Optogenetyczna kontrola dynamiki sieci hipokampa

Streszczenie

Źródło: Manseau, F., et al. Dostrajanie pasma theta hipokampa in vitro: metodologie nagrywania z izolowanego obwodu septohipokampa gryzoni. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje metodę wykorzystania optogenetyki do modulowania dynamiki sieci hipokampa poprzez aktywację genetycznie zmodyfikowanych światłoczułych interneuronów w wycinku mózgu myszy, poprawiając synchronizację oscylacji theta i badając zachowanie obwodów neuronalnych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Kontrola optogenetyczna w izolowanym hipokampie
   UWAGA: Do optogenetycznej kontroli aktywności sieci hipokampa, stosuje się tutaj strategię specyficzną dla typu komórki, obejmującą rytmiczną aktywację komórek GABA-ergicznych zawierających PV (parwalbuminę), ponieważ wykazano, że komórki te odgrywają główną rolę w synchronizacji głównych populacji komórek w izolowanym hipokampie. Selektywną ekspresję pobudzającej rodopsyny kanałowej-2 (ChR2) w komórkach PV uzyskuje się poprzez skrzyżowanie linii myszy PV-Cre z myszami konstytutywnie wykazującymi ekspresję ChR2 Cre w zależności od (Ai32), tworząc w ten sposób myszy PV-ChY. Alternatywnie, konstrukty wektorów wirusowych (e.g., AAVdj-ChETA-eYFP) można wstrzyknąć do hipokampa myszy PV-Cre lub PV-TOM (P15-16) w celu sterowania ekspresją pobudzającej opsyny w interneuronach CA1 / SUB (Figura 1A).
   1. Umieść elektrodę LFP w obszarze CA1 / SUB (Cornu ammonis-1 / subiculum) i załataj pobliską komórkę piramidalną w izolowanym hipokampie myszy wyrażającej wrażliwej na niebieskie światło pobudzające opsynę ChR2 w interneuronach PV.
   2. Umieść światłowód światłowodowy (o średnicy 0,2 - 1 mm) nad preparatem hipokampa i wyśrodkuj go na zarejestrowanym obszarze. Użyj niebieskiego światła (473 nm) ze źródła LED do stymulacji optogenetycznej, składającej się z impulsów świetlnych (10 - 20 ms, wyzwalanych sygnałem logicznym tranzystor-tranzystor) lub poleceń napięcia sinusoidalnego dostarczanych na częstotliwościach theta (4 - 12 Hz).
   3. Przełącz się na cęgi prądowe i scharakteryzuj aktywność piramidy podczas spontanicznych oscylacji theta.
   4. Uruchom protokół stymulacji i zarejestruj reakcje świetlne. Obserwuj, że oscylacje pola i aktywność synaptyczna w zarejestrowanym neuronie stają się coraz bardziej zsynchronizowane podczas stymulacji optogenetycznej i że rytmiczne stymulacja komórek PV skutkuje solidną kontrolą zarówno częstotliwości, jak i mocy oscylacji theta (Rysunek 1).

Wyniki

Rycina 1: Potencjał pola lokalnego i jednoczesne zapisy patch clamp z pojedynczych neuronów piramidowych CA1/SUB i PV podczas spontanicznych i optogenetycznie napędzanych oscylacji Theta w izolowanym hipokampie.

(a) Schemat przedstawiający miejsca rejestracji LFP i elektrody krosowej z umieszczeniem światłowodu nad regionem CA1 / SUB wyrażającym wrażliwą ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S9625
Sacharoza	Sigma Aldrich	S9378
Wodorowęglan sodu	Sigma Aldrich	S5761
NaH2PO4 - sodu fosforan jednozasadowy	Sigma Aldrich	S8282
Siarczan magnezu	Sigma Aldrich	M7506
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	P3911
D-(+)-glukoza	Sigma Aldrich	G7528
Chlorek wapnia dwuwodny	Sigma Aldrich	C5080
Askorbinian sodu	Sigma Aldrich	A7631-25G
Sprzęt
Mieszanina 95% O2/5% CO2 (karbogen)	Vitalaire	SG466204A	System perfuzyjny
Butelki/kolby szklane (4 x 1 L)	n.a.	n.a.	system perfuzyjny
Zanurzona komora nagraniowa	custom design (FM)	n.a.	Można zastosować komercyjną alternatywę
Wzmacniacz krosowy Multiclamp 700B	Urządzenia molekularne	ZACISK WIELOZACISKOWY	Elektrofizjologia
Program dowódcy Multiclamp 700B	Urządzenia molekularne	ZACISK WIELOFUNKCYJNY	Elektrofizjologia
Przetwornik cyfrowo-analogowy	Urządzenia molekularne	DDI440	Elektrofizjologia
Mikromanipulatory (obsługiwane ręcznie)	Siskiyou	MX130	elektrofizjologia (LFP)
Mikromanipulatory (zautomatyzowane)	Siskiyou	MC1000e	Elektrofizjologia (łata)
Monitor audio	Systemy A-M	Numer 3300	Elektrofizjologia
Pionowy mikroskop fluorescencyjny zbudowany na zamówienie	Siskiyou	n.a.	Obrazowanie
Analogowa kamera wideo	COHU	4912-2000/0000	Obrazowanie
Cyfrowy frame grabber z oprogramowaniem do obrazowania	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	Obrazowanie
Cel Olympus 2.5x	Olimp	MPLFLN	Obrazowanie
Olympus 40x cel zanurzenia w wodzie	Olimp	UIS2 LUMPLFLN	Obrazowanie
Dedykowany system diod elektroluminescencyjnych (LED)	custom	n.a.	stymulacja optogenetyczna (Amhilon i wsp., 2015)
Zwierzęta
Myszy PV::Cre (KI)	Laboratorium Jacksona	Numer katalogowy 008069	Zezwalaj na ekspresję genów kierowanych przez Cre w interneuronach PV
Myszy Ai9 o warunkowym uwarunkowaniu konstytutywnym (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	Laboratorium Jacksona	Numer katalogowy 007905	Express TdTomato po rekombinacji za pośrednictwem Cre
Myszy Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	Laboratorium Jacksona	Numer katalogowy 012569	Ekspresja ulepszonego białka fuzyjnego rodopsyny-2/EYFP po ekspozycji na rekombinazę Cre
Myszy PVChY	Hodowla inwentarska	n.a.	Potomstwo uzyskane ze skrzyżowania linii PV-Cre z myszami Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP