Prosta metoda prowadnicy śrubowej do badań ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych u myszy

Podsumowanie

Aby ocenić nowe paradygmaty terapeutyczne w leczeniu glejaka, niezbędne są modele istotne fizjologicznie. Wykorzystujemy procedurę z implantowalną śrubą prowadzącą do tworzenia ksenograftów wewnątrzczaszkowych, która jest szybsza i bezpieczniejsza niż podejścia stereotaktyczne.

Streszczenie

Przeszczepianie ludzkich komórek nowotworowych do mózgu myszy z immunosupresją jest ugruntowaną metodą badania nowotworów mózgu, w tym glejaka wielopostaciowego (glejaka) i medulloblastoma. Powszechnie stosowane podejście stereotaktyczne pozwala na iniekcję tylko jednego zwierzęcia naraz, jest pracochłonne i wymaga wysoko specjalistycznego sprzętu. Metoda śruby prowadzącej, opracowana pierwotnie przez Lal et al.,¹ została stworzona w celu wyeliminowania uciążliwych procedur stereotaktycznych. Opisujemy obecnie zmodyfikowane podejście z użyciem śruby prowadzącej, które jest szybkie i wyjątkowo bezpieczne; oba te aspekty są krytycznymi rozważaniami etycznymi. Co istotne, nasza procedura obejmuje teraz pompę infuzyjną, która umożliwia jednoczesną iniekcję komórek nowotworowych u maksymalnie 10 zwierząt.

Aby zademonstrować użyteczność tej procedury, utworzyliśmy wewnątrzczaszkowe ksenoprzeszczepy ludzkich komórek glejaka U87MG u myszy, które następnie leczono AMG102; w pełni ludzkim przeciwciałem skierowanym przeciwko HGF/czynnikowi rozproszenia, będącym obecnie w fazie oceny klinicznej^2-5. Systemowe wstrzyknięcie AMG102 znacząco przedłużyło przeżycie wszystkich myszy z wewnątrzczaszkowymi ksenoprzeszczepami U87MG i doprowadziło do licznych całkowitych wyleczeń.

Niniejsze badanie wykazuje, że metoda wkrętu prowadzącego jest niedrogim i wysoce powtarzalnym podejściem do tworzenia wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów. Co więcej, dostarcza ona odpowiedniego modelu fizjologicznego do walidacji nowych strategii terapeutycznych w leczeniu nowotworów mózgu.

Protokół

1. Linie komórkowe

1. Komórki glejaka U87MG hoduje się w dużych kolbach do hodowli tkanek w pożywce DMEM-F12 uzupełnionej o 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
2. Komórki zbiera się poprzez dwukrotne przemycie kolb ciepłym solfizjologicznym roztworem buforowanym fosforanowo (PBS) i inkubowanie ich w 37°C przez 5 minut z użyciem 10 ml buforu PBS zawierającego 0,25% trypsyny i 0,05% EDTA. Po odklejeniu komórek przenosi się je do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki hodowlanej i wiruje (30 x g przez 4 min).
3. Po przemyciu komórki resuspenduje się do stężenia 10 x 10⁶/ml w pożywce hodowlanej, co pozwoliło na inokulację 50 00 komórek/5 μl.
4. Komórki przechowywa się w lodzie do momentu wstrzyknięcia dojamownego.

2. Intrakranialna stabilizacja za pomocą śrub prowadzących

Tę procedurę można przeprowadzić na kilka dni przed wstrzyknięciem komórek. Wszystkie opisane tutaj procedury były wykonywane w rygorystycznych warunkach sterylnych.

1. Myszy (samice BALB/c nu/nu; 5-6 tygodni; około 18g) są numerowane w celu identyfikacji, ważone i znieczulone poprzez wstrzyknięcie do jam brzusznej (IP) mieszaniny ketaminy (10 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg).
2. Skórę przecier się roztworem jodu, a następnie wykonuje niewielkie nacięcie (2-3 mm) wzdłuż prawej strony linii środkowej, przed linią międzyuszną. Odsłania to szwy wieńcowe i strzałkowe czaszki. Bregma znajduje się w miejscu połączenia tych dwóch szwów.
3. Punkt wejścia śruby prowadzącej jest następnie zaznaczany w odległości 2,5 mm bocznie i 1 mm przed bregmą. Punkt ten znajduje się bezpośrednio nad jądrem ogonowym¹.
4. Za pomocą sterylnego ręcznego wiertła skręcanego wierci się otwór o wymiarach 1 x 1 mm przez czaszkę aż do opony twardej.
5. Następnie w otwór wkręca się śrubokrętem sterylną śrubę prowadzącą, która będzie wystawać 1,6 mm poniżej powierzchni czaszki w głąb opony twardej, aż do wyrównania z powierzchnią czaszki (Rycina 1A).
6. Do centralnego otworu śruby prowadzącej wprowadza się sterylny stilet lub zaślepkę śruby, aby zamknąć otwór (Rycina 1B).
7. Ranę zamyka się klejem tkankowym Vetbond (n-butyl cyjanoakrylan), a myszom podaje się dożylnie zastrzyk z reversine (dla małych zwierząt) (0,1 ml/kg) oraz karprofenu (5 mg/kg/10 μl) w celu przeciwbólowym. Następnie myszy pozostawia się do wybudzenia na macie grzewczej (36°C), co może potrwać do 20 minut. W czasie wybudzania myszy są często monitorowane i obserwowane, aż do pełnego odzyskania przytomności.

3. Wewnątrzczaszkowe wszczepienie komórek

1. Przygotowuje się sterylną strzykawkę Hamiltona z ogranicznikiem, nakładając mały plastikowy pierścień na końcówkę igły w taki sposób, aby tylko 2 mm igły wystawało poniżej wylotu śruby prowadzącej (Ryc. 1B). Ostateczny punkt inokulacji znajduje się zatem 3,5 mm poniżej powierzchni czaszki.
2. Cztery dni po operacji wszczepienia śruby prowadzącej myszy ponownie znieczula się w opisany wcześniej sposób (2.1) i wykonuje niewielkie nacięcie nad śrubą prowadzącą, aby usunąć stylit.
3. Strzykawkę Hamiltona z ogranicznikiem napełnia się 5 μl dobrze wymieszanych komórek, dbając o to, aby nie powstały ani nie zostały zassać pęcherzyki powietrza.
4. Strzykawkę mocuje się do pompy perfuzyjnej, a igłę wprowadza do śruby prowadzącej (Ryc. 1C). Następnie komórki infunduje się z prędkością 30 μl na godzinę.
5. Zautomatyzowane urządzenie (Ryc. 1D) umożliwiło jednoczesne wstrzyknięcie preparatu do 10 zwierząt przy stałej prędkości przepływu. Komórki można również wstrzykiwać ręcznie, używając strzykawki Hamiltona z ogranicznikiem lub alternatywnie zastosować ogranicznik w postaci końcówki pipety o pojemności 20 μl, przyciętą o 3 mm, aby końcówka igły wystawała poza śrubę prowadzącą o 2 mm. W takim przypadku wstrzykiwanie musi być wykonywane we właściwym, stałym tempie.
6. Po zakończeniu infuzji ostrożnie usuwa się strzykawkę i ponownie wprowadza stylit do śruby prowadzącej. Ranę zamyka się za pomocą kleju, a myszom podaje się leki wspomagające rekonwalescencję jak wcześniej (2.7) i pozostawia do wybudzenia na macie grzewczej.

4. Wyzwanie terapeutyczne

1. Cztery dni po inokulacji komórek U87MG myszy są ważone i losowo dzielone na grupę kontrolną oraz grupę badawczą.
2. Grupa kontrolna otrzymuje dożylnie do jamy otrzewnej (IP) wtrysk PBS (100 μl), natomiast grupa badawcza otrzymuje wtrysk IP AMG102 (10 μg w 10 μl PBS).
3. Wtryski są powtarzane co drugi dzień przez 14 dni, łącznie wykonuje się 6 wtrysków (Rycina 2).
4. Po ostatnim wtrysku myszy są monitorowane codziennie i ważone co drugi dzień.
5. W momencie gdy u myszy zaczęły pojawiać się znaczne dysfunkcje neurologiczne (zaburzenia równowagi, paraliż), odwodnienie, utrata masy ciała powyżej 10% lub stan agonii, poddawano je humanitarnej eutanazji. Dni osiągnięcia tych humanitarnych punktów końcowych zapisywano następnie na krzywej przeżycia Kaplana-Meiera.

5. Ocena skuteczności terapeutycznej

1. Krzywa przeżycia Kaplana-Meiera została wygenerowana przy użyciu programu GraphPad Prism 4.03 dla systemu Windows; GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com³. Zgony lub eutanazje zaznaczono jako zdarzenia końcowe i oceniono jako 1. Zwierzęta, które przeżyły do końca eksperymentu, zapisano jako zdarzenia nieistniejące i oceniono jako 0.

6. Reprezentatywne wyniki:

Zwierzęta z grupy kontrolnej zaczęły wykazywać oznaki zaburzeń neurologicznych i utraty masy ciała 23 dni po wstępnej inokulacji komórek. W grupie leczonej AMG102 proces ten uległ znacznemu opóźnieniu do 35 dnia. Rzeczywiście, do 35 dnia uśpiono 7% (n = 7/9) zwierząt z grupy kontrolnej. Krzywa przeżycia Kaplana-Meiera wyraźnie pokazuje znaczący wzrost przeżywalności w odpowiedzi na leczenie AMG102 (Rysunek 3). Do 70 dnia uśpiono 88% myszy kontrolnych (n = 8/9) w porównaniu do 37% (n = 3/8) w grupie leczonej AMG102. Analiza histologiczna mózgów potwierdziła, że u wszystkich 9 zwierząt w grupie kontrolnej rozwinęły się guzy, podczas gdy w grupie leczonej AMG102 stało się tak tylko u 3 z 8 myszy (Rysunek 4).

Rycina 1: Zdjęcie (A) przedstawia wewnątrzczaszczowy śrubowy prowadnik umieszczony w obszarze znajdującym się bezpośrednio nad jądrem ogoniastym. Następnie do prowadnika wprowadza się strzykawkę Hamiltona z mankietem (wcześniej napełnioną komórkami) w taki sposób, aby 2 mm igły wystawało poza prowadnik, co pozwala na wstrzyknięcie komórek na głębokość 3,5 mm wewnątrz jądra ogoniastego. Strzykawka zostaje następnie usunięta i zastąpiona stiletem (B). Automatyczne urządzenie do infuzji (C) może wstrzykiwać substancję do 10 zwierząt jednocześnie. Przedstawiono tutaj pięć jednoczesnych iniekcji (D).

Rycina 2: Schemat protokołu badania. Komórki wstrzyknięto w dniu 0, a leczenie rozpoczęto w dniu 4. Zwierzęta z grupy kontrolnej otrzymały wstrzyknięcie PBS (100 μl) domięśniowo, podczas gdy grupa leczona otrzymała zastrzyk z AMG102 (100 μg/100 μl) d.o. Iniekcje te podawano co drugi dzień przez 10 dni. Podano łącznie 6 iniekcji. Następnie zwierzęta monitorowano przez 70 dni pod kątem objawów zaburzeń neurologicznych i fizycznych.

Rysunek 3: Krzywa przeżycia Kaplana-Meiera porównująca myszy z grupy kontrolnej i myszy leczonych AMG102. Po zastosowaniu leczenia AMG102 uzyskano istotne statystycznie przeżycie (p=0,05).

Rysunek 4: Mikrofotografie koronalnych przekrojów mózgu wykazujące rozwój guza u zwierząt z grupy kontrolnej (A) oraz brak rozwoju guza mózgu u zwierząt leczonych AMG102 (B). Pasek skali oznacza 1 mm.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda z wykorzystaniem wkrętu prowadzącego do czaszki umożliwia szybkie i powtarzalne tworzenie ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych, a w rękach przeszkolonego technika weterynaryjnego procedura ta jest bardzo łatwa do wykonania bez konieczności użycia urządzenia stereotaktycznego. Nasza metoda łączy zastosowanie wkręta prowadzącego, służącego do precyzyjnego zlokalizowania obszaru mózgu najodpowiedniejszego do rozwoju guza in vivo, oraz automatycznej pompy infuzyjnej, która pozwala na jednoczesną inokulację do 10 zwierząt. Procedura aplikacji wkręta prowadzącego trwa mniej niż 5 minut. Automatyczna infuzja komórek z prędkością 30 μl/godzinę zajmuje zaledwie 10 minut dla objętości 5 μl. Zapewnia to dokładne dawkowanie przy stałym przepływie i zmniejsza ryzyko wypchnięcia komórek do obszaru poza czaszką w wyniku wzrostu ciśnienia wewnątrzczaszkowego. Przeprowadziliśmy tę procedurę również z użyciem objętości 10 μl i nie zaobserwowaliśmy wzrostu guza poza czaszką wynikającego z refluksu komórek. Ponieważ automatyczna pompa infuzyjna umożliwia jednoczesną inokulację kilku zwierząt, możemy iniekować do 60 zwierząt na godzinę, w porównaniu do procedury stereotaktycznej, która jest ograniczona do około 15 zwierząt na godzinę.

Kluczowym etapem tej procedury jest lokalizacja śruby prowadzącej w czaszce, ponieważ jej położenie determinuje ostateczną lokalizację masy guza. Jeśli śruba prowadząca zostanie umieszczona zbyt centralnie, komórki zostaną wstrzyknięte w obszar między dwiema półkulami mózgu, natomiast jeśli zostanie umieszczona zbyt daleko z przodu, komórki w ogóle nie trafią do mózgu. Niezbędne jest zatem zachowanie jak największej precyzji podczas lokalizacji prowadnika 2,5 mm bocznie i 1 mm przednio względem bregma¹. W niniejszym badaniu zastosowano stalową śrubę prowadzącą, choć dostępne są również plastikowe śruby prowadzące do badań wymagających obrazowania mózgu, takich jak MRI lub PET⁶. Nawet jeśli automatyczna pompa infuzyjna jest zbyt kosztowna dla niektórych grup, komórki można wciąż wstrzykiwać ręcznie, co jest szybsze niż podejścia stereotaktyczne. Ogólnie rzecz biorąc, ta szybka, dokładna i powtarzalna metoda może być stosowana do badania glejaków, medulloblastoma oraz guzów pnia mózgu⁷. Procedura ta została wykonana na ponad 500 myszach w naszych dwóch laboratoriach, a zgony wynikające z nieoczekiwanych reakcji na znieczulenie wyniosły (<1%). Myszy, u których zamocowano śrubę prowadzącą, a następnie przeprowadzono infuzję komórek, nie zginęły ani nie doznały żadnych powikłań neurologicznych w wyniku zabiegu. Zwierzęta przeżyły ponad 100 dni bez żadnych powikłań. Choć preferowaliśmy użycie myszy bezwłosej, mysz z niedoborem odporności z włosem, taka jak SCID, byłaby równie odpowiednia, pod warunkiem usunięcia włosa z czaszki przed operacją, aby utrzymać czystość miejsca zabiegu i zapobiec zakłóceniom w osadzaniu śruby prowadzącej.

Obecnie opracowywanych jest kilka nowych metod terapeutycznych do leczenia glejaka^8-10. Niedawno wykazaliśmy, że podskórne ksenoprzeszczepy glejaka U87MG mogą być hamowane poprzez leczenie AMG102³; humanizowane przeciwciało skierowane przeciwko HGF, które jest obecnie poddawane ocenie klinicznej w leczeniu glejaka⁵. Wykorzystaliśmy opisaną tutaj metodę do wytworzenia wewnątrzczaszkowych guzów U87MG w mózgach myszy nude. Nasze badanie wyraźnie pokazuje użyteczność tej metody i dowodzi, że AMG102 znacząco hamuje wzrost ortotopowych ksenoprzeszczepów U87MG. Będziemy kontynuować wykorzystywanie tego modelu, aby ustalić, jakie inne środki terapeutyczne można zastosować w połączeniu z AMG102 w celu uzyskania bardziej efektywnego hamowania wzrostu guza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F12	Invitrogen	12634010
FCS	Bovogen	SFBS
Trypsyna	Invitrogen	15050065
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Myszy Balb/c nu/nu	ARC Perth
Uchwyt do śruby	Plastics One	SD-1
Uchwyt do wiertła	Plastics One	DH-1
Wiertło	Plastics One	D#60
Prowadnica śruby (metalowa)	Plastics One	C212SG
Atrapa śruby (rylec)	Plastics One	C212SD
Strzykawka Hamiltona (10 μl, igła cementowana 26g)	Grace Division Discovery Science	80075
Pompa infuzyjna PHD 22/2000	Harvard Apparatus	70-2003	Opcjonalnie
Vetbond	3M	1469SB
Mata grzewcza	Harvard Apparatus	340390