że masz dostępne odpowiednie zestawy filtrów, aby obserwować ich fluorescencję pod mikroskopem w konfiguracji.
- Przekształć plazmidowe DNA w chemokompetentne komórki XL1Blue E. coli poprzez szok cieplny zgodnie ze standardowym protokołem i umieść je na płytkach agarowych (30 μg / ml kanamycyny). Wyhodować platerowane bakterie przez noc w temperaturze 37 °C.
- Następnego dnia zaszczepić 4 ml bulionu lizogenicznego uzupełnionego 30 μg/ml kanamycyny komórkami z pojedynczych kolonii i inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C i 180 obr./min w inkubatorze.
- Po całonocnej inkubacji należy oczyścić plazmidowe DNA z kultur za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.
- Zasiej komórki
UWAGA: Wykonaj czynności pod okapem z przepływem laminarnym.
- Umieść do trzech szkiełek nakrywkowych pokrytych lizyną obok siebie na szalce Petriego o średnicy 35 mm.
nuta: Delikatnie dociśnij je do dna naczynia, aby zapobiec ślizganiu się na siebie.
- Wysiew 1,5 x 105 komórek HEK (ludzkie embrionalne komórki nerkowe) w 2 ml standardowego Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w każdym naczyniu.
- Uzupełnij retinal all-trans w końcowym stężeniu 1 μM. Hoduj komórki przez co najmniej jeden dzień przed przystąpieniem do kroku 1.6.
- Przejściowo transfekuj komórki poprzez lipofekcję.
- Dla każdej płytki komórek przygotuj roztwór 2 μg plazmidowego DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego) w 250 μl DMEM bez FBS i 6 μl odczynnika do transfekcji.
- Po 15 minutach inkubacji delikatnie (kroplami) dodaj roztwór do komórek.
- Przygotuj mostki agarowe
- Dodać 0,75 g agarozy do 50 ml sterylnego roztworu chlorku sodu (140 mM) i rozpuścić przez podgrzanie w kuchence mikrofalowej.
UWAGA: 2 - 3 M KCl do przygotowania mostka agarowego dodatkowo zmniejsza LJP ze względu na wyższe stężenie (np. stała dyfuzja z mostka) i równą ruchliwość jonów K+ i Cl-, ale unikano go, aby zminimalizować wyciek jonów (zwłaszcza Cl-) do roztworu kąpieli.
- Napełnij 10 μl końcówek pipet (lub węża o małej średnicy) płynnym roztworem agarozy za pomocą strzykawki.
nuta: Unikaj pęcherzyków powietrza na moście.
- Po schłodzeniu i zestaleniu mostków agarowych należy je przechowywać w sterylnym roztworze chlorku sodu o stężeniu 140 mM.
- Przygotuj elektrody rejestrujące i do kąpieli.
- Wyjmij srebrne druty z wanny i elektrody rejestrującej z zestawu patch-clamp.
- Wypoleruj druty papierem ściernym, aby usunąć chlorek srebra z poprzednich eksperymentów. Zanurz czysty srebrny drut w 3 M KCl i podłącz go do dodatniego bieguna akumulatora 1,5 V w celu powlekania elektrolitycznego chlorkiem srebra.
UWAGA: Zamiast baterii można użyć zasilacza laboratoryjnego.
- Wyciągnij pipety krosowe o niskiej rezystancji (1,5-3,0 MΩ) ze szklanych kapilar za pomocą ściągacza do mikropipet i wypoleruj je ogniowo. Pipety należy przechowywać w miejscu wolnym od kurzu w dniu pomiaru.
- Włącz wszystkie elementy konfiguracji, aby nagrzać się do temperatury roboczej 30 minut przed nagraniami. Upewnij się, że mają temperaturę pokojową.
2. Pomiary selektywności
- Rozpocznij nagrania od 24 do 48 godzin po przejściowej transfekcji komórek.
- Umieść jedno szkiełko nakrywkowe w komorze pomiarowej i uszczelnij je silikonem, aby zapobiec wyciekowi zewnętrznego bufora. Przechowuj szalkę Petriego wraz z innymi szkiełkami nakrywkowymi w inkubatorze do następnego zestawu eksperymentów.
- Ostrożnie wypełnij komorę buforem zewnątrzkomórkowym (wysoki [Cl-]), aby zapobiec odłączaniu się komórek, a następnie umieść go pod mikroskopem i użyj obiektywu 40X do wizualizacji komórek.
- Umieść mostek agarowy na elektrodzie kąpieli i umieść go w komorze razem z czujnikiem poziomu płynu i wylotem perfuzji osoby do obsługi wanny.
- Roztwór zewnątrzkomórkowy należy wymienić dwukrotnie z 1 ml świeżego roztworu zewnętrznego (o wysokiej zawartości [Cl-]) w celu usunięcia pozostałej pożywki hodowlanej i oderwanych komórek.
- Ustaw ostrość komórek i poszukaj transfekowanej (fluorescencyjnej) komórki, którą należy wyizolować od innych komórek. Użyj trzypasmowego zestawu filtrów i pomarańczowego światła (590 nm; szerokość pasma 15 nm; 100% intensywności), aby wzbudzić i uwidocznić mCherry.
nuta: Ogniwa HEK mogą być elektrycznie sprzężone ze swoimi sąsiadami za pomocą złączy szczelinowych, co skutkuje niską rezystancją błony w konfiguracji całego ogniwa.
- Napełnij jedną z wyciągniętych pipet roztworem wewnątrzkomórkowym i usuń pęcherzyki powietrza, kilkakrotnie obracając pipetę.
- Zamontuj pipetę na uchwycie pipety i zastosuj pewne nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu końcówki.
- Umieść końcówkę pipety z plastrem pod mikroskopem i przesuń ją blisko kuwety za pomocą mikromanipulatora.
nuta: Poniższe kroki dotyczą wzmacniacza, oprogramowania do akwizycji i oceny danych wymienionego w liście materiałów.
- Uruchom "test membranowy" w oprogramowaniu do akwizycji danych i zastosuj krok napięcia (impuls testowy; np. 5 mV przez 10 ms, linia bazowa przy 0 mV), ręcznie lub automatycznie za pomocą określonego oprogramowania w trybie "kąpielowym" podczas uruchamiania "testu membranowego" w oprogramowaniu do akwizycji danych.
- Sprawdź, czy rezystancja pipety mieści się w żądanym zakresie (1,5-3,0 MΩ).
- Zerowanie prądów przesunięcia poprzez regulację potencjału pipety poprzez przekręcenie pokrętła przesunięcia pipety na wzmacniaczu podczas pracy w "trybie kąpielowym" "testu membranowego".
- Ustanów poprawkę w konfiguracji całej komórki.
UWAGA: Poniższe kroki wymagają zastosowania nadciśnienia i podciśnienia doprowadzonego do bocznego portu używanego uchwytu na pipety. Można to zrobić za pomocą strzykawki, ustnika lub elektronicznie sterowanego regulatora ciśnienia. W tym protokole nadciśnienie i podciśnienie jest przykładane za pomocą ustnika.
- Powoli zbliżaj się do celi z pipetą plastrową od góry i zmniejsz dodatnie ciśnienie tuż przed jej dotknięciem.
UWAGA: Gdy końcówka znajdzie się blisko ogniwa, opór nieznacznie wzrośnie; Wskazuje na to zmniejszony rozmiar impulsu testowego.
- Zmień "test membranowy" z "trybu kąpieli" na "tryb łatowy", a tym samym potencjał utrzymywania do oczekiwanego potencjału spoczynkowego komórek (od -30 do -40 mV).
- W niektórych przypadkach konfiguracja przyłączona do ogniwa tworzy się sama po zwolnieniu nadciśnienia. Jeśli nie, delikatnie zastosuj podciśnienie, aby wspomóc tworzenie gigaseal.
nuta: Konfigurację przyłączoną do ogniwa ustala się, gdy impuls testowy jest zredukowany do dwóch małych pików pojemnościowych na początku i na końcu impulsu, a rezystancja membrany mieści się w zakresie GΩ; Ujemne napięcia do -60 mV mogą ułatwiać tworzenie gigaseal .
- Skompensuj pojemność pipety, obracając pokrętła "kompensacja pojemności pipety", aby uzyskać płaską odpowiedź impulsu testowego.
- Zerwij łatkę bez niszczenia uszczelki, stosując krótkie impulsy podciśnienia lub podciśnienia o rosnącej sile, aby uzyskać konformację całych komórek.
nuta: Pomyślne przejście z konfiguracji przyłączonej do całej komórki jest wskazywane przez wzrost pików pojemnościowych.
- Zastosuj szeregową kompensację rezystancji, ustawiając parametry całego ogniwa i regulacje kompensacji zastosowanego wzmacniacza w celu dokładnego zaciśnięcia potencjału membrany do żądanego napięcia podtrzymania.
- Przełącz "test membranowy" w tryb "całego ogniwa", w panelu "Kompensacja rezystancji szeregowej" włącz "predykcję" i "korekcję" do 90% unikając przekroczeń i oscylacji odpowiedzi pojemnościowej, włącz przełącznik kompensacji całego ogniwa i wyreguluj parametry całego ogniwa za pomocą odpowiednich pokręteł na panelu przednim ("pojemność całego ogniwa" i "rezystancja szeregowa") wzmacniacza w sposób iteracyjny, aby uzyskać idealnie Reakcja na uszczelkę testu płaskiego.
nuta: Szczegółowy opis kompensacji i korekcji rezystancji szeregowej można znaleźć w instrukcji obsługi lub wytycznych wzmacniacza, ponieważ ta procedura różni się w zależności od producenta.
- Po ustaleniu konfiguracji całej komórki należy odczekać co najmniej 2 minuty przed zapisem, aby zapewnić wystarczającą wymianę roztworu wewnątrzkomórkowego przez pipetę z plastrem.
- Rejestruj prądy indukowane światłem o różnych potencjałach utrzymywania, korzystając z protokołów, które zostały wcześniej ustawione (w 1.2).
- Wymienić bufor zewnątrzkomórkowy na niski poziom [Cl-] w komorze co najmniej pięć razy bez niszczenia łaty i zapisać inną zależność prąd-napięcie (patrz krok 1.2) przy nowym stężeniu chlorków.
nuta: System perfuzyjny do automatycznej wymiany ułatwia ten proces, ale nie jest konieczny.
- Powtórzyć ppkt 2.15 dla każdego badanego stanu jonowego, ale wielokrotnie sprawdzać jakość łaty między pomiarami za pomocą "testu membranowego" opisanego powyżej.
nuta: Aby zagwarantować dokładne napięcie błony i stabilny wewnątrzkomórkowy skład jonowy, rezystancja błony powinna wynosić powyżej 500 MΩ, natomiast rezystancja dostępu nie powinna przekraczać 10 MΩ, patrz 2.12.6). Nie zapomnij wyłączyć kompensacji parametrów całej komórki dla testu membranowego.
- Powtórzyć czynności opisane w ppkt 2.2-2.15 dla kilku komórek, ale w celu zapewnienia zdrowotności komórek należy pobrać nowy szkiełko nakrywkowe.
Tabela 1: Skład jonowy roztworów buforowanych. Skład wewnątrzkomórkowych (wewnątrzkomórkowych) i zewnątrzkomórkowych (ekstra.) do eksperymentów selektywności chlorkowej w komórkach HEK. Stosowane skróty: kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA), kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) i asparaginian (ASP). Wszystkie stężenia podane są w mM.
szt.
szt.
| Wewnątrz. | dodatkowy.1 | dodatkowy.2 |
| Wysoka zawartość chlorków | niska zawartość chlorków | niska zawartość chlorków |
| c [mM] | c [mM] | c [mM] |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| Zawartość NaCl | Rozdział 110 | 140 | 0 |
| Kcl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | cyfra arabska | cyfra arabska | cyfra arabska |
| MgCl2 | cyfra arabska | cyfra arabska | cyfra arabska |
| HEPESY | 10 | 10 | 10 |
| EGTA (EGTA) | 10 | 0 | 0 |
| ph | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| osmolarność | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |