Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etyki zwierząt.
1. Nagrania z zaciskiem krosowym
- Umieścić roztwór elektrody (patrz Tabela 1) na lodzie, aby zapobiec degradacji. Napełnij pipetę ze szklanym plastrem przefiltrowanym roztworem wewnątrzkomórkowym (filtr strzykawkowy, wielkość porów: 0,2 μm) i umieść pipetę w uchwycie na pipety stopnia głównego. Delikatnie wycisnąć pipetę za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml, przesuwając tłok o około 1 ml przed opuszczeniem pipety do roztworu do kąpieli.
Uwaga: Zapobiega to zablokowaniu pipety.
- Wybierz tryb "V-clamp", obracając pokrętło trybu na amplifier, a następnie otwórz interfejs "Test membrany" w oprogramowaniu. Przesunąć pipetę bliżej docelowego neuronu pod kontrolą mikroskopu.
nuta: W nienaruszonym preparacie DRG cienka warstwa satelitarnych komórek glejowych otacza każdy neuron.
- Użyj dodatniego ciśnienia z pipety, aby przejść przez warstwę komórek glejowych satelitarnych, aż do momentu zaobserwowania nagłego powiększenia przestrzeni między neuronem a otaczającą warstwą satelitarnych komórek glejowych. Przesuwaj pipetę w kierunku neuronu, aż zaobserwujesz "wgłębienie" w neuronie.
nuta: W porównaniu z zapisami z odłączonych neuronów, dodatnie ciśnienie musi być nieco większe, co pomoże przeniknąć do warstwy komórek glejowych satelity i zwiększy szanse na udane łatanie.
- Zmniejsz nadciśnienie. Następnie uzyskaj uszczelnienie giga omów z delikatnym ssaniem.
nuta: Dzięki tej metodzie wskaźnik powodzenia nagrywania wynosi co najmniej 70%.
- Uzyskaj konfigurację nagrywania całej komórki zgodnie z wcześniejszym opisem.
- Krótko przenikaj przez błonę komórkową neuronu poprzez krótkie, ale silne ssanie. Alternatywnie, użyj amplifier funkcja "zap" podczas zasysania.
- Po ustaleniu trybu całego ogniwa skompensuj pojemność całego ogniwa i rezystancję szeregową (Rs), obracając pokrętła kompensacji pojemności i rezystancji na amplifier.
nuta: Rs wynosi zwykle 5-20 MΩ.
- Porzuć komórkę, jeśli Rs jest początkowo większe niż 30 MΩ lub zmienia się o więcej niż 20% podczas nagrywania. Zmierz również spoczynkowy potencjał błony; porzuć komórkę, jeśli jest większa niż -50 mV.
- Zamknij okno "Test membranowy". Wybierz tryb "I-clamp normal", obracając pokrętło trybu na amplifier.
- Kliknij "otwórz protokół" w oprogramowaniu, wybierz i załaduj protokół do pomiaru reobazy. Kliknij "nagraj", aby rozpocząć nagrywanie. Zmierz rezystancję wejściową i reozasadę, aby zbadać pobudliwość neuronów, wstrzykując stopniowaną serię prądów depolaryzujących w krokach co 100 pA.
- Kliknij "otwórz protokół" w oprogramowaniu, wybierz i załaduj protokół do pomiaru reobazy. Kliknij "nagraj", aby rozpocząć nagrywanie. Zmierz rezystancję wejściową i reozasadę, aby zbadać pobudliwość neuronów, wstrzykując stopniowaną serię prądów depolaryzujących w krokach co 100 pA.
- Użyj oprogramowania do akwizycji i analizy danych (np. Clampfit), aby przeanalizować zarejestrowane ślady zgodnie z instrukcjami producenta. Oprogramowanie oblicza rezystancję wejściową (Rin) na podstawie relacji I-V w stanie ustalonym podczas dostarczanych prądów hiperpolaryzacyjnych. Przesuń kursor, aby zmierzyć wartość progu reozasady i membrany. nuta: Amplituda prądu wymagana do indukcji AP jest zdefiniowana jako reozasada, a najniższe napięcie do indukowania AP jest zdefiniowane jako próg membranowy.
- Zapisz prądy indukowane ligandem.
- Napełnij pipetę specyficznymi agonistami.
Uwaga: W bieżącym raporcie użyliśmy glutaminianu 100 μM i 100 μM AITC do indukcji prądów, w których pośredniczą odpowiednio receptory glutaminianu i receptory TRPA1.
- Sprawdź pipetę, aby upewnić się, że w środku nie ma pęcherzyków powietrza. Umieść pipetę w uchwycie na pipety. Połączyć uchwyt pipety z rurką podłączoną do systemu dozowania leku.
- Użyj manipulatora, aby przesunąć pipetę w odległości nie większej niż 50 μm od neuronu. Ustaw ciśnienie w systemie dozowania leku na 1 psi, a czas trwania na 1 sek. Przełącz tryb nagrywania na napięcie cęgi i clamp na -70 mV. Krótko przyłóż ciśnienie za pomocą systemu dozowania leku, aby zarejestrować prąd indukowany lekiem.
Tabela 1
szt.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
| 100 ml roztworu wewnątrzkomórkowego |
| Stężenie (mM) | składnik | Mw | g |
| 130 | KGlukonat | 234,24 | |
| 10 | Kcl | Klasa 74,55 | |
| 10 | HEPESY | 238,3 | |
| 10 | EGTA (EGTA) | | |
| cyfra arabska | MgCl2*6H2O | 203,3 | |
| Uwagi: Dostosuj pH do 7,4 za pomocą KOH, a osmolarność do 260 - 280 mOsm za pomocą sacharozy i wody destylowanej. Dodać 2 mM MgATP, 0,5 mM Na2GTP i przefiltrować przed natychmiastowym użyciem. |
