Method Article

Tytuł: Hermetyzacja komórek za pomocą kropelek

DOI:

10.3791/316

⸱

October 1st, 2007

 ,  ,  ,  , 
1Bio-Acoustic-MEMS Laboratory in Medicine (BAMM), HST-Center for Bioengineering, Brigham and Women's, Harvard Medical School, 2Bio-Acoustic-MEMS Laboratory in Medicine (BAMM), HST-Center for Bioengineering, Brigham and Women's Hospital, 3Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 4Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology; Center for Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital

In This Article

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie komórek NIH3T3:

A. Komórki do wyrzucenia

  1. Trypsynizować komórki, następnie rozcieńczyć 1:1 pożywką komórkową i przenieść z kolby T75 do probówki Falcon o pojemności 15 ml
  2. Odwirować komórki w osad przez odwirowanie, odessać supernatant i przepłukać komórki DPBS
  3. Ponownie odwiruj komórki w osad i odessaj supernatant
  4. Ponowne zawieszanie komórek na nośniku
  5. Określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru (~200 X 104 komórki/ml na kolbę T75)
  6. Odwirować roztwór komórkowy, odessać supernatant i ponownie zawiesić w odpowiedniej ilości pożywki dla różnych stężeń komórek

B. Wyrzut komórek

  1. Komórki wirowe przed użyciem do wyrzutu
  2. Przenieść 200 μl roztworu komórkowego do strzykawki
  3. Ustaw odpowiedni tryb w generatorze
      impulsów
    1. Aby wyrzucić pojedyncze krople i wiele kropel (impulsów), ustaw generator impulsów w trybie "E. BUR"
    2. Aby uzyskać ciągły wyrzut kropel, ustaw generator impulsów w trybie "NORM"
  4. Zmienianie ustawień
      sygnału
    1. Ustaw wysoki i niski poziom napięcia wyjściowego: HIL na 5 V i LOL na 0 V i upewnij się, że dioda LED "LIM" jest włączona
    2. Ustaw sygnał jako impuls kwadratowy
    3. Zmień czas, przez jaki zawór elektromagnetyczny jest otwarty w celu wyrzucenia kropel, zmieniając wartość "WID" lub zmieniając cykl pracy ("DUTY")
    4. Zmień częstotliwość wyrzucania, zmieniając wartość "PER"
    5. Zmień liczbę kropel wyrzucanych w serii, zmieniając wartość "BUR"
  5. Wyrzuć roztwór komórkowy na przygotowane podłoże w celu obrazowania za pomocą mikroskopu

C. Barwienie

  1. Uzupełnij roztwór barwnika z 0,5 μl kalceiny-AM i 2 μl homodimeru etydyny na ml DPBS
  2. Zanurz przygotowane podłoże w roztworze barwnika
  3. Pozostawić próbkę do inkubacji przez 10 minut w temperaturze 37 °C przed obrazowaniem

Walidacja eksperymentu

  1. Na mikroskopie
      fluorescencyjnym Nikon Eclipse TE-2000 U
    1. Zaawansowane oprogramowanie Spot (Diagnostics, Inc.)
    2. Test żywy/martwy

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
fluorescencyjnyNikon InstrumentsEclipse TE-2000 U
WyrzutnikCzęstotliwość pracy: 1 KHz, 30psi, 50nl ~ 0,5ul. Sterownik zaworu 12V: prąd napędowy 2,5
A 5 galonów Przenośny zbiornikColemanPowermate CT5Powietrze pod ciśnieniem: 30 PSI
RegulatoryMarsh Bellofram
GeneratorHP8112AGenerowanie częstotliwości aktywacji: 50 MHz
EtapNewmarkSystems z silnikiem krokowym: 6-calowy skok xy stage (NLS4-6-25), 2,5-calowy skok z-stage (NLS4-2,5-25), kontroler 3-osiowy (NSC-G3), rozdzielczość 0,1um
NIH 3T3Fibroblastylinii
Trypsyna0,05% roztwór
NIH 3T3 pożywka
komórkowa DPBSBufor
T75Kolby do hodowli tkankowych
Plastikowe15 ml, do hodowli tkankowych
Mikroskop komórek zaworu elektromagnetycznego powietrza ciśnienia impulsów XYZ komórkowej probówki stożkowe

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell EncapsulationDroplet PrintingCell PrintingSolenoid ValveMotorized StageCell DensityHemocytometerLive Dead AssayCalcium AMEthidium Homodimer

Related Articles