Przygotowanie komórek NIH3T3:
A. Komórki do wyrzutu
- Poddać komórki trypsynizacji, następnie rozcieńczyć w stosunku 1:1 pożywką dla komórek i przenieść z kolby T75 do probówki Falcon 15 mL
- Odwirować komórki do postaci granulatu, odprowadzić supernatant i przemyć komórki za pomocą DPBS
- Ponownie odwirować komórki do postaci granulatu i odprowadzić supernatant
- Resuspendować komórki w pożywce
- Wyznaczyć gęstość komórek za pomocą komory licznikowej Hemocytometr (~200 X 104 cells/mL na kolbę T75)
- Odwirować zawiesinę komórkową, odprowadzić supernatant i resuspendować w odpowiedniej ilości pożywki w celu uzyskania różnych stężeń komórek
B. Wyrzut komórek
- Wymieszaj komórki za pomocą wortexa przed ich wyrzutem
- Przenieś 200 µL zawiesiny komórkowej do strzykawki
- Ustaw odpowiedni tryb w generatorze impulsów
- W celu wyrzutu pojedynczych kropel oraz wielu kropel (salw), ustaw generator impulsów w trybie „E. BUR”
- W celu ciągłego wyrzutu kropel, ustaw generator impulsów w trybie „NORM”
- Zmień ustawienia sygnału
- Ustaw wysoki i niski poziom napięcia wyjściowego: HIL na 5 V oraz LOL na 0 V i upewnij się, że dioda „LIM” świeci się
- Ustaw sygnał jako impuls prostokątny
- Zmień czas otwarcia elektrozaworu podczas wyrzutu kropli, zmieniając wartość „WID” lub cykl pracy („DUTY”)
- Zmień częstotliwość wyrzutu, zmieniając wartość „PER”
- Zmień liczbę kropel wyrzucanych w jednej salwie, zmieniając wartość „BUR”
- Wyrzuć zawiesinę komórkową na przygotowane podłoże w celu obrazowania pod mikroskopem
C. Barwienie
- Przygotować roztwór barwnika zawierający 0,5 µL calcein-AM i 2 µL etydyny homodimeru na 1 mL DPBS
- Zanurzyć przygotowany substrat w roztworze barwnika
- Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 37°C przed obrazowaniem
Walidacja eksperymentu
- Przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu Nikon Eclipse TE-2000 U
- Oprogramowanie Spot advanced (Diagnostics, Inc.)
- Test Live/Dead
