Ocena funkcjonalnego połączenia nerwowo-mięśniowego za pomocą jednoczesnej stymulacji optycznej i nagrywania wideo

Streszczenie

Źródło: Liberman, M., et al., Inżynieria i charakterystyka optogenetycznego modelu ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film demonstruje metodę oceny funkcjonalnych połączeń nerwowo-mięśniowych. Za pomocą bioreaktora zawierającego tkankę mięśniową i neurony ruchowe, wraz z mikroskopią fluorescencyjną, wrażliwe na światło kanały w neuronach są stymulowane do generowania sygnałów elektrycznych, powodując skurcze włókien mięśniowych.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowanie bioreaktora

1. Wykonaj formy do bioreaktorów
   1. Pobierz plik CAD (projektowanie wspomagane komputerowo) bioreaktora z dodatkowego pliku CAD lub utwórz niestandardowy projekt.
   2. Wygeneruj ścieżkę narzędzia CNC (Computer Numerical Control) z modelu 3D za pomocą oprogramowania CAM (Computer-aided manufacturing).
   3. Obróbka form acetalowych za pomocą frezarki CNC.
2. Produkcja bioreaktorów
   1. Wymieszaj mieszaninę bazy 10:1 z utwardzaczem polidimetylosiloksanu (PDMS, 77 g mieszaniny na 4 platformy/formy).
   2. Umieść mieszaninę w komorze próżniowej, zamknij wszystkie zawory, włącz podciśnienie i odgazowuj mieszaninę przez co najmniej 30 minut, aż nie pozostaną pęcherzyki powietrza. Wlej mieszaninę do foremek i odgazuj formy w komorze próżniowej przez 1 godzinę.
   3. Zamknij foremki, tak aby górna połowa formy była we właściwej orientacji. Umieść stalowy sześciokątny pręt na środku i clamp po obu stronach.
   4. Napełnij górę PDMS.
   5. Utwardzać foremki w piekarniku o temperaturze 65 °C przez co najmniej 4 godziny.
   6. Wyjmij platformy z form po schłodzeniu do temperatury pokojowej.
   7. Wyczyść urządzenia w kąpieli ultradźwiękowej za pomocą 1-godzinnych cykli płynu do naczyń, 400 ml 100% izopropanolu i wody destylowanej.
   8. Suszyć przez noc w temperaturze 65 °C.
   9. Namocz szklane szkiełka nakrywkowe w 1% niejonowym poliolu powierzchniowo czynnym przez 30 minut, upewniając się, że nie układają się w stosy, aby wszystkie były odpowiednio pokryte.
   10. Dobrze spłukać wodą destylowaną i wysuszyć przez noc w temperaturze 65 °C.
   11. Szklane szkiełka nakrywkowe i platformę PDMS należy traktować środkiem do czyszczenia plazmowego na wysokich obrotach z 6 l/min tlenu przez 1-2 minuty. Po zabiegu połącz je ze sobą, dociskając PDMS do szkiełka nakrywkowego przez co najmniej 30 sekund.
   12. Autoklawuj połączone urządzenia przed dodaniem komórek.

2. Budowanie zestawu do stymulacji optycznej

1. Używając systemu sześcianów klatkowych 30 mm, przymocuj pośrodku zwierciadło dichroiczne 573 nm. Połącz czerwoną diodę LED (Light Emitting Diode) o długości fali 627 nm z długoprzepustowym filtrem wzbudzenia o długości fali 594 nm i przymocuj ją do górnej części kostki, tak aby dioda LED była skierowana w stronę lustra. Następnie przymocuj niebieską diodę LED 488 nm z filtrem wzbudzenia krótkoprzepustowym 546 nm po sąsiedniej stronie kostki, tak aby dioda LED była skierowana w stronę lustra, jak pokazano na schemacie na rysunku 1A.
2. Przymocuj przysłonę tęczówki uruchamianą pierścieniowo do dolnej części kostki klatki, aby kontrolować rozmiar oświetlanego obszaru.
3. Zasilaj każdą diodę LED za pomocą sterownika LED T-Cube i steruj nią za pomocą płytki Arduino Uno Rev3. Podłącz boczne wejście sterownika LED do wtyczki źródła zasilania, podłącz środkowe wyjście do Arduino i podłącz boczne wyjście bezpośrednio do diod LED.
4. Podłącz Arduino Uno do komputera za pomocą USB.
5. Pobierz pliki z linku GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. Otwórz plik "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" z folderu GitHub.
7. Ustaw parametry początkowe: Steps = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
8. Upewnij się, że wyjście pin 4 jest przypisane do sterownika niebieskiej diody LED, a wyjście pinu 2 jest przypisane do sterownika czerwonej diody LED. Sprawdź, czy środkowe przewody sterownika LED są podłączone do masy i do odpowiedniego wyjścia pinowego.
9. Skompiluj i załaduj program "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" do Arduino.
10. Podłącz każdy sterownik LED do odpowiedniego kanału.

3. Konfiguracja hodowli komórkowej (dzień -21-0)

1. Pierwotne komórki mięśni szkieletowych
   1. Rozmrażaj i rozszerzaj pierwotne mioblasty szkieletowe (uzyskane z miozytu Cooka) przez maksymalnie sześć pasaży przy użyciu miotonicznej pożywki wzrostowej (+ suplement). Utrzymuj komórki w inkubatorze w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO_{2 .}
   2. Zmieniaj nośnik co 2 dni.
   3. Gdy komórki zlewają się w około 60%, przepuść je za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA (1x, przez 5 minut w temperaturze 37 °C). Zbierz zdysocjowane komórki i dodaj świeże podłoże, aby zneutralizować trypsynę.
   4. Odwirować komórki przy 300 x g i zassać supernatant powyżej osadu komórkowego.
   5. Ponownie zawiesić komórki za pomocą MGM i wysiewać nasiona w stosunku 1:3 z 60 ml na kolbę trójwarstwową.
2. ChR2-hiPSC
   nuta: Wszystkie linie komórkowe do tej pracy zostały stworzone i wykorzystane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Columbia University, NY, USA. W tym protokole hiPSC z ekspresją ChR2 zostały wygenerowane poprzez edycję genomu CRISPR-Cas9 przy użyciu wcześniej opisanych metod18, ale w ten sam sposób można wykorzystać dowolne stabilne optogenetyczne linie komórkowe (lentiwirusowe, piggyBac itp.). Wybrano konstytutywne promotory ulegające ekspresji zarówno w iPSC, jak i w neuronach ruchowych (CAG). Stwierdzono, że komórki mają zdrowe kariotypy, jak zauważono w poprzednich publikacjach.
   1. Pokryć płytki 6-dołkowe 1 ml/basenik rozpuszczonej matrycy błony podstawnej rozcieńczonej w DMEM/F12 (1:80) i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   2. Wysiewaj iPSC na powlekanych płytkach 6-dołkowych z 2 ml pożywki do hodowli komórkowych bez podajnika (pożywki iPSC), wymieniając 2 ml pożywki co drugi dzień i pasażując co 5-7 dni. Utrzymuj komórki w inkubatorze ustawionym na 37°C i 5% CO_{2 .}
   3. Przejście
      1. Dysocjację komórek macierzystych należy przeprowadzić poprzez inkubację z 1 ml bezenzymatycznego odczynnika uwalniającego komórki macierzyste przez 4 minuty i mechaniczne ścinanie ich pipetą P1000 z szeroką końcówką.
      2. Komórki nasienne w stosunku 1:24 lub 1:48 w pożywce iPSC z 2 μM dichlorowodorku Y-27632 w 2 ml / basenie na powlekane płytki 6-dołkowe.

4. Wysiewanie tkanki mięśni szkieletowych (dzień -3)

1. Wyizoluj i policz 30 x 106 mioblastów za pomocą automatycznego licznika komórek.
2. Ponownie zawiesić mioblasty w mieszaninie 4:1 3 mg/ml kolagenu I i rozpuszczonej macierzy błony podstawnej (800 μl mieszaniny kolagenu + 200 μl matrycy błony podstawnej, aby osiągnąć końcową objętość 1 ml). W przypadku składnika kolagenowego dodać dołączony środek neutralizujący (mieszanina kolagenu z neutralizacją w stosunku 9:1) i rozcieńczyć mieszaninę 1x PBS, aby uzyskać objętość 800 μL.
3. Dodać 15 μl zawiesiny kolagenu komórkowego do każdej komory mięśniowej bioreaktora, upewniając się, że zawiesina została rozprowadzona na obu filarach za pomocą końcówki pipety (ryc. 2).
4. Pozostawić mieszaninę komórkowo-żelową do polimeryzacji w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie napełnić każdy bioreaktor 450 μl miotonicznej pożywki wzrostowej.
5. Po 3 dniach (po zagęszczeniu żelu) rozpocznij różnicowanie rurki mięśniowej.

5. Różnicowanie Myotube (dni 0-14)

1. Infuzję rurki mięśniowej należy rozpocząć od przestawienia tkanek na 450 μl pożywki indukującej fuzję (FS, Tabela 1) przez 7 dni, zmieniając pożywkę co drugi dzień.
   nuta: Spróbuj rozpocząć różnicowanie miotubki w tym samym dniu, w którym różnicowanie motoneuronów od hiPSC, aby zasiać motoneurony na końcu schematów różnicowania obu typów komórek.
2. W 7 dniu zmienić pożywkę na 450 μl pożywki dojrzewającej Ia (MMIa, Tabela 1).
3. W dniu 9 należy zmienić na 450 μl pożywki dojrzewającej Ib (MMIb, Tabela 1).
4. W 11 dniu zmień pożywkę na 450 μl NbActiv4. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, aż neurony ruchowe zostaną wysiane (krok 7).

6. Różnicowanie motoneuronów (dni 0-14)

1. W dniu 0 przenieś 4 x 10⁶ ChR2- hiPSC na szalkę Petriego o bardzo niskim przyczepie z 15 ml pożywki do hodowli zawiesiny neuronów ruchowych (MSCM, Tabela 1). Uzupełnij MSCM 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydratu i 5 μM dichlorowodorku Y-27632.
2. W dniu 2 wyizoluj neurosfery (NS) za pomocą odwracalnego sitka 37 μM i ponownie plateruj w 15 ml MSCM z 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hydratem i 0,1 μM kwasu retinowego. Po 2 dniu NS powinien być widoczny na szalce Petriego bez użycia mikroskopu.
3. W 4 dniu przenieś komórki i pożywkę do probówki o pojemności 50 ml i pozwól neurosferom osiąść na dnie (5 min). Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 i 0,1 μM kwasu retinowego.
4. W dniu 7 powtórz krok 6.3, ale ponownie zawieś komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 0,5 μM SAG i 0,1 μM kwasu retinowego.
5. W dniu 9 powtórz krok 6.3, ale ponownie zawieś komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 10 μM DAPT.
6. W dniu 11 powtórz krok 6.3, ale ponownie zawieś komórki w 15 ml MSCM uzupełnionym 20 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF.
7. W dniu 14 umieść motoneurony na platformie.

7. Zasiewanie agregatów motoneuronów w bioreaktorze (dzień 14)

1. Przygotuj żelową mieszaninę 4:1 2 mg/ml kolagenu I i Matrigelu (800 μl mieszanki kolagenu + 200 μL Matrigel, aby osiągnąć końcową objętość 1 ml). W przypadku składnika kolagenowego dodać towarzyszący środek neutralizujący (mieszanina kolagenu z neutralizatorem w proporcji 9:1) i rozcieńczyć mieszaninę 1x PBS, aby uzyskać końcową objętość 800 μL.
2. Użyj sitka komórkowego o długości fali 400 nm, aby wybrać duże neurosfery i ponownie zawiesić je w mieszaninie żelu.
3. Odessać pożywkę ze zbiornika i ostrożnie ze studni neurosfery (ryc. 2).
4. Dodać 15 μl mieszaniny żelu do kanału neurosfery.
5. Załaduj pipetę o pojemności 10 μl z 10 μl żelu, a następnie wybierz jedną neurosferę.
6. Umieść NS w kanale neurosfery i upewnij się, że NS znajduje się w komorze. Powoli podnieś pipetę, jednocześnie uwalniając pozostały żel po nałożeniu NS. Jeśli nie masz pewności, czy NS został prawidłowo zdeponowany, sprawdź jego lokalizację za pomocą mikroskopu.
7. Pozostawić żel do polimeryzacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
8. Do zbiorników dodać 450 μl NbActiv4 uzupełnionego 20 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF.
9. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, aby umożliwić wzrost aksonów od NS do tkanki mięśniowej.

8. Jednoczesna stymulacja optyczna i nagrywanie wideo z funkcją NMJ (dzień 24+)

1. Do obrazowania należy użyć odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z naukową kamerą typu sCMOS (Complementary metal-oxide-semiconductor).
2. Ustaw grupowanie oprogramowania aparatu na 2x2, ekspozycję na 20 ms, włączoną migawkę typu rolling shutter, częstotliwość odczytu na 540 MHz, zakres dynamiki: 12-bit i wzmocnienie 1 oraz tryb czujnika: nakładanie się.
3. Użyj obiektywu 2x na mikroskopie, aby zobrazować mikrotkanki.
4. Podłączyć komorę z żywymi komórkami (37 °C, 5% CO₂ ) do stolika mikroskopu.
5. Wybierz obszar zainteresowania (ROI), który zawiera unerwioną tkankę tkanek szkieletowych, aby zminimalizować rozmiar pliku i czas przetwarzania.
6. Umieść długoprzepustowy filtr emisyjny 594 nm między próbką a obiektywem obrazowania, aby odfiltrować impulsy światła niebieskiego z kamery.
7. Umieść prostokątną 4-dołkową płytkę zawierającą 4 bioreaktory (24 tkanki) w komorze na żywe komórki.
8. Kliknij opcję Live View (Podgląd na żywo). Wyśrodkuj i ustaw ostrość obrazu z żądanym zwrotem akcji.
9. Przekaż niestandardowy kod makra z folderu GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis), aby sterować pozycją stołu montażowego, płytą Arduino i akwizycją wideo.
10. Ustaw film wyjściowy jako day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Uruchom kod makra z żądanymi współrzędnymi X,Y ustawionymi na stole montażowym i uzyskaj szybki upływ czasu z 1700 klatkami przy 50 klatkach / s.
12. Po obrazowaniu należy wymienić pożywkę i umieścić próbki z powrotem w inkubatorze. Odczekaj co najmniej 24 godziny między sesjami pozyskiwania obrazu, aby uniknąć zmęczenia tkanek.

Wyniki

Rysunek 1. Stymulacja, rejestracja i analiza funkcji NMJ. (A) Schemat konfiguracji diod LED i ścieżki światła. (B) Konfiguracja optyczna z odwróconym mikroskopem, komorą na żywe komórki, zautomatyzowanym stolikiem i kamerą sCMOS. (C) Algorytm przetwarzania wsadowego filmów stymulacji optycznej kultur NMJ. (D) Reprezentatywna klatka ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórek
SkMDC (Szpital Jądrowy)	Kucharz Miozyt	P01059-14M
Media i suplementy
Zaawansowany DMEM/F12	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy 12634-020
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej	Millipore Sigma	A9576-50ML
Suplement G-5 (100X)	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 17503-012
Selektywny antybiotyk genetycynowy (siarczan G418) (50 mg / ml)	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 10131-035
Insulina rekombinowana ludzka	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 100-0276
Zestaw nośników do wzrostu MyoTonic	Kucharz Miozyt	Zobacz materiał MK-4444
Suplement N-2	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 17502-048
NBactiv4 500 ml	BrainBits Sp. z o.o	Zobacz materiał Nb4-500
Podłoże nerwowo-podstawowe	ThermoFisher Naukowy	21103-049
Neurobasel-A Podłoże	ThermoFisher Naukowy	A13710-01
Ślusarski F-127	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P2443
ReLeSR	Technologie komórek macierzystych	5872
Wyroby z tworzyw sztucznych
System sześcienny koszyka 30 mm	ThorLabs powiedział:	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 oraz ER2-P4
Filtr siatkowy odwracalny 37 μm, duży	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 27250
Filtr wzbudzenia krótkoprzepustowego 546 nm	Semrock	FF01-546/SP-25
Lustro dichroiczne 573 nm	Semrock	FF573-Di01–25x36
Filtr długoprzepustowy 594 nm	Semrock	BLP01-594R-25
Filtr wzbudzenia długoprzepustowy 594 nm	Semrock	BLP01-594R-25
Niebieska (470nm) dioda Rebel LED na podstawie kwadratowej SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mA	Diody LED LuxeonStar	SP-05-B4
Carclo 29,8° Matowa optyka okrągła 10 mm - zintegrowane nogi	Diody LED LuxeonStar	Numer katalogowy: 10413
Naczynie hodowlane Corning 60 mm o bardzo niskim nasadce	Corning	Numer katalogowy: 3261
Radiatora	Diody LED LuxeonStar	LPD-19-10B
optyka
pluriSitko 400 μm, opakowanie 25 szt., sterylne	PluriSelect (Wybór Pluri)	43-50400-03
pluriSitko 500 μm, 25 szt., sterylne	PluriSelect (Wybór Pluri)	43-50500-03
Czerwona (627nm) Rebel LED na podstawie kwadratowej SinkPAD-II 10mm - 65 lm @ 700mA	Diody LED LuxeonStar	SP-05-R5
Przysłona irysowa uruchamiana pierścieniem	ThorLabs powiedział:	SM1D12D
Sterowniki LED T-Cube	ThorLabs powiedział:	LEDD1B, KPS101
Formy
Tuleje sześciokątne z gwintem wewnętrznym, 3 1/2" 10-32, częściowo gwintowane 1/2"	Mcmaster	91920A046
Niskoprofilowy zacisk C	Mcmaster	Numer katalogowy: 1705A12
Czynniki wzrostu
Monofosforan 3′,5′-cykliczny adenozyny	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg tabletki powlekane	Tocris powiedział:	Numer telefonu 4423-10
DAPT 10 mg tabletki powlekane	Systemy badawczo-rozwojowe	2634-10
Ludzki CNTF, klasa badawcza, 5 μg	Miltenyl Biotec	130-096-336
Ludzkie białko witronektyny, mukowiscydoza	Systemy badawczo-rozwojowe	2349-VN-100
Ludzkie białko witronektyny, mukowiscydoza	Systemy badawczo-rozwojowe	2349-VN-100
IGF1 Rekombinowane białko ludzkie	ThermoFisher Naukowy	PHG0078
Białko mysie Laminina, naturalne	ThermoFisher Naukowy	23017015
Rekombinowane ludzkie białko agrin	Systemy badawczo-rozwojowe	6624-AG-050
Rekombinowane ludzkie białko GDNF, CF 50ug	Systemy badawczo-rozwojowe	212-GD-050/CF
Rekombinowana ludzka neurotrofina 3 100 ug	Nauki o komórce	CRN500D
Rekombinowana ludzka neurotrofina-4	Nauki o komórce	CRN501B
Rekombinowany ludzki jeż soniczny / Shh (C24II) N-Koniec	Systemy badawczo-rozwojowe	1845-SH-100
Rekombinowany człowiek/mysz/szczur BDNF 50 ug	Peprotech	Rozdział 450-02
Kwas retinowy, 50 mg	Millipore Sigma	Czynnik chłodniczy R2625-50
Wygładzony agonista SAG	Millipore Sigma	Numer katalogowy: 566660
SB431542 10 mg tabletki powlekane	Technologie komórek macierzystych	Numer telefonu 72234
StemMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	Numer katalogowy: 130-103-925
Witronektyna z osocza ludzkiego	Millipore Sigma	V8379-50UG
Dichlorowodorek Y-27632	Tocris powiedział:	1254
przeciwciała
α-aktynina mAb (mysia IgG1)	Księga Abcam	ab9465 powiedział
Acetylotransferaza choliny (ChAT) (koza)	Milipory	Zobacz materiał AB144P
Desmin mAb (mysia IgG1)	Dako Dako	M076029-2
Ciężki łańcuch miozyny (MHC) (mysz IgG2b)	Magazyn DSHB	MF20
sprzęt
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Zautomatyzowany etap	Stosowane oprzyrządowanie naukowe	MS- 2000 XYZ
Rozszerzony odkurzacz plazmowy	Plazma Harricka	PDC-001 (115 V)
Invitrogen Countess Automatyczny licznik komórek	Marszałek Naukowy	Certyfikat CACC
IX-81 Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Olympus	IX-ILL100LH
System inkubatora z górną częścią etapu seryjnego	Tokai Hit STX	TOKAI-HIT-STXG
Kamera Zyla 4.2 sCOMS	Technologia Andor	ZYLA-4.2P-CL10
oprogramowanie
Oprogramowanie Arduino (IDE)	Arduino	Środowisko IDE 1.8.19
Kamera główna	Kamera główna	Mastercam dla Solidworks
Matlab (Matlab)	Matlab (Matlab)	Czynnik chłodniczy R2021b
Elementy sieciowej usługi informacyjnej	Nikon	Badania podstawowe
CAD Solidworks 3D	Solidworks (Solidworks)	Solidworks Standard