Opryszczkowe zapalenie skóry (DH) jest przewlekłym stanem zapalnym charakteryzującym się reakcją autoimmunologiczną między IgA a transglutaminazą epidermalną (eTG). DH rozwija się u niewielkiej części pacjentów z nadwrażliwością na gluten i/lub celiakią. Wyniki niniejszego badania wskazują, że DH może rozwijać się również u małpy z gatunku makaka rezusa z objawami idiopatycznego zapalenia skóry.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rozpoznanie transglutaminazy epidermalnej przez przeciwciała IgA i przeciwciała przeciwko tkankowej transglutaminazie 2 w rzadkim przypadku zapalenia skóry u Rhesus
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tkankowa transglutaminaza 2 (tTG2) jest jelitowym enzymem trawiennym, któryy deamiduje częściowo strawione już białka glutenu z pożywienia, np. peptydy gliadyny. U osób predysponowanych genetycznie tTG2 wywołuje odpowiedzi autoimmunologiczne charakteryzujące się produkcją przeciwciał przeciwko tTG2 i ich bezpośrednim osadzaniem się w ścianie jelita cienkiego 1,2. Obecność takich przeciwciał stanowi jedną z głównych cech charakterystycznych celiakii (CD). Epidermalna transglutaminaza (eTG) to kolejny członek rodziny transglutaminaz, który u niewielkiej mniejszości pacjentów z CD może również pełnić rolę autoantygenu. W tych stosunkowo rzadkich przypadkach eTG wywołuje reakcję autoimmunologiczną (wysypkę skórną) znaną klinicznie jako opryszczkowa choroba skóry (DH). Choć dokładny mechanizm patogenezy CD i DH nie jest w pełni poznany, wiadomo, że tTG2 i eTG dzielą epitopy antygenowe, które mogą być rozpoznawane przez przeciwciała w surowicy pacjentów zarówno z CD, jak i z DH 3,4.
W niniejszym badaniu wykorzystano badanie mikroskopowe konfokalne próbek biopsyjnych z zmian skórnych u dwóch makaków rezus (Macaca mulatta) z zapaleniem skóry (Tabela 1, Rys. 1 i 2) w celu analizy zajętych tkanek. U jednego zwierzęcia (EM96) wykazano nakładanie się widm przeciwciał IgA i tTG2 (Rys. 3). Obecność komórek podwójnie dodatnich tTG2+IgA+ koncentrowała się w głębokiej warstwie naskórka, wokół brodawek skóry właściwej. Jest to zgodne ze zmianami opisywanymi u pacjentów z DH 3. Po wprowadzeniu zwierzęcia EM96 na dietę bezglutenową zapalenie skóry, jak i złogi tTG2+IgA+, zniknęły i nie były już wykrywalne (Rys. 1-3). Zapalenie skóry pojawiło się jednak ponownie po ponownym wprowadzeniu glutenu do diety EM96 (nie pokazano). U innych makaków, w tym u zwierzęcia z niezwiązanym zapaleniem skóry, nie wykryto złogów tTG2+IgA+. Remisja zapalenia skóry u EM96 zależna od diety bezglutenowej, wraz z obecnością komórek tTG2+IgA+ w skórze, sugeruje autoimmunologiczny mechanizm rozwoju tego stanu, podobny do DH. Jest to pierwszy raport na temat zapalenia skóry przypominającego DH u naczelnych innych niż człowiek.
Protokół
1. Pobieranie próbek biopsji skóry
- Przed przystąpieniem do procedury biopsji skóry, podaj zwierzętom domięśniowo 2,5 mg/kg mieszaniny chlorowodorku tiletaminy i chlorowodorku zolazepamu (Telazol; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Monitoruj zwierzęta od momentu podania środka znieczulającego aż do utraty przytomności, a następnie wyjmij je z klatki.
- Usuń owłosienie z obszaru skóry zainteresowania, używając weterynaryjnej maszynki do strzyżenia Oster Golden A5 Single Speed z ostrzem nr 40 (Oster Professional Products, McMinnville, TN), a następnie przygotuj pole aseptycznie, naprzemiennie stosując betadynę i alkohol. Załóż sterylną draperię z otworem nad wybranym miejscem biopsji.
- Stosując technikę sterylną, przyłóż do skóry instrument do biopsji skóry Miltex Punch o średnicy 4,0 mm (Miltex, York, PA), obracając narzędzie o 180 stopni zgodnie i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara z lekkim naciskiem, aż do momentu, gdy treasures przebiją warstwy skóry i dotrą do tkanki podskórnej. Wyjmij próbkę do biopsji, chwyć wyciętą część skóry pęsetą i oddziel ją od tkanki podskórnej.
- Zamknij defekt skóry, używając nici nylonowej 3-0 z igłą tnącą 3/8 koła (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical Limited, Berkshire, UK), wykonując szew w kształcie krzyża. Wszystkim zwierzętom podaj domięśniowo 0,01 mg/kg chlorowodorku buprenorfiny (Hospira, Lake Forest, IL) w celu zapewnienia pooperacyjnego leczenia przeciwbólowego.
2. Obróbka próbek
- Należy pracować z próbkami biopsji skóry pobranymi od makaków rezus z przewlekłym zapaleniem skóry oraz od zdrowych osobników kontrolnych. Z każdego zwierzęcia należy pobrać od dwóch do trzech próbek biopsji (o średnicy 4 mm).
- Pierwszą próbkę utrwalono w formalinie cynkowej (Z-fix, Anatech Ltd., Battle Creek, MI) przez 24 godziny, przemyto w wodzie przez 30 min, krótko przemyto w 70% etanolu, a następnie umieszczono w procesorze tkanek ASP300 Leica (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS), gdzie tkankę odwodniono w rosnących stężeniach etanolu: 70%, 80%, 95% i 100% przez 48 min każdy (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), a następnie dwukrotnie wymieniono ksylen (Fisher).
- Próbki zatopiono w parafinie (Fisher) do długoterminowego przechowywania w temperaturze pokojowej. Przed skrawaniem schłodzono do -20oC na 20 min. Przygotowano skrawki o grubości 6 μm za pomocą mikrotomu obrotowego (HM325, Microm International, Waldorf, Germany). Skrawki umieszczono na szkiełkach ładunekowych (Fisher) i suszono na powietrzu w 60oC przez noc. Przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) standardową metodą (opisaną poniżej).
- Drugą próbkę utrwalono w 2% paraformaldehydzie (USB Corp, Cleveland, OH) przez 30 min w temperaturze pokojowej, przemyto trzykrotnie w buforze fosforanowym (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), pozostawiono w 30% sacharozie (Fisher) na 4 godziny, a następnie zatopiono w medium mrożącym OCT (Sakura Finetek, Torrence, CA). Przed skrawaniem przechowywano w -80oC przez 20 min. Przygotowano skrawki o grubości 15 μm za pomocą kriotomu (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).
3. Barwienie H&E
- Usunąć parafinę z zatopionych przekrojów poprzez trzykrotne płukanie w ksylenach (Fisher), a następnie nawodnić w szeregu stężeń etanolu: trzykrotne płukanie w 100%, dwukrotne w 95%, jednokrotne w 80% oraz w wodzie destylowanej, po 2 min każdego etapu.
- Barwić hematoksyliną (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) przez jedną minutę, a następnie krótko płukać pod bieżącą wodą z kranu.
- Barwić kontrastowo eozyną (Sigma) przez 6 min.
- Odwodnić zabarwione tkanki w etanolu 95% i absolutnym, dwa razy po 2 min, a następnie odbarwić w trzech zmianach ksylenów, po 3 min każda.
- Przymocować szkiełko coverglass przy użyciu medium montażowego Cytoseal Mounting Medium (Richard-Allan Scientific) na przekrojach tkanek zabarwionych metodą H&E.
4. Ocena histopatologiczna
Przezbadaj barwione H&E skrawki biopsji skóry pod mikroskopem świetlnym, stosując powiększenia od 4 do 40x oraz mikroskop Leica z cyfrową kamerą SPOT Insight (Digital Instruments Inc., Michigan, USA).
5. Barwienie immunofluorescencyjne
- Do barwienia immunofluorescencyjnego należy wykorzystać skrawki skóry zatopione w OCT. Przed barwieniem namoczyć je przez 20 min w PBS zawierającym 0,2% żelatyny ze skóry rybiej (FSG, Sigma) z dodatkiem 0,1% Triton X-100 (Sigma), aby usunąć OCT i przeprowadzić permeabilizację tkanki.
- Po wypłukaniu preparatów inkubować je z 10% normalnym surowicą kozią (NGS, Sigma), rozcieńczoną w PBS-FSG, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze do preparatów.
- W celu wizualizacji złogów przeciwciał IgA i tTG2 inkubować preparaty z przeciwciałami pierwszorzędowymi anty-rhesus IgA oraz anty-tTG2, rozcieńczonymi w 10% NGS-PBS-FSG, przez 1 godzinę.
- Przemyć PBS–FSG–Triton X-100 (Sigma) przez 10 min, a następnie PBS-FSG przez 10 min.
- Inkubować z wtórnymi, izotypowo specyficznymi przeciwciałami znakowanymi fluorochromami Alexa Fluor 488 (zielony), 568 (czerwony) lub 633 (niebieski) (Molecular Probes-Invitrogen) w rozcieńczeniu 1:1 000. Do wizualizacji DNA jądrowego użyć barwnika ToPro-3. Jako rozcieńczalnik przeciwciał zastosować 10% NGS-PBS-FSG.
- Do montowania zbarwionych skrawków tkanki użyć roztworu anty-quenching (Sigma).
6. Obrazowanie konfokalne
Obrazowanie należy przeprowadzić przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica TCS SP2 True Confocal Laser Scanning Microscope (Leica, Wetzlar, Niemcy) wyposażonego w trzy lasery (dostępnych sześć linii wzbudzenia): laser argonowo-kryptonowy o długości fali 488 nm (zielony), laser kryptonowy o długości fali 568 nm (czerwony) oraz laser helowo-neonowy o długości fali 633 nm (niebieski), które obejmują zakres od widzialnego do dalekoczerwonego obszaru widma. Należy zarejestrować obrazy w kontraście interferencyjnym różnicowym (DIC) w celu oceny architektury tkanki nieoznakowanej.
7. Reprezentatywne wyniki
Przykład pozytywnego rozpoznania eTG zarówno przez tTG2, jak i przeciwciała IgA przedstawiono na ryc. 3A. Zgodnie z sytuacją u pacjentów ludzkich oraz ze względu na znacznie niższą częstość występowania zapalenia skóry typu DH niż nadwrażliwości na gluten typu CD również u makaków rezus, oczekuje się, że większość próbek biopsji skóry wykaże reakcję pozytywną z przeciwciałami tTG2, ale bez obecności komórek podwójnie pozytywnych tTG2+IgA+ (ryc. 4). Przypadki niezwiązane z DH, w tym przypadki zapalenia skóry o pochodzeniu mikrobiologicznym, wykażą niektóre pojedynczo pozytywne komórki IgA+ rozproszone pod nabłonkiem, ale bez nakładania się widm markerów znakowanych tTG2 i IgA (ryc. 3B i 4). Dlatego ważne jest zachowanie kolejności sugerowanych procedur testowych, zaczynając od badania klinicznego (ryc. 1), a następnie oceny histopatologicznej (ryc. 2); dopiero w przypadku, gdy nie można zidentyfikować innych, częstszych czynników wywołujących zapalenie skóry, uzasadnione jest badanie biopsji skóry barwionych na tTG2 i IgA za pomocą mikroskopii konfokalnej. Same oceny kliniczne i/lub histopatologiczne nie są wystarczające do postawienia pozytywnej diagnozy tego stanu. W przypadkach, gdy w obszarze brodawek skórnych zidentyfikowane zostaną komórki podwójnie pozytywne (tTG2+IgA+), można postawić diagnozę zapalenia skóry typu DH. W takich sytuacjach zaleca się odstawienie glutenu z diety i wprowadzenie diety bezglutenowej w celu złagodzenia objawów zapalenia skóry.
Rysunek 1. Region pachwinowy makaka EM96 przed (A) i po (B) 5-tygodniowym odstawieniu glutenu z diety. Ponowne wprowadzenie glutenu do diety zbiegło się w czasie z ponownym pojawieniem się zapalenia skóry (C).
Rysunek 2. Barwienie HE biopsji skóry makaka EM96 pobranych przed (A) i po (B) 9-tygodniowym odstawieniu glutenu z diety. A: Nabłonek jest pogrubiony (7-15 warstw komórek nabłonkowych) z grubą, powierzchowną strupem z hiperkeratycznych komórek naciekniętych degenerującymi neutrofilami. Neutrofile występują również wewnątrz nabłonka i mieszają się z umiarkowaną liczbą limfocytów, plazmocytów i histiocytów wokół przydatków w górnej części skóry właściwej. B: Nadal występuje pewna hiperkeratoza, grubość nabłonka jest znormalizowana (4-7 warstw) przy minimalnym nacieku limfoplasmacytowym w górnej części skóry właściwej. C: Dla porównania dołączono normalną skórę brzucha makaka FR56, bez nacieku limfoplasmacytowego. Powiększenie 20x.
Rycina 3. Obrazy z mikroskopii konfokalnej biopsji skóry makaka EM96 pobranych przed (A) i po (B) 9-tygodniowym odstawieniu glutenu z diety. A: barwienie IgA (zielony), tTG2 (czerwony) i marker DNA jądrowego ToPro-3 (niebieski). Kolokalizacja IgA i tTG2 widoczna jest w kolorze żółtym wokół obszaru brodawek skóry właściwej. B: próbka skóry pobrana po 9 tygodniach diety bezglutenowej nie wykazuje obecności IgA w obrębie nabłonka, podczas gdy w obszarze podnabłonkowym wciąż obecne jest IgA (zielony), tTG2 (czerwony) i marker DNA jądrowego ToPro-3 (niebieski).
Rysunek 4. Obrazy z mikroskopii konfokalnej biopsji skóry małpy rhesus GI24 pobranych w czasie, gdy zwierzę przejawiało objawy przewlekłego zapalenia skóry (niezwiązanego z DH). Barwienie IgA jest zielone, tTG2 czerwone, a marker DNA jądrowego ToPro-3 jest niebieski. Komórki tTG2+ znajdują się w obrębie nabłonka, kilka komórek IgA+ pod nabłonkiem, przy czym nie obserwuje się rozległego nakładania się widm markerów czerwonego i zielonego.
| Znakowanie zwierząt | Płeć [M/K] | Wiek [Lata] | Objawy kliniczne | tTG2 w osoczu przeciwciała | Dieta [1,2]* |
| HJ71 | F | 1.3 | Zdrowy | - | 1 |
| HD13 | M | 1.4 | Zdrowa, sporadyczna biegunka | + | 1 |
| FR56 | M | 5.4 | Przewlekła idiopatyczna biegunka | - | 1 |
| EM96 | F | 5.0 | Przewlekłe zapalenie skóry | +/- (wynik graniczny) | 1 i 2 |
| GI24 | F | 4.6 | Przewlekłe zapalenie skóry | - | 1 |
Tabela 1. Małpy z gatunku rhesus macaque z TNPRC wykorzystane do pobrania biopsji skóry
* Dieta 1 – zwykła karma dla małp (zawierająca gluten); Dieta 2 – dieta bezglutenowa
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nasz nowo opracowany model nadwrażliwości na gluten u naczelnych niedzkości został niedawno wykorzystany do zbadania zmian przepuszczalności jelitowej wywołanych glutenem w diecie 5,6. U niektórych makaków z nadwrażliwością na gluten wykryto przeciwciała tTG2 w osoczu oraz złogi tTG2+IgA+ w jelitach. Ponieważ w ostatnim czasie zidentyfikowano rzadkie przypadki idiopatycznego zapalenia skóry u makaków rezus w kolonii, dla których nie udało się ustalić typowej etiologii (zakaźnej/metabolicznej), celem niniejszeg...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Amandzie Tardo, dr. Mostafie Bouljihadowi, Stephanie Feely, Carol Coyne, dr Erin Ribka, dr. Pete’owi Didierowi oraz Dorothy Kuebler za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01-DK076653 oraz 3R01-DK076653-02S1 przyznane K.S. oraz podstawowy grant operacyjny TNPRC RR000164.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało przeciw ludzkiej IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | roztwór roboczy 1:100 |
| Przeciwciało przeciw ludzkiej tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | roztwór roboczy 1:100 |
| Przeciwciało przeciw mysiej IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | roztwór roboczy 1:1,000 |
| Sonda DNA ToPro-3 *** | Invitrogen | T-3605 | roztwór roboczy 1:1,000 |
| Formalina cynkowa (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| Medium do zamrażania OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| Medium montażowe Cytoseal | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Roztwór przeciw wygaszaniu (Anti-Quenching) | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (szew nylonowy) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Przyrząd do dermalnej biopsji punch Miltex | Miltex Inc. | NA | |
| Jednobiegowa maszynka weterynaryjna Oster Golden A5 z głowicą nr 40 | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Procesor tkankowy Leica | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Mikrotom obrotowy | Microm International | HM325 | |
| Kriostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Mikroskop konfokalny | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Izotiocyjanian fluoresceiny ** Przeciwciało wtórne (skoniugowane z Alexa Fluor 568) stosowane po przeciwciałach pierwszorzędowych przeciw tTG2 *** Barwnik |
Bibliografia
- Diosdado, B., Wijmenga, C. Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients. Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).
- Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management. Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).
- Sardy, M. Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).
- Rose, C. Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet. J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).
- Bethune, M. Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques. PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).
- Mazumdar, K. Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques. PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).
- Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).
- Hunt, K. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).
- Abadie, V. Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis. Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
