Modele dużych zwierząt mają wysoką wartość translacyjną w badaniu fizjologii i farmakologii niedotlenienia okołoporodowego. Wykorzystując noworodki prosiąt, opracowaliśmy eksperymentalny protokół symulacji niedotlenienia okołoporodowego, który umożliwia badanie hemodynamicznych parametrów systemowych i regionalnych, transportu tlenu wraz z szlakami biochemicznymi i patologicznymi oraz ich korelacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model niedotlenienia okołoporodowego u świń
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rocznie na całym świecie ponad 1 milion noworodków umiera w wyniku asfiksji. Noworodki z asfiksją często wykazują niewydolność wielonarządową, obejmującą niedociśnienie, deficyt perfuzji, encefalopatię niedotlenieniowo- Niedokrwienną, nadciśnienie płucne, naczyniowe zapalenie jelit i okrężnicy, niewydolność nerek oraz powikłania zakrzepowo-zatorowe. Modele zwierzęce opracowuje się w celu lepszego zrozumienia patofizjologii i farmakologii asfiksji noworodkowej. W porównaniu z gryzoniami i nowonarodzonymi jagniętami, nowo narodzone prosię okazało się wartościowym modelem. Noworodek świński posiada kilka zalet, w tym rozwój zbliżony do ludzkiego płodu w 36–38 tygodniu z porównywalnymi układami organizmu oraz dużą masę ciała (˜1,5-2 kg przy urodzeniu), co umożliwia instrumentację i monitorowanie zwierzęcia oraz kontrolę zmiennych zakłócających w postaci hipoksji i zaburzeń hemodynamicznych.
W niniejszej pracy opisujemy protokół eksperymentalny służący do symulacji niedotlenienia noworodków, co pozwala nam badać systemowe i regionalne zmiany hemodynamiczne podczas procesu duszenia i reoksygenacji, a także wpływ poszczególnych interwencji. Ponadto model ten daje możliwość jednoczesnego badania niewydolności lub dysfunkcji wielu narządów oraz ich interakcji z różnymi układami organizmu. Model eksperymentalny opiera się na procedurze bez przeżycia, obejmującej chirurgiczne instrumentowanie nowo narodzonych prosiąt (w wieku 1-3 dni, o masie 1,5-2,5 kg, rasy mieszanej) w celu umożliwienia wentylacji mechanicznej, uzyskania dostępu naczyniowego (tętniczego i centralnego żylnego) oraz umieszczenia cewników i sond przepływu (Transonic Inc.) do ciągłego monitorowania ciśnienia wewnątrznaczyniowego i przepływu krwi w różnych tętnicach, w tym w głównej tętnicy płucnej, wspólnej tętnicy szyjnej, krezkowej górnej i lewej tętnicy nerkowej. U tak instrumentowanych prosiąt, po stabilizacji trwającej 30-60 minut (definiowanej jako zmienność parametrów hemodynamicznych Z<10% oraz prawidłowe gazy krwi), rozpoczynamy protokół eksperymentalny ciężkiej hipoksemii, indukowanej poprzez normokapniczną hipoksję pęcherzykową. Prosię jest wentylowane mieszanką zawierającą 10-15% tlenu poprzez zwiększenie stężenia azotu w gazach wdechowych przez 2h, dążąc do osiągnięcia nasycenia tlenem krwi tętniczej na poziomie 30-40%. Taki stopień hipoksemii wywołuje kliniczne niedotlenienie z ciężką kwasicą metaboliczną, systemowym hipotensją i wstrząsem kardiogennym z hipoperfuzją organów krytycznych. Po hipoksji następuje reoksygenacja tlenem 100% przez 0,5h, a następnie tlenem 21% przez 3,5h. W odpowiednim czasie można wprowadzić interwencje farmakologiczne i badać ich efekty w sposób zaślepiony i zrandomizowany blokowo.
Protokół
1. Znieczulenie
- Ustawić przepływ w aparacie do znieczulania na 2L/min. Podłączyć wylot do odsysacza próżniowego.
- Nasycić maskę twarzową gazem znieczulającym (izofluranem) w stężeniu 5% (ok. 3 min).
- Indukcję znieczulenia u noworodków prosiąt przeprowadzić za pomocą inhalacji 5% izofluranu w 100% tlenie (ok. 3 min).
- Utrzymywać znieczulenie przy stężeniu izofluranu 2-3%. W razie potrzeby dokonywać precyzyjnej regulacji poziomu izofluranu o 0.5%, przy czym stężenie może wynosić od 0.5 do 5% w zależności od stanu prosiąt.
- Po zapewnieniu dostępu naczyniowego znieczulenie inhalacyjne można zastąpić znieczuleniem dożylnym, stosując infuzje fentanylu (5-50 mcg/kg/h) i midazolamu (200-500 mcg/kg/h). W celu opanowania nadmiernych ruchów mięśni podczas operacji może być wymagany pankuronium (50-100 mcg/kg/h), przy zachowaniu możliwości obserwacji stanu zwierzęcia w celu dostosowania leków znieczulających.
- Stan prosięcia monitorować za pomocą pulsoksymetrii (perkutane wysycenie tlenem na poziomie 95-100%) oraz EKG (częstość akcji serca w zakresie 130-170 uderzeń/min).
- Temperaturę rektalną prosięcia utrzymywać w zakresie 38-40°C za pomocą koca grzewczego i promiennika ciepła.
- Stan znieczulenia prosięcia należy regularnie oceniać przez cały okres eksperymentu, stosując w zależności od potrzeb parametry neurologiczne (rozszerzenie źrenic, łzawienie, ruchy ciała), behawioralne (pobudzenie), sercowo-naczyniowe (tachykardia i nadciśnienie) oraz oddechowe (tachypnoe). Podaje się minimalny stopień paraliżu. Do oceny przydatne będzie wcześniejsze doświadczenie w znieczulaniu prosiąt z paraliżem i bez niego.
- Protokół stanowi procedurę bez przeżycia, z eutanazją zwierzęcia na koniec eksperymentu poprzez dożylne podanie przedawkowanej dawki pentobarbitalu (100 mg/kg).
2. Chirurgiczne umieszczenie cewników naczyniowych w pachwinie (Rycina 1)
- Wykonaj długie nacięcie 2-3 cm w prawym pachwinie.
- Wypreparuj 1 cm prawej żyły udowej oraz 1 cm prawej tętnicy udowej. Obwiąż każde naczynie dwiema nićmi 3-0.
- Cewnikowanie prawej żyły udowej: Podwiąż dystalny koniec żyły. Wprowadź cewnik Argyle (3,5 lub 5 French, dwulumenowy) (Covidien, Mansfield, MA) na głębokość 15 cm, co umieści go w prawym przedsionku. Zawiąż obie nici, aby unieruchomić cewnik. Cewnik może być wykorzystywany do podawania płynów podtrzymujących i leków (port wtórny) oraz do pomiaru ciśnienia w żyłach centralnych/prawym przedsionku (port pierwotny).
- Cewnikowanie prawej tętnicy udowej: Podwiąż dystalny koniec tętnicy. Unieś proksymalną nić, aby zatrzymać przepływ krwi. Wprowadź cewnik Argyle (3,5 lub 5 French, jednolumenowy) na głębokość 5 cm. Umieści to cewnik tętniczy w aorcie poniżej nerek w celu ciągłego pomiaru średniego ciśnienia tętniczego i pobierania próbek krwi. Zawiąż obie nici, aby unieruchomić cewnik.
- Zamknij skórę.
3. Ustanowienie wentylacji mechanicznej (Rysunek 2)
- Wykonaj długie, poziome nacięcie szyi o długości 2-3 cm.
- Przeprowadź preparację i odsłoń 1 cm tchawicy. Obwiąż tchawicę dwiema nićmi 1-0.
- Wprowadź rurkę intubacyjną (3,0 lub 3,5) na głębokość 1 cm do tchawicy. Podłącz do respiratora i rozpocznij wentylację mechaniczną. Zabezpiecz rurkę intubacyjną.
- Przeprowadź preparację i odsłoń wspólną tętnicę szyjną. Opasaj naczynie ultradźwiękową sondą przepływu czasu przejścia (2SB lub 2RB, Transonic Systems Inc., Ithica, NY) w celu ciągłego pomiaru przepływu krwi.
4. Umieszczenie sond przepływowych w tętnicy krezkowej górnej (Rycina 3) i lewej tętnicy nerkowej (Rycina 4)
- Przed nacięciem skóry wymagane jest podanie dodatkowych dawek fentanylu (5-10 mcg/kg) i acepromazyny (0,01-0,02 mg/kg).
- Wykonaj długie nacięcie podżebrowo-boczne i ostrożnie rozdziel warstwy mięśniowe.
- Obnaż aortę brzuszną.
- Zminimalizuj manipulacje naczyniowe (skurcz naczyń) oraz uszkodzenia limfatyczne.
- Wypreparuj 0,5-1 cm tętnicy krezkowej górnej i umieść wokół niej sondę przepływową Transonic (3SB).
- Wypreparuj 0,5-1 cm lewej tętnicy nerkowej i umieść wokół niej sondę przepływową Transonic (2SB).
- Zamknij skórę i zabezpiecz sondę przepływową.
5. Umieszczenie cewnika tętnicy płucnej (Rysunek 5) i sondy przepływowej (Rysunek 6)
- Przed nacięciem skóry wymagane są dodatkowe dawki fentanylu (5-10 mcg/kg) i acepromazyny (0,01-0,02 mg/kg).
- Ułożenie zwierzęcia w pozycji bocznej prawej.
- Torakotomia w obrębie lewej 4. przestrzeni międzyżebrowej.
- Należy uważać na tętnicę i żyłę piersiową wewnętrzną, w razie potrzeby je podwiązać.
- Użyć patyczka stomatologicznego do odsunięcia lewego płuca i w razie potrzeby zwiększyć podaż tlenu.
- Otwarcie osierdzia.
- Zlokalizowanie przewodu tętniczego, który biegnie od tętnicy płucnej do aorty.
- Przewód tętniczy można podwiązać poprzez założenie klipsa lub grubego wiązania z jedwabiu „3-O” u jego nasady.
- Uwolnienie głównej tętnicy płucnej i założenie pętli naczyniowej przy użyciu grubego wiązania „0”.
- Wykonanie szwu typu „marszczącego” (prolene 5-0) u podstawy w celu wprowadzenia cewnika do tętnicy płucnej.
- Wprowadzenie cewnika Angiocath 20G (z 3 otworami bocznymi w odległości mniej niż 1 cm od końcówki cewnika) przez szew marszczący na maksymalną głębokość 1 cm.
- Sprawdzenie swobodnego przepływu krwi żylnej.
- Podłączenie do przetwornika ciśnienia, sprawdzenie ciśnienia w tętnicy płucnej oraz kształtu fali.
- Zaciśnięcie szwu marszczącego i zabezpieczenie cewnika tętnicy płucnej.
- Umieszczenie sondy przepływowej Transonic (6SB) wokół głównej tętnicy płucnej.
- Nałożenie żelu ultradźwiękowego pomiędzy sondę przepływową a tętnicę w celu zapewnienia optymalnej transdukcji sygnału.
- Przykrycie rany gazą zwilżoną solą fizjologiczną.
6. Protokół hipoksji i reoksygenacji
- Zmniejsz stężenie tlenu w powietrzu wdechowym do 10%, zwiększając stężenie wdychanego azotu w celu wywołania hipoksemii.
- Dostosuj stężenie tlenu w powietrzu wdechowym w zakresie od 10% do 15%, aby uzyskać PaO2 na poziomie 20-40 mmHg lub SaO2 na poziomie 30-40% przez 2h.
- Wykonaj analizę krwi tętniczej w celu oceny PaCO2 i odpowiednio dostosuj częstotliwość pracy respiratora.
- Po wywołaniu hipoksemii pierwsza godzina jest przeznaczona na stopniowe indukowanie odpowiedzi tachykardycznej (oraz wzrostu rzutu serca).
- Kontynuuj monitorowanie zmian przepływu krwi w tętnicy szyjnej wspólnej, tętnicy krezkowej górnej oraz lewej tętnicy nerkowej.
- W drugiej godzinie hipoksji stres hipoksyczny jest zwiększany, aby stopniowo obniżyć rzut serca do 30-40% wartości bazowej, średnie ciśnienie tętnicze do 30-35 mmHg oraz pH krwi tętniczej do 6,95-7,05.
- Stres hipoksyczny można przedwcześnie przerwać lub przedłużyć o 15 min, jeśli jest to stosowne.
- Gwałtownie zwiększ stężenie tlenu w powietrzu wdechowym do 100% poprzez zaprzestanie podawania azotu przy jednoczesnym kontynuowaniu podawania czystego tlenu.
- Monitoruj rzut serca, średnie ciśnienie tętnicze oraz inne parametry hemodynamiczne w celu oceny szybkiego powrotu do normy.
- Resuscytację 100% tlenem można kontynuować przez 0,5h. Po tym czasie szybko zmniejsz stężenie tlenu w powietrzu wdechowym do 21%.
- Kontynuuj reoksygenację tlenem o stężeniu 21% przez pozostały czas trwania eksperymentu. W razie potrzeby stężenie tlenu w powietrzu wdechowym można mianować do 25%.
- W trakcie okresu eksperymentalnego mogą być wymagane bolusy płynów w postaci 10 ml/kg roztworu mleczana Ringera, w zależności od potrzeb. Ich stosowanie musi być ujęte w protokole.
7. Reprezentatywne wyniki:
Indukcja hipoksemii u noworodka prosięcia w ciągu pierwszej godziny hipoksji powinna zwiększyć rzut serca (przepływ w tętnicy płucnej) do 120%-130% wartości bazowej (Rysunek 7A) oraz częstotliwość akcji serca (Rysunek 7B). Zazwyczaj rzut serca powinien osiągnąć szczytową kompensację między 0,5h a 1h trwania hipoksji. Ponadto przepływ krwi powinien ulec centralizacji, co skutkuje zmniejszeniem perfuzji krezkowej i nerkowej, przy jednoczesnym zachowaniu lub zwiększeniu przepływu w tętnicy szyjnej wspólnej (Rysunek 8). W drugiej godzinie hipoksji następuje stały spadek rzutu serca, rozwija się hipotensja (Rysunek 9A) oraz spowolnienie akcji serca z lub bez wystąpienia arytmii. Hipoksja powinna wywołać nadciśnienie płucne ze zwiększonym ciśnieniem w tętnicy płucnej (Rysunek 9B), które w ostatnich 30 min hipoksji może czasem spaść wraz ze spadkiem rzutu serca.
Po reanimacji wszystkie parametry hemodynamiczne natychmiast powrócą do wartości bazowych dla stanu normoksji, z wyjątkiem przepływu krwi przez nerki, który stopniowo odzyskuje sprawność w ciągu pierwszej godziny reoksygenacji. Jednakże parametry hemodynamiczne, a w szczególności rzut serca oraz średnie ciśnienie tętnicze, będą stopniowo pogarszać się w ciągu pierwszych 2 godzin reoksygenacji, osiągając odpowiednio około 70-75% wartości bazowej dla normoksji oraz 35-45 mmHg. Ta dysfunkcja sercowo-naczyniowa wynika przynajmniej częściowo z ogłuszenia mięśnia sercowego i uzasadnia zastosowanie terapii wspomagających układ sercowo-naczyniowy, takich jak leki wazoaktywne i inotropowe.
Rycina 1: Nacięcie w pachwinie wraz z umieszczeniem cewników tętnicy i żyły udowej
Rycina 2: Nacięcie szyi z umieszczeniem rurki endotrachealnej i sondy przepływowej wokół wspólnej tętnicy szyjnej
Rysunek 3: Nacięcie boku z izolacją tętnicy krezkowej górnej
Rysunek 4: Nacięcie boczne z izolacją lewej tętnicy nerkowej
Rysunek 5: Torakotomia z wprowadzeniem cewnika tętnicy płucnej
Rysunek 6: Torakotomia z umieszczeniem sondy przepływu Transonic wokół głównej tętnicy płucnej
Rycina 7: Zmiany czasowe w (A) rzucie serca (przepływie w tętnicy płucnej) i (B) częstotliwości akcji serca podczas hipoksji i reoksygenacji
Rysunek 8: Zmiany czasowe przepływu krwi w (A) wspólnej tętnicy szyjnej, (B) górnej tętnicy krezkowej i (C) lewej tętnicy nerkowej podczas hipoksji i reoksygenacji
Rysunek 9: Zmiany czasowe (A) średniego ciśnienia tętniczego oraz (B) ciśnienia w tętnicy płucnej podczas hipoksji i reoksygenacji
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecny protokół eksperymentalny daje możliwość zbadania systemowych i regionalnych zmian hemodynamicznych u noworodków podczas procesu hipoksji i reoksygenacji. Możemy również zbadać odpowiedni wpływ interwencji stosowanych w celu poprawy funkcji sercowo-naczyniowej podczas rekonwalescencji. My oraz inni autorzy opisywali doświadczenia i wyniki badań nad asfiksją noworodków w odniesieniu do skutków w układach sercowo-naczyniowym1, płucnym2, neurologicznym3, żołądkowo-jelitowym4...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem (MOP53116) oraz Alberta Heritage Foundation for Medical Research odpowiednio za grant operacyjny i fundusz ustanowieniowy, które wsparły opracowanie tego modelu eksperymentalnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Borke, W. B. Increased myocardial matrix metalloproteinases in hypoxic newborn pigs during resuscitation: effects of oxygen and carbon dioxide. Eur. J. Clin. Invest. 34, 459-466 (2004).
- Munkeby, B. H. Resuscitation of hypoxic piglets with 100% O2 increases pulmonary metalloproteinases and IL-8. Pediatr. Res. 58, 542-548 (2005).
- Haaland, K. Posthypoxic hypothermia in newborn piglets. Pediatr. Res. 41, 505-512 (1997).
- Haase, E. Resuscitation with 100% oxygen causes intestinal glutathione oxidation and reoxygenation injury in asphyxiated newborn piglets. Ann. Surg. 240, 364-373 (2004).
- Stevens, J. Resuscitation with 21% or 100% oxygen is equally effective in restoring perfusion and oxygen metabolism in hypoxic newborn piglet liver. Shock. 27, 657-662 (2007).
- Johnson, S. T. N-acetylcysteine improves the hemodynamics and oxidative stress in hypoxic newborn pigs reoxygenated with 100% oxygen. Shock. 28, 484-490 (2007).
- Chapados, I. Plasma cortisol response to ACTH challenge in hypoxic newborn piglets resuscitated with 21% and 100% oxygen. Shock. 33, 519-525 (2010).
- Cheung, P. Y. Platelet dysfunction in asphyxiated newborn piglets resuscitated with 21% and 100% oxygen. Pediatr. Res. 59, 636-640 (2006).
- Martin-Ancel, A. Multiple organ involvement in perinatal asphyxia. J. Pediatr. 127, 786-793 (1995).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Comparative anatomy and physiology of the pig. Scan. J. Lab. Anim. Sci. Suppl. 25, 11-22 (1998).
- Chapados, I., Cheung, P. Y. Not all models are created equal: Animal models to study hypoxic-ischemic encephalopathy of the newborn. Neonatology. 94, 300-303 (2008).
- Liu, J. Q. Effects of post-resuscitation treatment with N-acetylcysteine on cardiac recovery in hypoxia-injured newborn pigs. PLoS ONE. 5, e15322-e15322 (2010).
- Cheung, P. Y. Cardio-renal recovery of hypoxic newborn pigs after 18%, 21% and 100% reoxygenation. Intensive Care Med. 34, 1114-1121 (2008).
- Temesvari, P. Modulation of the blood-brain barrier permeability in neonatal cytotoxic brain edema: laboratory and morphological findings obtained on newborn piglets with experimental pneumothorax. Biol. Neonate. 46, 198-208 (1984).
- Domoki, F. Reventilation with room air or 100% oxygen after asphyxia differentially affects cerebral neuropathology in newborn pigs. Acta. Paediatr. 95, 1109-1115 (2006).
- Part 15: Neonatal resuscitation: 2010 American Heart Association guidelines for cardiopulmonary resuscitation and emergency cardiovascular care. Circulation. 122, S909-S919 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
