Opisujemy metodę multipleksowej reakcji PCR do szybkiego wykrywania serowarów Salmonella enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium. Konkretne serowary Salmonella można zidentyfikować, kierując multipleksową reakcję PCR na geny i sekwencje unikalne dla klastra biosyntezy antygenu O oraz flagelliny danego serowaru. Następnie izolatowi Salmonella przypisuje się serowar na podstawie pojawienia się specyficznych amplikonów (produktów PCR) o określonej wielkości, odpowiadających docelowemu allelowi.
Artykuł metodologiczny
PCR allelotypowania w celu identyfikacji serowarów Salmonella enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obecne komercyjne testy PCR służące do identyfikacji Salmonella celują w geny unikalne dla tego rodzaju. Istnieją jednak dwa gatunki, sześć podgatunków i ponad 2500 różnych serowarów Salmonella, a nie wszystkie mają takie samo znaczenie dla zdrowia publicznego. Na przykład wykrycie S. enterica subspecies IIIa Arizona w gospodarstwie zajmującym się produkcją jaj konsumpcyjnych jest nieistotne w porównaniu z izolacją S. enterica subspecies I serowar Enteritidis, który jest główną przyczyną salmonellozy powiązanej ze spożyciem jaj konsumpcyjnych. Serowary są identyfikowane na podstawie różnic antygenowych w lipopolisacharydzie (LPS) (antygen O) i flagellinie (antygeny H1 i H2). Różnice antygenowe te są zewnętrznym przejawem różnorodności genów i alleli genów związanych z tym fenotypem.
Opracowaliśmy metodę allelotypowania z wykorzystaniem wielokrotnej reakcji PCR (multiplex PCR), która opiera się na różnicach genetycznych między czterema głównymi serowariantami S. enterica podgatunku I występującymi u drobiu i wiążącymi się ze znaczącą zapadalnością na choroby u ludzi w USA. Pary starterów PCR zostały skierowane na kluczowe geny lub sekwencje unikalne dla konkretnego serowariantu Salmonella i zaprojektowane tak, aby wytworzyć amplikon o wielkości specyficznej dla danego genu lub allelu. Serowariant Salmonella przypisywany jest do izolatu na podstawie kombinacji wyników testów PCR dla specyficznych alleli genów LPS i flagelliny. Metody multiplex PCR opisane w tym artykule są specyficzne dla wykrywania serowariantów S. enterica podgatunku I: Enteritidis, Hadar, Heidelberg oraz Typhimurium.
W niniejszym materiale demonstrujemy, jak wykorzystać wielokrotny PCR do identyfikacji serowaru izolatu Salmonella.
Protokół
1. Przygotowanie matrycy do PCR
Uwaga: Aby zminimalizować zanieczyszczenia przeniesione podczas PCR, ważne jest, aby kilka kluczowych etapów reakcji PCR było fizycznie oddzielonych od siebie: 1) przygotowanie matrycy (DNA), 2) przygotowanie mieszaniny PCR oraz 3) elektroforeza w żelu. Zaleca się również stosowanie końcówek z filtrem, aby zapobiec zanieczyszczeniu pipet kulturami lub odczynnikami.
- Zaszczepić 1 ml bulionu Luria Bertani lub innego medium złożonego (Brain Heart Infusion, Superbroth itp.) izolatem Salmonella z pojedynczej, odizolowanej kolonii. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37°C.
- Przenieść 1 ml do sterylnej probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie odwirować zawiesinę komórek bakteryjnych przy 4,500 xg przez ok. 2 min., aby uzyskać osad komórkowy.
- Odlać nadsącz, zawiesić osad komórkowy w 1 ml 100% etanolu i pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 min. Odwirować komórki w ten sam sposób co wcześniej (4,500 xg, 2 min.), usunąć nadsącz i zawiesić komórki w 1 ml PBS.
- Odwirować komórki (4,500 xg, 2 min.), odrzucić nadsącz i zawiesić komórki w 1 ml sterylnej dH2O.
- Rozcieńczyć końcową zawiesinę komórek 1/20 w dH2O (5 μl/95 μl dH2O) i przechowywać w temperaturze -20°C. Okres przydatności całych komórek jako matrycy PCR w temperaturze -20°C wynosi około jednego miesiąca.
2. Przygotowanie reakcji PCR
Uwaga: Przygotowanie i dozowanie mieszaniny reakcyjnej PCR (matrycy, buforów, starterów oligonukleotydowych, nukleotydów i polimerazy Taq DNA) należy przeprowadzić w oddzielnym pomieszczeniu przeznaczonym do tego celu, najlepiej w stanowisku PCR/UV.
Uwaga: Pomieszczenie do przygotowania reakcji PCR musi być również wydzielone i wyposażone w dedykowaną zamrażarkę -20°C do przechowywania odczynników do PCR (buforów, starterów oligonukleotydowych i nukleotydów), enzymów i matrycy, dedykowany zestaw pipet do przygotowania PCR, jednorazowe rękawiczki lateksowe, fartuch laboratoryjny, końcówki z filtrem, płytki mikrotytrucyjne, kapilary szklane, probówki do mikrocentryfugi oraz 10% roztwór wybielacza do dekontaminacji powierzchni. Do dozowania odczynników do PCR należy używać dedykowanego zestawu pipet (P10, P100 i P1000). Zestaw pipet ten nie może nigdy opuścić stanowiska przygotowawczego.
Uwaga: Należy pozyskać dH2O klasy biologii molekularnej lub PCR i rozdzielić po 1 ml do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Po każdym użyciu należy odrzucić wykorzystaną porcję dH2O, aby uniknąć ewentualnej kontaminacji krzyżowej. Podobne podejście zaleca się w przypadku pozostałych odczynników do PCR.
Uwaga: Przed użyciem należy zdezynfekować obszar roboczy za pomocą naświetlania UV i/lub przetarcia powierzchni 10% roztworem wybielacza. Podczas przygotowania reakcji PCR należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki lateksowe. Należy ograniczyć przemieszczanie się między miejscem przygotowania PCR a obszarami, w których reakcje PCR są inkubowane w termocyklerze oraz gdzie produkty PCR (amplikony) są rozdzielane w żelach agarozowych. W przypadku powrotu do obszaru przygotowania PCR, należy zutylizować aktualnie noszone rękawiczki lateksowe i założyć nową parę.
- Przygotuj roztwór zapasowy starterów w dH2O2do stężenia 5x10-4 M. Rozcieńczyć startery 1/20 w dH2O2O (5 μl/95 μl dH2O)2o; 25 μM). Sekwencje oligonukleotydów dla każdego startera do typowania flagelliny opisano w Tabeli 1.
- Wyjmij odczynniki do PCR oraz matrycę z zamrażarki w temperaturze -20°C i pozostaw odczynniki oraz próbki do rozmrożenia na lodzie. Polimerazę Taq DNA pozostaw w zamrażarce do momentu jej użycia.
- Należy odmierzyć odczynniki do mieszaniny reakcyjnej PCR do allelotypowania zgodnie z opisem w Tabeli 1.
- Do każdego z 10 dołków o okrągłym dnie w sterylnej polistyrenowej płytce mikrotitracyjnej z 96 dołkami nanieś 9 μl mieszaniny reakcyjnej PCR, zaczynając od góry kolumny (np. A1) i przesuwając się w dół kolumny do góry kolejnej.
- Dodać 1 μl dH2O2Dodaj 9 μl mieszaniny PCR (kontrola bez DNA) do pierwszej studni (A1), a następnie 0,5 μl matryc kontroli pozytywnej (startery do typowania i/g,m – Typhimurium i Enteritidis; startery do typowania r/z10 – Heidelberg i Hadar; oraz startery do typowania 1,2/e,n,x – Typhimurium i Hadar) do 9 μl mieszaniny PCR w drugiej studnind do studzienki (B1) oraz 1 μl Escherichia coli K12 DH5α do 9 ml mieszaniny PCR w trzecim dołku (C1).
- Do każdego z pozostałych dołków (D1-H1; A2, B2) dodać 1 μl rozmrożonej matrycy próbki do 9 μl mieszaniny reakcyjnej PCR. W przypadku PCR do typowania allelicznego i/g, m, S. enterica serowar Typhimurium (i) oraz Enteritidis (g,m) służą jako kontrole pozytywne, a Serotypy Salmonella Heidelberg (r) i Hadar (z10) stanowią kontrole pozytywne dla r/z10 multiplexowa reakcja PCR w allelotypowaniu.
- Umieścić kapilary szklane o pojemności 10 μl w odpowiednich uchwytach urządzenia Idaho Technology Rapidcycler (8).
- Po zamocowaniu w uchwycie należy napełnić każdą kapilarę szklaną mieszaniną reakcyjną do PCR, dotykając kapilarą dna dołków płytki mikrotitracyjnej. Należy przechylić uchwyt, aby ciecz spłynęła w dół rurki, pozostawiając wolną przestrzeń między końcami a mieszaniną PCR, a następnie zgrzać szklane rurki palnikiem butanowym, uszczelniając oba końce kapilar.
- Umieść kapilary i uchwyt w urządzeniu Idaho Technology Rapidcycler, a następnie przeprowadź reakcję PCR, korzystając z programów termocyklera opisanych w tabeli 1 dla poszczególnych starterów do allelotypowania.
- Po zakończeniu programu termocyklera należy przystąpić do etapu elektroforezy w żelu.
3. Elektroforeza żelowa
Uwaga: Należy założyć inny fartuch laboratoryjny, przeznaczony do użytku w laboratorium elektroforezy, oraz nową parę jednorazowych rękawiczek lateksowych.
Uwaga: Należy nosić okulary ochronne z filtrem UV lub przyłbicę oraz zawsze używać rękawic podczas pracy z bromkiem etydyny, w szczególności z żelami agarozowymi.
- Przygotować 100 ml stopionej agarozy 1,5% (w/v) klasy biologii molekularnej w 1xTAE (lub 1X TBE) buforze do elektroforezy (7), wielokrotnie podgrzewając zawiesinę agarozy w kuchence mikrofalowej ustawionej na moc 20% w odstępach 2-5 min, prowadząc okresową kontrolę wizualną. Umieścić stopioną agarozę w łaźni wodnej o temperaturze 60°C aż do wyrównania temperatury z łaźnią.
- Przygotować formę do żelu wraz z grzebieniem przed wlaniem stopionej agarozy. Wybrać grzebień o odpowiedniej liczbie zębów, aby utworzyć wystarczającą liczbę oczek dla kontroli, próbek oraz co najmniej 3 markerów masy cząsteczkowej, które zostaną umieszczone na końcach i w środku żelu agarozowego.
- Do 100 ml stopionej agarozy 1,5% (w/v) w 1xTAE (lub TBE) dodać 2 μl bromku etydyny (10 mg/ml), delikatnie zakręcić butelką w celu wymieszania, unikając powstawania pęcherzyków powietrza, a następnie ostrożnie wlać zawartość butelki na środek formy do żelu agarozowego o wymiarach 15 by 10 cm. Użyć krawędzi chusteczki higienicznej lub ręcznika papierowego do usunięcia ewentualnych pęcherzyków powietrza w żelu agarozowym.
- Pozostawić formę w temperaturze pokojowej aż do zestalenia agarozy (˜30-45 min). Przenieść tackę z żelem i grzebieniem do zanurzeniowej, poziomej komory elektroforetycznej zawierającej bufor do elektroforezy 1X TAE (lub 1X TBE). Ostrożnie wyjąć grzebień z żelu agarozowego.
- Sprawdzić położenie tacki z żelem względem katody lub bieguna dodatniego komory elektroforetycznej, aby upewnić się, że biegun ten znajduje się u dołu żelu. Uwaga: Należy pamiętać, że ujemnie naładowane DNA migruje w stronę katody (tj. „biegnie do czerwonego”).
- Wymieszać 200 μl markerów masy cząsteczkowej DNA (0,25 μg/μl) z 40 μl 6X barwnika do ładowania DNA (DNA Loading Dye). Nanieść 4,8 μl tak przygotowanego markera masy cząsteczkowej DNA Molecular Weight Marker XIV do pierwszego, środkowego i ostatniego oczka.
- Nanieść każdą z próbek PCR, zaczynając od oczka 2 i przechodząc do każdego kolejnego oczka, od lewej do prawej. Unikać naniesienia próbki do któregokolwiek z oczek zawierających standard masy cząsteczkowej.
- Aby nanieść próbki znajdujące się w poszczególnych kapilarach szklanych:
- Wyjąć każdą kapilarę z uchwytu i naciąć oba jej końce przecinką szklanym.
- Położyć kciuk i palec wskazujący obu dłoni po obu stronach kapilary w miejscu zaznaczonym przecinką i przełamać kapilarę.
- Założyć dozownik kapilarny na koniec przeciwny do mieszaniny reakcyjnej PCR i powoli obracać tłokiem zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż ciecz znajdzie się na samym dole rurki.
- Umieścić kapilarę w oczku, do którego ma zostać naniesiona próbka, i powoli obracać tłokiem zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wydysponować próbkę obciążoną Ficoll-em do oczka agarozowego. Należy uważać, aby nie przebić dna oczka kapilarą ani nie wprowadzić pęcherzyka powietrza do oczka poprzez zbyt mocne obrócenie tłoka po tym, jak ostatnia kropla cieczy opuści kapilarę.
- Po naniesieniu wszystkich próbek i standardów ustawić stałe napięcie zasilacza na 90 V (9 voltów/cm żelu agarozowego).
- Przerwać elektroforezę, gdy czoło żółtego barwnika (taurazyny) znajdzie się 1 cm od dołu żelu.
- Po zakończeniu elektroforezy przenieść żel na transiluminator UV w celu wizualizacji fragmentów DNA i standardu masy cząsteczkowej. Rejestrować obraz na filmie Polaroid za pomocą aparatu Polaroid z pomarańczowym filtrem szklanym (ustawienia: 2 x oraz 4,5 y) lub jako obraz cyfrowy przy użyciu kamery CCD i wydrukować obraz za pomocą drukarki termicznej.
- Umieścić uchwyty do kapilar w 10% roztworze wybielacza na 15-30 min. Płukać 3 razy wodą dH2O i odłożyć do pomieszczenia z aparaturą PCR do wyschnięcia na powietrzu.
4. Reprezentatywne wyniki wielokrotnej reakcji PCR
Wyniki PCR w celu określenia allelotypu Salmonella izolaty 1–10 przedstawiono na rysunku 1 (ścieżki 3–12) i zinterpretowano w następujący sposób. Oznaczenie allelu O przypisano do Salmonella izolat na podstawie produktu amplifikacji (produktu PCR) o rozmiarze zgodnym z kontrolą PCR oraz przewidywanym dla zastosowanych zestawów starterów dla alleli O (3): B – 560 bp, C1 – 340 bp, C2 – 400 bp, D1 – 620 bp i E1 – 280 bp. Dla izolatów poddanych PCR w celu typowania alleli O (Ryc. 1A) przypisaliśmy allele O: B (ścieżki 10–13), C1 (ścieżki 7–9), C2 (ścieżki 4, 5), D1 (ścieżka 3) i E1 (ścieżka 6) do dziesięciu Salmonella izolaty przebadane w ścieżkach 3–12. Te same Salmonella izolaty przebadano, w tej samej kolejności co na rys. 1A, pod kątem alleli H1: i; g,m; r oraz z10 (rys. 1B,C). Ponownie, każdemu izolatowi przypisano allel H1 w zależności od obecności amplikonu o rozmiarze zgodnym z kontrolą PCR oraz przewidywanym dla 4 zastosowanych zestawów starterów do alleli H1 (3): i – 510 bp (rys. 1B, ścieżka 2); g,m – 310 bp (rys. 1B, ścieżka 2); r – 170 bp (rys. 1C, ścieżka 2) oraz z10 – 360 bp (rys. 1C, ścieżka 2). Allele H1 przypisano do jednego z dziesięciu Salmonella izolaty: i - izolaty 3 i 8 (ryc. 1B, ścieżki 5 & 10); g,m- izolaty 1 i 5 (Ryc. 1B, ścieżki 3 & 7), r do izolatów 6 i 9 (Ryc. 1C, ścieżki 8 & 11); a z10 do izolatów 2, 7 i 10 (Rys. 1C, ścieżki 4, 9, &12). Salmonella izolat 4 był ujemny w badaniu czterech testowanych alleli H1. Na koniec, Salmonella Izolaty przebadano metodą PCR pod kątem alleli H2 związanych z kompleksem antygenowym 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 oraz kompleksem antygenowym e,n,x; e,n,z15. Zestawy starterów dla kompleksu H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 oraz kompleksu H2 e,n,x; e,n,z15 generują odpowiednio amplikony o długości 290 bp i 150 bp (3). Zestawy starterów nie pozwalają na rozróżnienie konkretnych alleli H2 w obrębie żadnego z kompleksów antygenowych H2, co uniemożliwia przypisanie izolatowi ostatecznego typu allelu, np. 1,2 (3). Salmonella izolaty 4, 6, 8-10 były dodatnie w kierunku alleli H2 związanych z kompleksem antygenowym H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7, podczas gdy izolaty 2 i 7 były dodatnie w kierunku alleli H2 związanych z kompleksem antygenowym e,n,x; e,n,z15 (dane nie zostały przedstawione). Podczas gdy Salmonella izolaty 1, 3 i 5 były ujemne w kierunku dwóch kompleksów antygenów H2, przy czym tylko izolaty 1 i 5 były ujemne w kierunku flagelliny H2, co ustalono za pomocą ogólnej reakcji PCR dla flagelliny H2 (1) (dane nie przedstawiono). Wyniki te zestawiono w Tabeli 2 wraz z domniemanymi serotyp Salmonella przypisany do każdego izolatu.
Rysunek 1. Multiplex PCR do identyfikacji specyficznych alleli O i H związanych z serowarami S. enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium. (A) Multiplex PCR dla alleli O. (B,C) Multiplex PCR dla alleli H1 w celu identyfikacji alleli flagelliny: i/g,m (B) oraz r/z10 (C). Ścieżki 1 i 13: drabinka 100 bp (Promega; Madison, WI); ścieżka 2: kontrole multiplex PCR dla alleli O B, C1, C2, D1 i E (A), alleli H1 i/g,m (B) oraz alleli H1 r/z10 (C); ścieżki 3-12: izolaty Salmonella 1-10 (Tabela 2).
| Mieszanina PCR (Master Mix) | Termocykler (Rapidcycler) | ||||
| Odczynniki | Skład/stężenie | Ilość | Parametry | Oczekiwany rozmiar | |
| H1 i/g,m | |||||
| dH2O | 63 μl | Program 1 | 94°C przez 1 min | ||
| Bufor PCR 10X | 20 mM MgCl2 | 10 μl | Program 2 | 94°C przez 1 s | |
| 500 mM Tris pH8 | 55°C przez 1 s | ||||
| 2,5 mg/ml BSA | 72°C przez 20 s | ||||
| 5% Ficoll 400 | Przez 40 cykli | ||||
| 10 mM Tartrazyna | Nachylenie (Slope) = 2,0 | ||||
| Starter i (f)* | AACGAAATCAACAACAACCTGC | 2 μl | Program 3 | 72°C przez 4 min | 510 bp |
| Starter i (r)* | TAGCCATCTTTACCAGTTCCC | 2 μl | |||
| Starter g,m (f)* | GCAGCAGCACCGGATAAAG | 2 μl | 310 bp | ||
| Starter g,m (r)* | CATTAACATCCGTCGCGCTAG | 2 μl | |||
| DMSO | 5 μl | ||||
| dNTP | 10 mM | 2 μl | |||
| Taq | 5 jednostek/μl | 2 μl | |||
| 90 μl | |||||
| H1 r/z10 | |||||
| dH2O | 55 μl | Program 1 | 94°C przez 1 min | ||
| Bufor PCR 10X | 30 mM MgCl2 | 10 μl | Program 2 | 94°C przez 1 s | |
| 500 mM Tris pH8 | 55°C przez 1 s | ||||
| 2,5 mg/ml BSA | 72°C przez 20 s | ||||
| 5% Ficoll 400 | Przez 40 cykli | ||||
| 10 mM Tartrazyna | Nachylenie (Slope) = 2,0 | ||||
| Starter r (f)* | CCTGCTATTACTGGTGATC | 4 μl | Program 3 | 72°C przez 4 min | 170 bp |
| Starter r (r)* | GTTGAAGGGAAGCCAGCAG | 4 μl | |||
| Starter z10 (f)* | GCACTGGCGTTACTCAATCTC | 4 μl | 360 bp | ||
| Starter z10 (r)* | GCATCAGCAATACCACTCGC | 4 μl | |||
| DMSO | 5 μl | ||||
| dNTP | 10 mM | 2 μl | |||
| Taq | 5 jednostek/μl | 2 μl | |||
| 90 μl | |||||
| Mieszanina PCR (Master Mix) | Termocykler (Rapidcycler) | ||||
| Odczynniki | Skład/stężenie | Ilość | Parametry | Oczekiwany rozmiar | |
| H2 1,2/e,n,x | |||||
| dH2O | 63,6 μl | Program 1 | 94°C przez 1 min | ||
| Bufor PCR 10X | 20 mM MgCl2 | 10 μl | Program 2 | 94°C przez 1 s | |
| 500 mM Tris pH8 | 55°C przez 1 s | ||||
| 2,5 mg/ml BSA | 72°C przez 20 s | ||||
| 5% Ficoll 400 | Przez 40 cykli | ||||
| 10 mM Tartrazyna | Nachylenie (Slope) = 2,0 | ||||
| Starter 1,2 (f)* | AGAAAGCGTATGATGTGAAA | 2 μl | Program 3 | 72°C przez 4 min | 290 bp |
| Starter 1,2 (r)* | ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC | 2 μl | |||
| Starter e,n,x (f)* | TAACTGGCGATACATTGACTG | 2 μl | 150 bp | ||
| Starter e,n,x (r)1 | TAGCACCGAATGATACAGCC | 2 μl | |||
| DMSO | 5 μl | ||||
| dNTP | 10 mM | 2 μl | |||
| Taq | 5 jednostek/μl | 2 μl | |||
| 90 μl | |||||
| Generyczny H2 | |||||
| dH2O | 72 μl | Program 1 | 94°C przez 1 min | ||
| Bufor PCR 10X | 30 mM MgCl2 | 10 μl | Program 2 | 94°C przez 10 s | |
| 500 mM Tris pH8 | 45°C przez 10 s | ||||
| 2,5 mg/ml BSA | 72°C przez 35 s | ||||
| 5% Ficoll 400 | Przez 40 cykli | ||||
| 10 mM Tartrazyna | Nachylenie (Slope) = 2,0 | ||||
| Starter fljB (f) * | CAAGTAATCAACACTAACAGTC | 2 μl | Program 3 | 72°C przez 4 min | 1 500 bp |
| Starter fljB (r) * | TTAACGTAACAGAGACAGCAC | 2 μl | |||
| dNTP | 10 mM | 2 μl | |||
| Taq | 5 jednostek/μl | 2 μl | |||
| 90 μl | |||||
Tabela 1. Protokół PCR do allelotypowania flagelliny Salmonella: skład, warunki i oczekiwane wyniki.
*Stężenie roztworu roboczego starterów oligonukleotydowych do PCR wynosi 25 μM
| Izolować | Allele O | Allele H1 | Allele H2 | serowar | |||||||||
| B | C1 | C2 | D1 | E | i | g, m | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | z10 | 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 | e,n,x; e,n,z15 | Generyczny1 | ||
| 1 | - | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | Enteritidis |
| 2 | - | - | + | - | - | - | - | - | + | - | + | + | Hadar/Stambuł3 |
| 3 | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | + | Kentucky |
| 4 | - | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - | + | Nieznany |
| 5 | - | + | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - | Montevideo |
| 6 | - | + | - | - | - | - | - | + | - | + | - | + | Infantis lub Virchow2 |
| 7 | - | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | + | Mbandaka |
| 8 | + | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | + | Typhimurium |
| 9 | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | - | + | Heidelberg |
| 10 | + | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | + | Haifa |
Tabela 2. Wyniki PCR allelotypowania (Rys. 1) i oznaczenie serowaru Salmonella na podstawie identyfikacji alleli O, H1 i H2
>
1PCR H2 generuje amplikon o wielkości 1,5 kb dla wszystkich szczepów Salmonella posiadających flagellinę H2, niezależnie od allelu H2 (1). Ta metoda PCR jest stosowana do rozróżnienia monofazowych od bifazowych szczepów Salmonella.
2Multiplex PCR H2 nie pozwala na rozróżnienie poszczególnych alleli w obrębie kompleksu antygenowego H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 (3).
3Konwersja fagowa S. enterica serowaru Hadar modyfikuje antygen O LPS, prowadząc do powstania serowaru Istanbul. PCR do typowania allelicznego antygenu O nie jest w stanie wykryć tych subtelnych zmian genetycznych/antygenowych.
| Serowar1 | Allele O | Allele H1 | Allele H2 | |||||||||
| B | C1 | C2 | D1 | E | i | g,m | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | z10 | 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 | e,n,x; e,n,z15 | Generyczny2 | |
| Kalifornia | + | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - |
| Typhimurium | + | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | + |
| Heidelberg | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | - | + |
| Haifa | + | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | + |
| Montevideo | - | + | - | - | - | - | + | - | - | + | - | + |
| Othmarschen | - | + | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - |
| Ateny | - | + | - | - | - | + | - | - | - | - | + | + |
| Papuana | - | + | - | - | - | - | - | + | - | - | + | + |
| Mbandaka | - | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | + |
| Chincol | - | - | + | - | - | - | + | - | - | - | + | + |
| Kentucky | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | + |
| Hadar/Stambuł3 | - | - | + | - | - | - | - | - | + | - | + | + |
| Enteritidis | - | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - |
| Seremban | - | - | - | + | - | + | - | - | - | + | - | + |
| Campinense | - | - | - | + | - | - | - | + | - | - | + | + |
| Lome | - | - | - | + | - | - | - | + | - | - | - | + |
| Portland | - | - | - | + | - | - | - | - | + | + | - | + |
| Rwanda | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - | + | + |
| Treguier | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - | - | + |
| Simi | - | - | - | - | + | - | - | + | - | - | + | + |
| Weltevreden | - | - | - | - | + | - | - | + | - | - | - | + |
| Kristianstad | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | + | + |
| Biafra | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | - | + |
Tabela 3.Salmonella enterica serowary zidentyfikowane metodą PCR allelotypowania
1Serowary wyróżnione pogrubioną czcionką są tymi, z którymi częściej spotykają się laboratoria diagnostyczne lub mikrobiologii żywności.
2PCR H2 generuje amplikon o długości 1,5 kb dla wszystkich szczepów Salmonella posiadających flagellinę H2, niezależnie od allelu H2 (1). Ten PCR jest stosowany do odróżnienia monofazowych od bifazowych szczepów Salmonella.
3Konwersja fagowa S. enterica serowaru Hadar zmienia antygen LPS O, prowadząc do powstania serowaru Istanbul. PCR allelotypowania O nie pozwala na wykrycie tych subtelnych zmian genetycznych/antygenowych.
Dyskusja
Większość dostępnych komercyjnie testów PCR do wykrywania Salmonella celuje w geny unikalne dla tego rodzaju (np. invA). Jednak nie wszystkie szczepy Salmonella wykazują taką samą zdolność do wywoływania chorób u ludzi lub taką samą rozpowszechnioność w populacjach zwierząt. Wczesne rozpoznanie różnic antygenowych w antygenie O LPS Salmonella oraz antygenach flagelliny H1 i H2 doprowadziło do zróżnicowania Salmonella na ponad 2500 serowarów w oparciu o te różnice antygenowe. W rodzaju Salmonella zidentyfikowano 46 różnych antygenów O i 86 różnych antygenów flagelliny (H). Salmonella może posiadać jedną (H1) lub dwie różne (H1&H2) flagelliny. Różne kombinacje antygenów O, H1 i H2 odpowiadają za 2500 serowarów Salmonella rozpoznawanych obecnie. Serowar jest przypisywany na podstawie wzoru antygenowego wynikającego z identyfikacji poszczególnych antygenów O i H. Wzór antygenowy zapisuje się jako O: H1: H2; gdzie znak „-” odnosi się do braku flagelliny H1 lub H2, a „NT” (non-typeable) do Salmonella ujemnych pod kątem antygenu O. Na przykład serowar Typhimurium jest przypisywany izolatowi S. enterica o wzorze antygenowym B: i: 1,2, podczas gdy serowar Enteritidis jest przypisywany izolatowi o wzorze D1: g,m: -. Ta zmienność antygenowa w populacji Salmonella jest zewnętrznym przejawem różnic na poziomie nukleotydów, które można zatem łatwo wykorzystać w metodzie PCR.
Zidentyfikowaliśmy różnice genetyczne związane z konkretnymi allelami O i H, aby opracować PCR do allelotypowania w celu identyfikacji serowarów S. enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg oraz Typhimurium (3). Prawidłowe przypisanie i raportowanie serowaru Salmonella wymaga przetestowania wszystkich alleli związanych z formułami antygenowymi O: H1: H2 dla Enteritidis (D1: g,m: -), Hadar (C2: z10: e,n,x), Heidelberg (B: r: 1,2) oraz Typhimurium (B: i: 1,2). Bez znajomości allela O lub antygenu, samo stwierdzenie obecności allela H1 g,m nie musi jednoznacznie identyfikować izolatu Salmonella jako Enteritidis, ponieważ inne serowary Salmonella: Agona, California i Montevideo również posiadają ten sam allel. Choć PCR do allelotypowania został pierwotnie zaprojektowany do wykrywania wspomnianych serowarów Salmonella, test ten może zidentyfikować dodatkowe 19 serowarów (Tabela 3). Nasz PCR do allelotypowania został pierwotnie opracowany do wykrywania alleli O i H. W praktyce, podczas pracy z izolowanymi kulturami Salmonella, bardziej praktyczne i efektywne kosztowo stało się dla nas identyfikowanie antygenu O za pomocą testu aglutynacji na szkiełku, przy użyciu antisera specyficznych dla O, zamiast przeprowadzania PCR do allelotypowania O. Zalecamy jednak stosowanie PCR do allelotypowania O, jeśli laboratorium wykorzystuje ten PCR jako przesiew (2) lub do typowania izolatów Salmonella dostarczonych na kartach FTA (6), oraz dołączenie PCR specyficznego dla Salmonella do pierwszego przesiewu próbek (4). Ogranicz wykonanie PCR do allelotypowania wyłącznie do tych próbek, które zostały zidentyfikowane jako Salmonella za pomocą PCR lub testów biochemicznych/antygenowych.
Protokół opisany w niniejszym artykule został zoptymalizowany do pracy z urządzeniem Idaho Technology Rapidcycler, termocyklerem z ogrzewaniem powietrznym, który umożliwia zmniejszenie objętości reakcji i skrócenie czasu trwania cykli w porównaniu z wieloma termocyklerami z blokiem grzejnym. Adaptacja tego protokołu do pracy z termocyklerem z blokiem grzejnym może wymagać empirycznej optymalizacji warunków reakcji poprzez obniżenie lub podwyższenie temperatury przyłączania, dostosowanie stężeń starterów lub zmiana stężeń MgCl2. Przykładowo, w przypadku termocyklera MJ Research PTC-200 protokół musieliśmy dostosować w następujący sposób: przy zachowaniu tych samych objętości reakcji, które opisano w Tabeli 1, stężenie robocze zestawu starterów i rozcieńczono do 2,5 μM, temperaturę przyłączania obniżono z 55°C do 45°C, a czasy inkubacji w etapach denaturacji, przyłączania i elongacji wydłużono do 20 s dla PCR typowania allelicznego i/g, m. Zastosowanie odpowiednich kontroli pozytywnych i negatywnych jest niezbędne podczas wstępnego uruchamiania i optymalizacji każdej reakcji PCR, w tym w przypadku protokołów opublikowanych. Zalecamy pozyskanie znanych serowarów Salmonella, a konkretnie Anatum (E1: e,h: 1,6), Enteritidis (D1: g,m: -), Hadar (C2: z10: e,n,x), Heidelberg (B: r: 1,2), Montevideo (C1: g,m,s: 1,2,7) oraz Typhimurium (B: i: 1,2), a także laboratoryjnego szczepu Escherichia coli K12 (DH5α, LE393, JM109 itp.) jako odpowiednio kontroli pozytywnych i negatywnych dla testów PCR typowania allelicznego opisanych w tym artykule. Niektóre z tych serowarów Salmonella będą służyć jako kontrole pozytywne lub negatywne, w zależności od tego, który allel jest badany.
Podczas przeprowadzania tej oraz każdej innej diagnostycznej reakcji PCR należy przestrzegać określonych środków ostrożności i wytycznych. Po pierwsze, kluczowe dla zapobiegania możliwemu zanieczyszczeniu przeniesionemu (carry-over contamination) oraz błędnemu raportowaniu wyników fałszywie dodatnich jest fizyczne oddzielenie etapu przygotowania matrycy, przygotowania mieszaniny PCR oraz elektroforezy w żelu. Ponadto w każdej rutynowej procedurze PCR niezbędne jest zastosowanie odpowiednich kontroli, ponieważ pozwalają one na identyfikację problemów w momencie ich wystąpienia i pomagają w interpretacji wyników (5). Co najważniejsze, niezbędna jest konsekwencja, zwłaszcza w odniesieniu do warunków elektroforetycznych służących do detekcji amplikonów (produktów PCR) i szacowania ich wielkości. Aby zilustrować ten punkt, na rysunku 1A celowo przerwaliśmy elektroforezę wcześniej niż planowano. Standardy masy cząsteczkowej (ścieżki 1 i 13) oraz kontrola dodatnia (ścieżka 2) nie są wystarczająco rozdzielone, aby można było precyzyjnie oszacować wielkość fragmentów lub zaobserwować ich rozdział w przypadku niewielkich różnic w wielkości (˜50 bp). Odpowiednie rozdzielenie fragmentów DNA, w szczególności standardów masy cząsteczkowej, jest niezbędne, ponieważ raportowanie wyników dodatnich zależy od dokładnego oszacowania wielkości amplikonu i odróżnienia „prawdziwie dodatniego” wyniku od niespecyficznych amplikonów, które czasami obserwuje się podczas codziennego prowadzenia dowolnej reakcji PCR (5). Na przykład na rysunku 1B w ścieżce 7 widoczny jest niespecyficzny amplikon (o wielkości ˜700 bp). Gdyby elektroforezę przerwano zbyt wcześnie, gdyby czoło barwnika znajdowało się dopiero w połowie żelu agarozy, różnica między fragmentami DNA o wielkości 500 bp a 700 bp byłaby niewielka. W konsekwencji próbka w ścieżce 7 zostałaby błędnie zaraportowana jako dodatnia dla alleli i oraz g,m.
Na koniec należy uznać ograniczenia związane z każdym testem. Kilka procedur PCR do allelotypowania H1/H2 nie posiada mocy dyskryminacyjnej pozwalającej na rozróżnienie subtelnych różnic genetycznych w allelach należących do kompleksu antygenowego H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7, kompleksu antygenowego e,n,x/e,n,z15 oraz kompleksu antygenowego H1 G, który obejmuje allel g,m. Różne epitopy obecne w tych antygenach wiciowych wynikają ze zmiany jednego lub dwóch aminokwasów. Trudne było zatem zaprojektowanie starterów, które mogłyby wykorzystać te, niekiedy pojedyncze, różnice w parach zasad w sekwencji genu flagelliny (3). Na przykład serowary Salmonella Dublin (D1: g,p: -) i Berta (D1: f,g,t: -) dają również wynik dodatni w PCR z użyciem naszych starterów do allelotypowania g,m. Startery do allelotypowania H2 nie potrafią odróżnić szczepu Typhimurium (B: i : 1,2) od Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) od Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), Remo (B: r: 1,7) lub Hadar (C2: z10: e,n,x) od Glostrup (C2: z10: e,n,z15). Choć prawdopodobieństwo napotkania niektórych z tych serowarów: Lagos, Bradford, Winneba, Remo lub Glustrup jest niewielkie, jest to możliwe i wymaga albo zamieszczenia informacji o ograniczeniach testów, albo przeprowadzenia innego testu potwierdzającego.
Podsumowując, ta metoda serotypowania oparta na PCR pozwala na szybką identyfikację serowarów S. enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium, a także alleli O, H1 i H2 związanych z 19 dodatkowymi serowarami. Analiza ta stanowi szybką i kosztowo efektywną alternatywę dla tradycyjnego podejścia mikrobiologicznego do serotypowania Salmonella.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez granty USDA 1999-35212-8680, 2005-01378 oraz 2010-04288-01, fundusze formułowe USDA oraz grant stanu Georgia na badania rolnicze w zakresie medycyny weterynaryjnej. Protokół opisany w niniejszej publikacji został opracowany do użytku przez studentów studiów licencjackich w ramach kursów badań kierowanych: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L oraz BIOL 4960H na University of Georgia i był wykorzystywany przez studentów w kilku projektach badawczych z zakresu epidemiologii molekularnej w laboratorium Maurera. Pragniemy podziękować wszystkim studentom studiów licencjackich, którzy prowadzili badania w laboratoriach Maurera i Lee, a także kierownikowi naszego wydziału, Johnowi Glissonowi, za wsparcie naszych wysiłków w zakresie integracji nauczania na poziomie licencjackim z działalnością badawczą.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Luria Bertani | Fisher Scientific | (lub dowolne porównywalne źródło) | |
| Probówki do mikrowirówki | Fisher Scientific | pojemność 1.5 ml | (lub dowolne porównywalne źródło) |
| Ethanol | Fisher Scientific | 200 proof | (lub dowolne porównywalne źródło) |
| dH2O | Sigma-Aldrich | klasa Molecular Biology Grade | (lub dowolne porównywalne źródło; tylko do PCR) |
| 10 x Bufor do PCR: | Idaho Technologies | 20 mM MgCl2 | (bufor zawiera BSA, Ficoll i tartrazynę) |
| 30 mM MgCl2 | |||
| 40 mM MgCl2 | |||
| Startery do PCR | |||
| DMSO | |||
| dNTP | Roche Group | (lub dowolne porównywalne źródło) | |
| Taq polimeraza DNA | Denville Scientific | (lub dowolne porównywalne źródło) | |
| Pipety kapilarne | Idaho Technologies | objętość 10 µl | |
| Szybki cykler (Rapid Cycler) | Idaho Technologies | ||
| Agaroza | Bio-Rad | Low EEO; klasa Molecular Biology Grade | (lub dowolne porównywalne źródło) |
| Bufor 50 X TAE lub bufor 5X TBE | Fisher Scientific | (lub dowolne porównywalne źródło) | |
| Bromek etydyny | Bio-Rad | (lub dowolne porównywalne źródło) | |
| Horyzontalna, zanurzeniowa komora do elektroforezy w żelu z formą do żelu | Bio-Rad | (lub dowolne porównywalne źródło) | |
| Zasilacz | Bio-Rad | (lub dowolne porównywalne źródło) | |
| System obrazowania molekularnego Gel Doc | Bio-Rad | (lub dowolne porównywalne źródło) | |
| Tabela 4. Materiały |
Bibliografia
- Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica. J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.
- Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles. J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).
- Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles. BMC Microbiol. , (2008).
- Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments. J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).
- Maurer, J. J. Rapid detection and limitation of molecular techniques. Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).
- Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper. Avian Dis. 50, 391-396 (2006).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
- Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air. Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).
Przedruki i uprawnienia
