Ocena synaps wstęgowych w określonych obszarach częstotliwości ślimaka myszy

Streszczenie

Źródło: Yu, S., et al. Morfologiczna i funkcjonalna ocena synaps wstęgowych w określonych regionach częstotliwości ślimaka myszy. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje metodę oceny synaps wstęgowych w określonych regionach ślimaka myszy. Wykorzystuje techniki barwienia immunologicznego i obrazowania konfokalnego w celu identyfikacji funkcjonalnych synaps w różnych regionach częstotliwości w każdym skręcie ślimaka.

Protokół

Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Wybór zwierząt

1. Do wszystkich eksperymentów użyj dorosłych samców myszy C57BL/6J (w wieku 8 tygodni) jako modelu zwierzęcego.
   UWAGA: Myszy C57BL / 6J noszące wariant splicingu Cdh23 wykazują przyspieszone starzenie się układu słuchowego, odzwierciedlone jako 40% utrata synaps wstęgowych w podstawowym zwoju ślimaka i 10% utrata w środkowym zwoju do 6 miesiąca życia, a następnie szybki wzrost tej utraty w całym ślimaku wraz z wiekiem. Dlatego zalecamy ostrożność podczas używania myszy C57BL/6J starszych niż 6 miesięcy do badań słuchowych. Inne szczepy myszy mogą być używane w zależności od określonych celów eksperymentalnych.
2. Sprawdź myszy za pomocą profesjonalnego diagnostycznego otoskopu kieszonkowego, aby wykluczyć patologie ucha zewnętrznego lub środkowego przed oceną słuchu. Potencjalne objawy mogą obejmować płyn lub ropę w przewodzie słuchowym zewnętrznym, zaczerwienienie i obrzęk miejscowej tkanki oraz perforację błony bębenkowej.
   UWAGA: Chociaż jest to rzadko spotykane, po zidentyfikowaniu myszy z chorobami ucha zewnętrznego lub środkowego należy wykluczyć
.

2. Ocena słuchu

1. Znieczulenie myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny chlorowodorku ketaminy (100 mg/kg) i chlorowodorku ksylazyny (10 mg/kg). Oceń głębokość znieczulenia na podstawie bolesnych bodźców (np. odruch szczypania palców).
   UWAGA: Gdy odruch szczypania palców u nóg jest całkowicie nieobecny, zwierzę osiągnęło odpowiednią głębokość znieczulenia do badania słuchowego. Jeśli potrzeba więcej czasu na obustronne zapisy ABR (słuchowej odpowiedzi pnia mózgu), należy podać niższą dawkę (jedną piątą pierwotnej dawki) środków znieczulających, aby przywrócić pierwotną płaszczyznę znieczulania. Należy uważać, aby uniknąć przedawkowania środka znieczulającego, ponieważ może to prowadzić do śmierci myszy.
2. Utrzymuj temperaturę ciała znieczulonego zwierzęcia na poziomie 37,5 °C za pomocą termoregulującej poduszki grzewczej. Umieść znieczulone zwierzę w pomieszczeniu osłoniętym elektrycznie i akustycznie, aby uniknąć zakłóceń podczas badania słuchu.
   UWAGA: Utrzymuj temperaturę fizjologiczną podczas całego zabiegu, aż zwierzę całkowicie się obudzi, aby zapobiec śmierci spowodowanej hipotermią po znieczuleniu.
3. Umieścić podskórne elektrody igłowe (20 mm, 28 G) na wierzchołku czaszki (elektroda rejestrująca), odpowiednio w okolicy ślinianki przyusznej poniżej małżowiny usznej mierzonego ucha (elektroda odniesienia) i w okolicy ślinianki przyusznej po przeciwnej stronie (elektroda masowa), na głębokości 3 mm pod skórą głowy myszy.
4. Użyj głośnika o zamkniętym polu, aby przeprowadzić stymulację akustyczną za pomocą plastikowej rurki o średnicy 2 cm z końcówką w kształcie stożka. Dopasuj końcówkę do zewnętrznego kanału słuchowego.
   UWAGA: Upewnij się, że impedancja elektryczna w elektrodach rejestrującej i referencyjnej jest mniejsza niż 3 kOhm (zwykle 1 kOhm). Jeśli impedancja jest wysoka, zmień miejsce wprowadzenia elektrody, wyczyść elektrodę alkoholem lub wymień elektrodę, aby uniknąć zmian amplitudy fali ABR.
5. W przypadku nagrywania ABR generuj pipsy tonów (czas trwania 3 ms, czasy narastania/opadania 1 ms, z szybkością 21,1/s, częstotliwość: 4–48 kHz) i prezentuj je przy malejących poziomach ciśnienia akustycznego (SPL) od 90 do 10 dB w krokach co 5–10 dB SPL. Na tym etapie odpowiedzi są wzmacniane (10 000 razy), filtrowane (0,1–3 kHz) i uśredniane (1 024 próbki/poziom bodźca).
   UWAGA: ABR są zbierane dla każdego poziomu bodźca w krokach co 10 dB, z dodatkowymi 5 krokami dB w pobliżu progu.
6. Dla każdej częstotliwości należy określić próg ABR, który odnosi się do minimalnego SPL, co daje wiarygodny zapis ABR z jedną lub kilkoma rozróżnialnymi falami, które można wyraźnie zidentyfikować za pomocą oględzin.
   UWAGA: Zwykle konieczne jest powtórzenie procesu dla niskich SPL wokół progu, aby zapewnić spójność przebiegów. Próg odpowiedzi to najniższy poziom bodźca, przy którym można zaobserwować przebieg, gdy spadek o 5 dB doprowadziłby do zaniku przebiegu.

3. Przetwarzanie tkanek ślimakowych

1. Po nagraniu ABR należy poddać znieczulone myszy eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy, odciąć im głowę, odsłonić pęcherz od strony brzusznej i otworzyć je ostrymi nożyczkami, aby uzyskać dostęp do ślimaka.
2. Za pomocą cienkich kleszczy usuń kości skroniowe, przetnij tętnicę strzemiączka, usuń strzemiączko z okienka owalnego i rozerwij błonę okrągłego okienka. Zrób mały otwór na wierzchołku ślimaka, delikatnie obracając końcówkę igły (13 mm, 27 G).
3. Utrwalić wyizolowane kości za pomocą 4% (wag./obj.) paraformaldehydu w 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) przez noc w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety z cienką końcówką delikatnie przepłukać utrwalacz przez przestrzenie perylimfatyczne poprzez nałożenie na owalne lub okrągłe okienka (jako wlot) i otwór na wierzchołku (jako wylot).
   UWAGA: Niektóre białka wymagają krótkiego czasu utrwalenia, aby uniknąć zniszczenia ich epitopów do znakowania immunologicznego. W takich przypadkach inkubować kości w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny, w zależności od instrukcji producenta dotyczących immunohistochemii. Utrwalenie można również przeprowadzić poprzez perfuzję serca w celu usunięcia krwi ślimakowej, unikając szumu tła spowodowanego niespecyficznym barwieniem na późniejszych etapach, szczególnie w mysich modelach synaptopatii ślimakowej.
4. Opłucz kości trzy razy przez 5 minut 0,1 M zimnym PBS, aby usunąć resztki paraformaldehydu. Odwapnić kości 10% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w temperaturze pokojowej przez 4 godziny lub w temperaturze 4 °C przez 24 godziny poprzez delikatne wytrząsanie w wytrząsarce poziomej przy 20 obr./min. EDTA można odświeżyć w połowie.
   UWAGA: Czas odwapnienia zależy od stężenia EDTA i preferencji użytkowników. Odwapniona tkanka powinna zachowywać pewien stopień wytrzymałości, co ułatwia manipulowanie izolacją całych wierzchowców ślimaka na późniejszych etapach. Kości skroniowe mogą być odwapnione w 10% EDTA z rotacją, co pozwala naukowcom opuścić laboratorium po testach ABR i eksperymentach z utrwalaniem. Czas odwapnienia jest elastyczny w zakresie od 20 do 30 godzin w temperaturze 4 °C.
5. Przenieś jedną odwapnioną kość skroniową z EDTA do 0,1 M PBS. Użyj kleszczyków Dumonta #3 i #5 oraz igły 27 G, aby wypreparować kolejno wierzchołkowe, środkowe i podstawowe obszary ślimaka, a następnie wypreparuj ślimak z kości pod mikroskopem stereoskopowym. Wykonaj serię małych nacięć wzdłuż więzadła spiralnego za pomocą żyletki i usuń błonę tektorialną oraz błonę Reissnera (ryc. 1).
   UWAGA: Dopóki wypreparowany ślimak jest nienaruszony, proces ten może być modyfikowany zgodnie ze zwykłym protokołem danego operatora.
6. Następnie należy rozciąć pozostały nabłonek słuchowy, w tym rąbek spiralny, na poszczególne zwoje ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa z obszarem haczyka) w celu przygotowania całego mocowania.
7. Pod 40-krotnym obiektywem olejowym mikroskopu świetlnego zmierz długość błony podstawnej za pomocą skali 250 μm umieszczonej w okularze, którą można regulować wzdłuż stereorzęsek IHC.
8. Oblicz długość każdego skrętu ślimaka, dodając wszystkie długości segmentów (250 μm na segment) i jednocześnie uzyskaj całkowitą długość błony podstawnej, sumując długości każdego zwoju.
9. Przelicz całkowitą długość błony podstawnej, w tym obszar haczyka, na wartość procentową opartą na odległości od wierzchołka ślimaka (0% odnosi się do wierzchołka ślimaka, 100% do podstawy ślimaka).
10. Przelicz tę odległość na częstotliwość charakterystyczną ślimaka za pomocą funkcji logarytmicznej (d(%) = 1 - 156,5 + 82,5 ×log(f), z nachyleniem 1,25 mm/oktawę częstotliwości, gdzie d jest znormalizowaną odległością od wierzchołka ślimaka w procentach, f jest częstotliwością w kHz), jak opisano wcześniej. W ten sposób można uzyskać zakres częstotliwości w odpowiednim obszarze błony podstawnej przy każdym zwrocie ślimaka.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Po rozbiorze umieść każdy obrót ślimaka w osobnej probówce wirówkowej o pojemności 2,5 ml i inkubuj zwoje ślimaka w 10% koziej surowicy/PBS/0,1% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze.
2. Usunąć powyższy roztwór blokujący/przepuszczalny z każdej probówki za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem preparacyjnym i inkubować próbki z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej/PBS/0,1% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze.
   UWAGA: Do znakowania immunologicznego wstążek synaptycznych ślimaka należy użyć presynaptycznego markera mysiego białka wiążącego anty-karboksyl-zakończenie 2 IgG1 (CtBP2, znakowanie domeny B białka rusztowania RIBEYE, 1:400) i postsynaptycznego markera mysiego receptora antyglutaminianu 2 IgG2a (GluR2, znakowanie podjednostki kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego lub receptora AMPA, 1:200).
3. Przepłukać trzy razy przez 5 minut 0,1 M zimnym PBS w celu usunięcia pozostałości przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej/PBS/0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 2\u20123 h w ciemności na rotatorze.
   UWAGA: Przygotuj odpowiednie mieszaniny przeciwciał drugorzędowych przy użyciu koziego przeciwciała anty-mysiego Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) i koziego anty-mysiego Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), które są komplementarne do przeciwciał pierwszorzędowych użytych w kroku 4.2. Aby poprawić skuteczność znakowania wstęg synaptycznych, zalecamy wybór określonych przeciwciał drugorzędowych. Niektóre laboratoria przedłużają inkubację z przeciwciałami drugorzędowymi, aby zwiększyć immunoznakowanie GluR2.
4. Przepłukać trzy razy przez 5 minut 0,1 M PBS w celu usunięcia pozostałości przeciwciał drugorzędowych i przenieść próbki z probówek wirówkowych o pojemności 2,5 ml na płytki 35 mm zawierające 0,1 M PBS.
5. Umieścić kroplę podłoża montażowego zawierającego 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) na szkiełku podstawowym i przenieść próbki z PBS do podłoża mocującego. Umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i zwolnij, aby szkiełko nakrywkowe delikatnie opadło.
   UWAGA: Aby upewnić się, że komórki rzęsate są skierowane do góry i że podczas zabiegu nie dochodzi do fałdowania lub skręcania próbek ślimaka, należy zamontować próbki ślimaka pod mikroskopem stereoskopowym.
6. Umieścić szkiełka w pudełku ze szkiełkami w temperaturze 4 °C na noc, aby szkiełka wyschły, a następnie zobrazować pod laserowym mikroskopem konfokalnym
.

5. Ocena morfologiczna synaps wstęgowych ślimaka

1. Preparaty obrazu za pomocą mikroskopu konfokalnego z trzema laserami - diodą UV 405 nm, laserem argonowym 488 nm i laserem półprzewodnikowym pompowanym diodą 561 nm (DPSS) w celu wzbudzenia DAPI (widmo wzbudzenia 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (widmo wzbudzenia 496–549 nm) i Alexa Fluor 568 (widmo wzbudzenia 573–631 nm), odpowiednio.
2. Uzyskuj konfokalne stosy osi Z w odległości 8 μm od każdego obrotu ślimaka za pomocą 63-krotnej soczewki olejowej o wysokiej rozdzielczości.
   UWAGA: Po zdefiniowaniu wszystkie parametry digitalizacji mikrofotografii powinny zostać zapisane i stosowane jednolicie do wszystkich slajdów.
3. W przypadku zliczania punktów synaptycznych należy ustawić stosy z (rozmiar kroku 0,3 μm) tak, aby obejmowały całą długość wewnętrznych komórek rzęsatych (IHC), zapewniając w ten sposób, że można zobrazować wszystkie punkty synaptyczne.
4. Scal obrazy zawierające puncta w stosie z, aby uzyskać projekcję osi z, a następnie zaimportuj je do oprogramowania do przetwarzania obrazu.
5. Podziel całkowitą liczbę synaps w każdym stosie z w określonych obszarach częstotliwości przez liczbę IHC (równą ręcznym zliczeniom jądrowym DAPI), aby obliczyć liczbę punktów synaptycznych dla każdego IHC. W każdym określonym obszarze częstości uśrednij wszystkie punkty synaptyczne na trzech obrazach różnych pól mikroskopowych zawierających 9-11 IHC.
   1. Nakreśl obszar zainteresowania (ROI), w tym obszary podstawno-boczne każdego IHC, za pomocą przycisku wyboru odręcznego. Użyj funkcji miary do automatycznego określania ilościowego punktu, a funkcji działu wodnego do rozróżnienia blisko sąsiadujących miejsc.
   2. Po każdym automatycznym liczeniu należy przeprowadzić oględziny z ręcznymi korektami, aby upewnić się, że liczenie punktowe jest niezawodne.
      UWAGA: Eksperymentatorzy powinni pozostać zaślepieni co do tego, czy szkiełko pochodzi z wierzchołka, środkowego czy podstawnego skrętu ślimaka.
6. Wizualnie oceń strukturę i rozmieszczenie synaptyczne, aby ręcznie odizolować poszczególne IHC od ich sąsiadów za pomocą narzędzia Pencil Tool (M), aby lepiej zobrazować architekturę cytoszkieletu i lokalizację synaptyczną.
7. Aby sprawdzić zestawienie wstęg presynaptycznych (CtBP2) i łat receptorów postsynaptycznych (GluR2), wyodrębnij przestrzeń woksela wokół wstążki za pomocą narzędzia Zaznaczanie prostokątne i wyizoluj pojedynczą wstążkę według Przytnij. Klikając Obraz > Rozmiar obrazu, uzyskaj tablicę miniatur tych miniaturowych projekcji, które można następnie wykorzystać do identyfikacji sparowanych synaps (pojawiających się jako ściśle zestawione pary CtBP2-dodatnich i GluR2-dodatnich punktów) w porównaniu z sierocymi wstążkami (bez postsynaptycznych łat receptora glutaminianu) (Rysunek 2).
   UWAGA: Normalne synapsy ślimakowe pojawiają się jako połączone znakowanie immunologiczne wstążki presynaptycznej w komórce rzęsatej (anty-CtBP2) i postsynaptycznego receptora glutaminianu na zakończeniu nerwu słuchowego (anty-GluR2). Niektóre laboratoria używają projekcji konfokalnych w połączeniu z modelowaniem 3D w celu ilościowego określenia rozmiaru lub objętości łaty synaptycznej. Przed znaczną utratą synaps wstęgowych, wstążki wykazujące zmiany wielkości lub bez sparowanych plastrów receptora glutaminianu prawdopodobnie wskazują na dysfunkcję synapty.

Wyniki

Rycina 1: Lokalizacja częstotliwości ślimaka u myszy. (A) Reprezentatywny obraz pełnego eksplantowanego ślimaka, który został wypreparowany z kości skroniowej pod mikroskopem stereoskopowym. (B) Ślimak myszy jest podzielony na zwoje wierzchołkowe, środkowe i podstawne, w których usuwana jest boczna ściana ślimaka. Czerwone kółka na fragmentach błony...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorowodorek ketaminy	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, Chiny	H35020148	100 mg/kg
Chlorowodorek ksylazyny	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał X-1251	10 mg/kg
Aparatura do fizjologii TDT	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Floryda, Stany Zjednoczone	Układ fizjologii słuchu III
Oprogramowanie SigGen/BioSig	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Floryda, Stany Zjednoczone	Układ fizjologii słuchu III
Podkładka elektryczna	Zabawa ze zwierzętami	11072931136
Kleszcze Dumonta 3 #	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada	0203-3-PO
Kleszcze Dumonta 5 #	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada	0209-5-PO
Stereoskopowy mikroskop preparacyjny	Nikon Corp., Tokio, Japonia	SMZ1270
Kozia surowica	ZSGB-BIO, Pekin, Chiny	ZLI-9021
Receptor antyglutaminianu 2, zewnątrzkomórkowy, klon 6C4	Millipore Corp., Billerica, Massachusetts, Stany Zjednoczone	MAB397 powiedział	mysz
Oczyszczony mysz anty-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, Stany Zjednoczone	612044	mysz
Alexa Fluor 568 kozie przeciwciało anty-mysie IgG1	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	A21124	koza
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG2a	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	A21131	koza
Medium montażowe zawierające DAPI	ZSGB-BIO, Pekin, Chiny	ZLI-9557
Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	TCS SP8 II
Oprogramowanie Image Pro Plus	Media Cybernetics, Bethesda, MD, Stany Zjednoczone	Wersja 6.0
Profesjonalny diagnostyczny otoskop kieszonkowy	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	Zobacz materiał HS-OT10
Elektroda igłowa	Przyjaźń Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, Chiny	Numer katalogowy 1029	20 mm, 28 g
Głośnik o zamkniętym polu	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Floryda, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał CF1