Zapis sparowanych połączeń neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu

Streszczenie

Źródło: Qi, G., et al. Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film demonstruje procedurę mapowania połączeń synaptycznych poprzez zabezpieczenie wycinka mózgu, ustawienie pipet w celu uzyskania konfiguracji całych komórek i stymulowanie neuronów presynaptycznych do rejestrowania odpowiedzi postsynaptycznych, wyjaśniając w ten sposób łączność neuronalną.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Zapis sparowany patch-clamp i wypełnienie biocytyną

W zależności od rodzaju połączenia synaptycznego, stosuje się trzy różne podejścia do znajdowania neuronów sprzężonych synaptycznie. Jeśli prawdopodobieństwo połączenia jest niskie (czego można się spodziewać w przypadku większości połączeń pobudzających), postępuj w następujący sposób:

1. Połączenia neuronalne o niskiej łączności
   1. Napełnić pipety z plastrami roztworem wewnętrznym o składzie wymienionym w tabeli 1. W przypadku wszystkich zapisów w konfiguracji całokomórkowej dodać biocytynę w stężeniach od 3 do 5 mg/ml do roztworu wewnętrznego (pipety), aby uzyskać dobre wyniki barwienia neuronów pre- i postsynaptycznych. Pozwól biocytynie dyfundować do komórki przez co najmniej 15 - 30 minut (w zależności od wielkości neuronu).
      UWAGA: Nie należy dodawać biocytyny do roztworu używanego w pipetach "poszukiwawczych" wymienionych poniżej.
   2. Załataj domniemany neuron postsynaptyczny w trybie całej komórki. Używaj pipet z długim i smukłym trzonkiem. Ułatwia to manewrowanie pipetą pod obiektywem i zmniejsza artefakty ruchu, które mogą wystąpić po wprowadzeniu elektrody do plastrów.
   3. Następnie należy załatać potencjalny neuron presynaptyczny w konfiguracji przyłączonej do komórki za pomocą "poszukiwawczej" pipety do łatania o rezystancji 8-10 MΩ i małej średnicy końcówki. Pipety te tworzą "luźny" plaster przyczepiony do komórek. Napełnij pipetę "poszukiwawczą" wewnętrznym roztworem, w którym K⁺ jest zastąpiony przez Na⁺ (Tabela 2), aby zapobiec depolaryzacji neuronów podczas poszukiwania komórki presynaptycznej.
      UWAGA: "Luźna" rezystancja uszczelnienia nie mieści się w zakresie GΩ, ale zwykle wynosi około 30 - 300 MΩ.
   4. Utrzymuj potencjał membrany pod "luźnym" uszczelnieniem na poziomie około -30 do -60 mV w obecnym trybie cęgowania. Następnie zastosuj duże impulsy prądowe (0,2 - 2 nA), aby wywołać potencjał czynnościowy w potencjalnej komórce presynaptycznej. Obserwuj ten potencjał czynnościowy jako mały kłosek na odpowiedzi napięciowej.
   5. Ustaw częstotliwość stymulacji na 0,1 Hz, aby zapobiec pogorszeniu się odpowiedzi postsynaptycznej. Stosuj niższe częstotliwości stymulacji, jeśli tkanka mózgowa jest bardzo niedojrzała lub połączenie synaptyczne nie jest zbyt niezawodne.
   6. W przypadku, gdy neuron "postsynaptyczny" nie reaguje na stymulację badanego neuronu "presynaptycznego", należy załatać nowy neuron w trybie "luźnego" uszczelnienia. Nie należy wymieniać elektrody krosowej "poszukiwawczej", dopóki ustalona jest uszczelka o rezystancji >30 MΩ. W ten sposób przetestuj do 30 potencjalnie presynaptycznych neuronów.
      nuta: Aby zapobiec uszkodzeniu neuronu podczas procedury wyszukiwania za pomocą luźnego zacisku krosowego, do pipety poszukiwawczej należy stosować tylko delikatne ssanie, w przeciwieństwie do pipety z łatą na całe komórki.
   7. Jeśli stymulacja w trybie "luźnego" uszczelnienia powoduje EPSP/IPSP (pobudzający potencjał postsynaptyczny/hamujący potencjał postsynaptyczny) z opóźnieniem <5 ms w neuronie postsynaptycznym, wyjmij pipetę "poszukiwawczą" z neuronu presynaptycznego.
   8. Zastąp pipetę z plastrem "poszukiwawczym" elektrodą wypełnioną zwykłym roztworem wewnętrznym zawierającym biocytynę. Upewnij się, że ta pipeta krosowa do nagrywania ma rezystancję 4 - 8 MΩ; Im większy rozmiar SOMA, tym niższa może być rezystancja elektrody.
   9. Załataj neuron presynaptyczny i zapisz w trybie cęgowym całej komórki. Wywołaj potencjały czynnościowe przez wstrzyknięcie prądu do neuronów presynaptycznych i zarejestruj odpowiedź postsynaptyczną. Przechowuj dane na komputerze w celu późniejszej analizy w trybie offline.

Tabela 1. Roztwór pipety o niskiej zawartości chlorków.

TGL TGL pkt. jezdnego pkt. pkt. pkt. pkt.

	Mm	g/L	g/50 ml
K-glukonian	135 Rozdział 135	Rozdział 31 622	Numer katalogowy: 1,5811
Kcl	4	0,298	0,0149
HEPESY	10	2,384	0,1192
Fosfokreatyny	10	2,552	0,1276
ATP-Mg2+	4	2,028	0,1014
GTP-NA	0,3	0,156	0,0078
Dostosuj pH do 7,3 za pomocą KOH
Osmolarność ~300 mOsmol/L
Dodaj 3 - 5 mg/ml biocytyny

Tabela 2. Roztwór pipety o wysokiej zawartości Na do wyszukiwania neuronów sprzężonych synaptycznie.

Rozdział pkt. pkt. pkt. pkt. jezdnego pkt. pkt. pkt. pkt.

	Mm	g/L	g/50 ml
Na-glukonian	105	Godzina 22,92	1,146
Zawartość NaCl	Rozdział 30	1,76	0,088
HEPESY	10	2,384	0,1192
Fosfokreatyny	10	2,552	0,1276
ATP-Mg2+	4	2,028	0,1014
GTP-NA	0,3	0,156	0,0078
Dostosuj pH do 7,3 za pomocą NaOH
Osmolarność ~300 mOsmol/L

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
wzmacniacz	HEKA powiedział:	EPC 10 USB Potrójny	z 2-3 przedwzmacniaczami
mikroskop	Olympus	BX51WI	z 2 portami kamery i obiektywem 4×, obiektyw zanurzony w wodzie 40×
kamera	TILL Fotonika	VX55 Zobacz materiał VX55	kamera CCD na podczerwień
stacja robocza	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	z zmotoryzowanym stolikiem XY i zmotoryzowaną osią ostrości do mikroskopu
Mikromanipulator	Luigs & Neumann	Zobacz materiał SM-5	Manipulatory X-Y-Z na 2-3 przedwzmacniacze
Klatka Faradaya	Luigs & Neumann
Stół antywibracyjny	Newport Spectra-Fizyka
Mistrz Łat	HEKA powiedział:
Mikrotom	Microm Międzynarodowa	HM650V
Ściągacz do mikropipet	HEKA powiedział:	Sutter P-97
System Neurolucida	Mikrojasne pole		z oprogramowaniem Neurolucida i Neuroexplorer