Perforowane nagrania patch-clamp ciał komórek neuronów czuciowych ucha wewnętrznego

Streszczenie

Źródło: Iyer, M. R., et al. Izolowanie i hodowla somatów przedsionkowych i spiralnych od noworodków gryzoni do nagrań patch-clamp. J. Vis. Exp. (2023).

Ten film demonstruje technikę patch-clamp do pomiaru prądów jonowych w ciałach komórek neuronów czuciowych ucha wewnętrznego. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie i użycie polerowanej pipety z zaciskiem krosowym wypełnionej wewnętrznym roztworem zawierającym amfoterycynę B, która perforuje błonę, aby umożliwić ruch jonów przy jednoczesnym zachowaniu warunków wewnątrzkomórkowych. Impulsy napięciowe są stosowane do wyzwalania i rejestrowania aktywności kanałów jonowych, zapewniając wgląd w ich właściwości i zachowanie.

Protokół

1. Nagrywanie

UWAGA: W tej procedurze, nagrania patch-clamp z izolowanego ganglionu są zazwyczaj wykonywane 12-24 godziny po posiewie. Inne laboratoria doniosły o wynikach neuronów po znacznie dłuższych okresach w hodowli.

1. Przygotowanie komory nagraniowej
   1. Użyj komory zapisowej z szybką wymianą (lub jej odpowiednika), która pozwala na nagrywanie z zaciskiem krosowym bezpośrednio w naczyniu hodowlanym. Ustaw komorę na odwróconym mikroskopie.
   2. Włóż naczynia hodowlane ze szklanym dnem do komory.
   3. Wprowadzić roztwór L-15 przez system rurek perfuzyjnych do komory rejestracyjnej. Ustabilizować dopływ i odpływ perfuzji w komorze z szybkością 0,5-1 ml na minutę.
2. Przygotuj roztwór wewnętrzny do ładowania elektrod
   1. Rozmrozić podwielokrotność roztworu wewnętrznego z perforowaną łatą. Umieścić 2,5 ml roztworu na naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm. Załóż pokrywkę na naczynie hodowlane i oznacz jako "Tip Dip". Odstawić w strefie wolnej od kurzu, ponieważ bardzo ważne jest, aby utrzymać ten roztwór w jak największej czystości.
   2. Odważyć 1 mg amfoterycyny-B i dodać 20 μl dimetylosulfotlenku (DMSO). Zwirować i odwirować roztwór, aż cała amfoterycyna-B znajdzie się w roztworze. Dodać 10 μl roztworu DMSO/amfoterycyny-B do pozostałych 2 ml rozmrożonego roztworu wewnętrznego z perforowaną łatą. Pobrać i rozproszyć roztwór pipetą dwa lub trzy razy, aby upewnić się, że DMSO/amfoterycyna-B równomiernie zmieszała się z roztworem wewnętrznym. Roztwór będzie miał łagodnie żółtawy odcień.
   3. Pobrać roztwór wewnętrzny z plastrem perforowanym amfoterycyny-B do strzykawki o pojemności 3 ml. Dodać końcówkę 34 G do strzykawki. Owinąć strzykawkę folią aluminiową i trzymać strzykawkę na lodzie.
      nuta: Roztwór ten należy przygotowywać co 2 godziny, aby zapewnić skuteczność amfoterycyny-B w perforacji błony komórkowej. Amfoterycyna-B jest wrażliwa na światło i musi być osłonięta przed światłem za pomocą folii aluminiowej lub innych metod.
3. Nagrania z użyciem patch-clamp
   1. Wizualizuj neurony za pomocą obiektywu 10x lub 20x. Dostosuj oświetlenie i zoptymalizuj optykę, aby zobaczyć granice i cienie wokół komórki.
   2. Sprawdź jakość izolowanych neuronów. Próbuj tylko neuronów o gładkich i równych powierzchniach, które nie są zbyt mocno skontrastowane i mają tylko małe, rozproszone kratery. Upewnij się również, że unikasz par neuronów, neuronów otoczonych gruzem lub innych komórek.
   3. W 100-krotnym powiększeniu zidentyfikuj neuron lub pole neuronów do załatania i ustaw je w środku pola widzenia.
   4. Napełnij końcówkę pipety czystym roztworem, który nie zawiera amfoterycyny, zanurzając końcówkę (na ~20 s) w czystym roztworze, który został umieszczony w naczyniu hodowlanym. Działanie kapilarne wciągnie niewielką ilość roztworu do końcówki.
      nuta: Wykonaj ten krok pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym, który pozwala określić, jak dobrze końcówka utrzymuje roztwór do zanurzania końcówki. Jeśli roztwór nie utrzymuje się przez ~10-20 s, kształt elektrody nie jest idealny. W takim przypadku zmień konfigurację programu wyciągania elektrody, aby uzyskać dłuższą końcówkę.
   5. Następnie napełnij tylną część pipety roztworem wewnętrznym zawierającym amfoterycynę. Filament w pipecie będzie pobierał roztwór, aby spotkać się z czystym roztworem w końcówce. Pozwól, aby filament płynnie ściągnął roztwór w dół i nie próbuj wystukiwać pęcherzyków, ponieważ spowoduje to zbyt szybkie zmuszenie amfoterycyny do dotarcia do końcówki.
   6. Użyj strzykawki, aby pobrać roztwór, który może znajdować się na samym końcu elektrody.
      nuta: Bardzo ważne jest, aby pracować szybko od tego punktu do lądowania i utworzyć uszczelnienie o wysokiej odporności na żądanym ogniwie.
   7. Włóż pipetę do uchwytu na pipety. Sprawdź, czy pipeta jest dobrze dopasowana do uchwytu, aby zapobiec dryfowaniu pipety. Jeśli pipeta nie jest stabilna, należy wymienić pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym z przodu i z tyłu uchwytu pipety, aby zminimalizować dryft i utrzymać silne ssanie. Wymień pipetę na świeżo napełnioną.
   8. Opuścić pipetę do kąpieli komory nagrywającej.
   9. Umieść końcówkę pipety pośrodku pola view. Upewnij się, że końcówka jest wolna od pęcherzyków powietrza lub innych zanieczyszczeń.
   10. Zastosuj krok napięcia (5 mV) w teście membranowym, aby monitorować rezystancję pipety. Kontynuuj monitorowanie rezystancji wejściowej przez cały proces tworzenia uszczelki na ogniwie.
   11. Anuluj potencjał przesunięcia pipety w taki sposób, aby prąd pipety wskazywał zero w trybie testu membranowego pClamp.
   12. Skoryguj pojemność pipety za pomocą funkcji szybkiej kompensacji pojemności na wzmacniaczu patch-clamp (szybkie wybieranie Cp na miękkim panelu Multiclamp Commander).
   13. Przesuń pipetę w dół do kuwe.
   14. Gdy pipeta znajdzie się wystarczająco blisko neuronu, przełącz się na obiektyw o wyższym powiększeniu i wyślij obraz przez kamerę do monitora (użyj obiektywu 40x, całkowite powiększenie 400x). Wyreguluj pipetę i ponownie wyśrodkuj neuron.
   15. Przesuń elektrodę rejestrującą bliżej somy. Zlokalizuj środek neuronu na monitorze i umieść elektrodę rejestrującą nad neuronem.
   16. Podejdź do neuronu od góry, tak aby elektroda wylądowała w środku kulistej komórki. Wyreguluj przesunięcie pipety, aby wyzerować stałe potencjały prądu stałego w systemie.
   17. Umieść pipetę blisko membrany. Wyląduj mocno na środku komórki.
       nuta: Podczas lądowania nastąpi niewielkie wgłębienie na powierzchni neuronu i podwojenie/potrojenie oporu wejściowego.
   18. Zastosować podciśnienie (ssanie) za pomocą strzykawki lub pipety doustnej. Włącz potencjał podtrzymania -60 mV. Rezystancja uszczelnienia powinna wzrastać, aż przekroczy giga-om.
       nuta: Pracuj szybko, aby skrócić czas między napełnieniem elektrody a wylądowaniem na ogniwie. Istnieje ograniczony czas, zanim amfoterycyna dodana do roztworu wewnętrznego z plastrem perforowanym dotrze do końcówki elektrody. Gdy końcówka jest zanieczyszczona amfoterycyną, trudno jest utworzyć uszczelki o wysokiej wytrzymałości, a rezystancja często utrzymuje się na poziomie ~200 megaomów.
   19. Gdy utworzy się uszczelka giga-omowa, zwolnij podciśnienie. Gdy tylko uszczelka się uformuje, zastosuj szybką kompensację pojemności, aby maksymalnie zmniejszyć amplitudę stanów przejściowych pojemności pipety w trybie testu membranowego.
   20. Gdy amfoterycyna zaczyna działać, obserwuj, jak rezystancja wejściowa powoli maleje, a prąd płynący w odpowiedzi na krok napięcia 5 mV stopniowo wzrasta, gdy amfoterycyna dostaje się do membrany. Nagły spadek oporu szeregowego zamiast stopniowej stabilizacji sugeruje, że doszło do samoistnego zerwania.
   21. Oszacuj pojemność całego ogniwa i rezystancję szeregową za pomocą pojemnościowej funkcji zerowania stanów przejściowych wzmacniacza. Dokumentuj i monitoruj rezystancję szeregową na początku eksperymentu i regularnie w jego trakcie.
       nuta: Stabilizacja rezystancji szeregowej może trwać od 5 do 20 minut, w zależności od rozmiaru elektrody i ilości czystego roztworu wciąganego do pipety. Tryby cęgów napięciowych i cęgów prądowych mogą być używane, gdy rezystancja szeregowa ustabilizuje się poniżej 30 megaomów. Czasami obserwuje się pęcznienie lub kurczenie się neuronów podczas nagrywania, ale rzadko, gdy osmolarność i pH roztworów są prawidłowo dostosowane.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Amfoterycyna	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	Do perforowanych nagrań łatek.
ATP dwusodowy	Sigma-Aldrich	A7699	Dodatek do roztworu wewnętrznego
CaCl2	J.T. Bakera	Numer katalogowy 1311-01	Dodatek do roztworu wewnętrznego
Dmso	Biot	Numer katalogowy 90082
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396	Dodatek do roztworu wewnętrznego
Ściągacz elektrod	Narashige powiedział:	Komputer PC-10
etanol	Laboratoria Decon	2716	do czyszczenia głowicy i okolic ławki sekcyjnej
Kapilary borokrzemianowe z włókien do elektrod	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał BF140-117-10
HEPESY	Sigma-Aldrich	H3375-100G	do buforowania pH wszystkich roztworów w protokole
Mieszadła z płytą grzejną / magnetyczne	Firma VWR	Nr kat. 76549-914
K2SO4, siarczan potasu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P9458-250G	Dodatek do roztworu wewnętrznego
Kcl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P93333	Dodatek do roztworu wewnętrznego
KOH (1 m)	Honeywell	319376-500ML	Aby doprowadzić roztwór wewnętrzny do pożądanego pH.
Niskoprofilowa komora rejestrująca kąpiel do naczyń hodowlanych	Instrumenty Warnera	Numer katalogowy: 64-0236
MgCl2-sześciowodny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M1028	Dodatek do roztworu wewnętrznego
Igła microFil do napełniania mikropipet - rozmiar 34	Światowe instrumenty precyzyjne	MF34G (Drukarka MF34G
Mikrokuźnia	Narashige powiedział:	MF-90	Do polerowania elektrod.
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7653	Dodatek do roztworu wewnętrznego
NaOH (1 m)	Thomas Naukowy	319511-500ML	do miareczkowania pH
Tlen, klasy medycznej, z odpowiednim regulatorem i rurkami	Gospodarka materiałowa USC	MEDOX200 (Identyfikator: 00015)	do rozpuszczania w roztworach preparacyjnych i kąpielowych
Szkło pokryte poli-d-lizyną z dnem danie hodowlane	Mattek powiedział:	Zobacz materiał P35GC-0-10-C	do płytki neuronów do hodowli
Filtry membranowe PES, 0,2 mikrometra	Nalgene powiedział:	566-0020	do roztworów filtrujących
Sterylne filtry strzykawkowe z membraną PES, 0,22 um, 30 mm	CELLTREAT	229747	do filtrowania roztworów pobieranych do strzykawek
pH-metr	METTLER TOLEDO	modelu S20
Komórka odniesienia	Światowe instrumenty precyzyjne	Zobacz materiał RC1T
Skala naukowa	METTLER TOLEDO	Zobacz materiał XS64
Kolba miarowa, 1000 mililitrów
Woda, sterylna, R>18,18 megaOhms cm (np. filtrowana przez system oczyszczania wody Millipore-Sigma)	Millipore-Sigma	CDUFBI001