Wychwytywanie limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem jednorazowego chipa mikroprzepływowego w badaniach nad HIV

Protokół

1. Przygotować kanał mikrofluidyczny z powierzchnią biotynilowaną przeciw CD4⁺.
2. Wstrzyknąć 10 ml próbki krwi do kanału mikrofluidycznego za pomocą pompy strzykawkowej z prędkością 5 ml/min.
3. Wypłukać krew roztworem PBS z prędkością 20 ml/min przez 20 min.
4. Wstrzyknąć rozcieńczony roztwór lizujący FACS (rozcieńczony z roztworu zapasowego do 10% w PBS) z prędkością 5ul/min przez 15 min.
5. Inkubować przez 15 min.
6. Wstrzyknąć roztwór przeciwciał pierwotnych CD3⁺ (rozcieńczony z roztworu zapasowego do 10% w PBS) z prędkością 5 ml/min przez 20 min.
7. Inkubować przez 2 godziny.
8. Wypłukać kanał roztworem PBS z prędkością 5 ml/min przez 15 min.
9. Wstrzyknąć jednocześnie 20% przeciwciał AF488 CD4⁺, 0,2% roztwór zapasowy DAPI oraz 10% przeciwciał wtórnych CD3⁺ z prędkością 5 ml/min przez 20 min.
10. Inkubować przez 20 min.
11. Wypłukać kanał roztworem PBS z prędkością 5 ml/min przez 15 min.
12. Policzyć komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym:
    1. Biały (optyczny) - czarno-białe: komórki i zanieczyszczenia
    2. UV(DAPI) - niebieskie: tylko komórki
    3. Niebieski(CD4⁺) - zielone: limfocyty T i monocyty
    4. Zielony(CD3⁺) - czerwone: tylko limfocyty T

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
mikrokanał PDMS				Wykonane za pomocą formy z SU-8
Krew				Krew donowana od zdrowego dawcy. Mass General Hospital, 10 X leukocyty o wysokiej gęstości (WBC) lub Brigham and Women’Szpital.
PBS	Bufor	Invitrogen	14190	1x Dulbecco’bufor fosforanowy (PBS)
roztwór lizujący FACS		BD Biosciences	349202	Rozcieńczono do stężenia 10% z roztworu zapasu w buforze PBS.
biotynylowane przeciwciało anty-CD4+		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Powierzchnia przygotowana z biotynilowanego przeciwciała anty-CD4+, rozcieńczonego do 10% z roztworu zapasowego w PBS/BSA po wymieszaniu 0,2 mg roztworu zapasowego z 1 ml wody dejonizowanej.
przeciwciało kozie anty-hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Rozcieńczono do stężenia 10% z roztworu stokowego w PBS
królicze przeciwciało przeciwko kozim IgG znakowane PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Przeciwciało wtórne przeciwko przeciwciału anty-CD3, rozcieńczone do 10% z roztworu zapasu w PBS
anty-ludzkie CD4+		BD Biosciences	557695	oznaczone Alexa Fluor 488, rozcieńczone do stężenia 20% z roztworu zapasowego w PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	4’6-dianidyno-2-fenyloindol, roztwór dichlorowodorku, rozcieńczony do stężenia 0,2% z roztworu zapasowego w PBS.