Pakowanie konstruktów ekspresji wektora lentiwektorowego opartych na HIV lub FIV i transdukcja pseudotypowanych cząstek wirusa VSV-G

Podsumowanie

Wektory ekspresji lentiwirusowej są najskuteczniejszymi narzędziami do stabilnej ekspresji różnych molekuł efektorowych lub konstruktów reporterowych w dzielących się i niedzielących komórkach ssaków i całych organizmach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, w jaki sposób pakować konstrukty ekspresji lentiwektora w cząstki pseudowirusowe i transdukować komórki docelowe za pomocą cząstek pseudowirusowych.

Streszczenie

Podobnie jak w przypadku standardowych wektorów plazmidowych, możliwe jest transfekowanie lentiwektorów w formie plazmidu do komórek o niskiej lub średniej wydajności, aby uzyskać przejściową ekspresję efektorów. Pakowanie konstruktów ekspresji lentiwirusa w cząsteczki pseudowirusowe umożliwia jednak do 100% transdukcji, nawet w przypadku komórek trudnych do transfekcji, takich jak komórki pierwotne, macierzyste i zróżnicowane. Co więcej, dostarczenie lentiwirusa nie wywołuje specyficznych odpowiedzi komórkowych typowych dla transfekcji chemicznych, takich jak śmierć komórki wynikająca z toksyczności odczynnika do transfekcji ^{1, 2}. Po transdukcji do komórek docelowych konstrukt lentiwirusowy integruje się z genomowym DNA i zapewnia stabilną ekspresję małego RNA spinki do włosów (shRNA), cDNA, mikroRNA lub genu reporterowego ^{3, 4}. Komórki docelowe stabilnie wyrażające cząsteczkę efektorową można wyizolować za pomocą wybieralnego markera zawartego w konstrukcie wektora ekspresyjnego, takiego jak puromycyna lub GFP. Po tym, jak cząsteczki pseudowirusowe zainfekują komórki docelowe, nie mogą się replikować w komórkach docelowych, ponieważ geny strukturalne wirusa są nieobecne, a długie powtórzenia końcowe (LTR) są zaprojektowane tak, aby ulegały samoinaktywacji po transdukcji ^{5, 6}.

Istnieją trzy główne elementy niezbędne do efektywnego pakowania lentiwirusów ^{1, 5, 6, 7}.
1. Wektor ekspresji lentiwirusa, który zawiera niektóre elementy genetyczne wymagane do pakowania, stabilnej integracji konstruktu ekspresji wirusa z genomowym DNA oraz ekspresji efektora lub reportera.
2. Plazmidy upakowania lentiwirusa, które dostarczają białka niezbędne do transkrypcji i pakowania kopii RNA ekspresji, konstruują się w rekombinowane cząstki pseudowirusowe. Protokół ten wykorzystuje plazmidy pPACK (SBI), które kodują gag, pol i rev z genomu HIV lub FIV oraz białko g wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G) dla białka płaszcza wirusowego.
3. Komórki wytwarzające 293TN (pochodzące z komórek HEK293), które wyrażają duży antygen T SV40, który jest wymagany do produkcji lentiwirusa o wysokim mianie i gen oporności na neomycynę, przydatny do ponownej selekcji komórek do utrzymania.

Przegląd protokołu produkcji wirusa można zobaczyć na rysunku 1. Produkcja wirusa rozpoczyna się od kotransfekcji komórek wytwarzających 293TN z wektorem ekspresyjnym lentiwirusa i plazmidami pakującymi. Cząsteczki wirusa są wydzielane do pożywki. Po 48-72 godzinach zbiera się pożywkę do hodowli komórkowych. Szczątki komórkowe są usuwane z pożywki do hodowli komórkowych, a cząsteczki wirusa są wytrącane przez odwirowanie z PEG-it w celu zagęszczenia. Wytworzone cząstki lentiwirusa są następnie natłuszczane i mogą być wykorzystane do transdukcji komórek docelowych. Szczegóły dotyczące miareczkowania wirusa nie są zawarte w tym protokole, ale można je znaleźć pod adresem:

http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ⁸.

Ten protokół został zoptymalizowany przy użyciu konkretnych produktów, które zostały wskazane. Inne odczynniki mogą zostać zastąpione, ale nie można zagwarantować takich samych wyników.

Protokół

1. Transfekcja komórek 293TN z plazmidami pakującymi i konstruktem ekspresji

1. Nasiona 7,0 - 8,0 x 10⁶ komórek 293TN na 15 cm² płytki hodowlane w 20 ml pożywki zawierającej pożywkę DMEM uzupełnioną 4 mM L-glutaminą, 4,5 g/l glukozy i płodową surowicę bydlęcą (10%) bez antybiotyków. Rosnąć przez 18-24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 tak}, aby gęstość komórek osiągnęła 60-80% zbiegu w momencie transfekcji. W niektórych przypadkach może być konieczne wysianie kilku płytek komórek, aby uzyskać wystarczająco wysokie miano do transdukcji komórek docelowych.
2. Na każdą płytkę komórek dodaj 1,6 ml DMEM bez surowicy do autoklawowanej probówki Eppendorffa o pojemności 2 ml. Dodać 45 μl pPACKH1 lub pPACKF1 i 4,5 μg konstruktu lentiwektorowego do DMEM i mieszać, pipetując w górę iw dół.
3. Do tej samej probówki dodać 55 μl PureFection. Wiruj przez 10 sekund. Inkubować mieszaninę DMEM-Plasmid-PureFection w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4. Dodaj mieszaninę DMEM-Plasmid-PureFection do płytki do hodowli tkankowej kroplami i delikatnie obracaj, aby równomiernie rozproszyć się na płytce. Włożyć naczynie z powrotem do inkubatora i hodować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
5. Nie ma potrzeby zmiany podłoża po transfekcji. Jeśli konstrukt lentiwektora wykazuje ekspresję genu kodującego białko fluorescencyjne, takie jak GFP, sprawdź swoje komórki pod mikroskopem 12-24 godziny po transfekcji. Powinieneś być w stanie zobaczyć >90% komórek GFP-dodatnich, co wskazuje, że transfekcja się powiodła.
6. Po 48 i 72 godzinach zebrać supernatant do hodowli komórkowej do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Ten supernatant do hodowli komórkowej zawiera teraz zakaźne cząstki pseudowirusowe. (Postępuj zgodnie z zalecanymi wskazówkami dotyczącymi pracy z klasą bezpieczeństwa BSL-2.) Wirować przy 1 500 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia resztek komórkowych. Przenieś supernatant wirusa do nowej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu.
7. Komórki 293TN, które zostały użyte do pakowania wirusów, powinny zostać wyrzucone do pojemnika na zagrożenie biologiczne i nie mogą być używane do dalszych rund pakowania wirusa.

2. Stężenie supernatantu wirusa

1. Dodać 1 objętość zimnego (4 °C) roztworu do wytrącania wirusa PEG-it do każdych 4 objętości supernatantu zawierającego cząstki lentiwirusa. Wytrącanie cząstek lentiwirusa z dużych objętości można osiągnąć za pomocą polipropylenowych probówek wirówkowych Corning o pojemności 250 ml. Wymieszaj roztwór, kilkakrotnie odwracając probówki, ale nie mieszaj mieszaniny.
2. Roztwór przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez co najmniej 12 godzin (dopuszczalne jest do 4 dni). Nie potrząsaj ani nie obracaj rurek podczas chłodzenia.
3. Odwirować mieszaninę supernatantu/PEG-it przy 1 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu cząstki lentiwirusa pojawią się jako beżowe lub białe granulki na dnie probówki. Wylać supernatant.
4. Usunąć wszelkie ślady płynu przez aspirację, uważając, aby nie naruszyć wytrąconych cząstek lentiwirusa w osadzie. Śladowe ilości szczątkowego PEG-it rozcieńczą wirusa (zmniejszając w ten sposób miano), ale nie wpłyną na integralność komórek docelowych, ponieważ PEG-it jest obojętny i nie jest toksyczny.
5. Zawiesić i połączyć cząstki lentiwirusa w 1/100 pierwotnej objętości, używając zimnego (4 °C), sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanami lub DMEM zawierającego 25 mM buforu HEPES.
6. Porcję rozlać do sterylnych fiolek kriogenicznych i przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu przygotowania do użycia.

3. Mianowanie wirusa i transdukcja komórek docelowych

1. Zalecamy mianowanie cząstek lentiwirusa przed transdukcją docelowych komórek będących przedmiotem zainteresowania i obliczenie odpowiedniej wielokrotności infekcji (MOI) dla komórek docelowych w celu zapewnienia spójności między eksperymentami. Do mianowania wirusa zalecamy stosowanie komórek HT1080 jako łatwej do zakażenia linii kontroli pozytywnej. Należy pamiętać, że protokół miareczkowania polega na transdukcji komórek HT1080 za pomocą małej porcji zapakowanych cząstek lentiwirusa. Gdy miano jest już znane, docelowe komórki będące przedmiotem zainteresowania mogą być również transdukowane za pomocą wytworzonych cząstek lentiwirusa. Zalecany protokół miareczkowania można znaleźć pod adresem: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ⁷.
2. Umieść 50 000 komórek docelowych na basenie na 24-dołkowej płytce w pożywce do hodowli komórkowych. Użyj pożywki, w której normalnie hodowane są komórki. Hoduj komórki przez noc w określonych warunkach hodowli. Komórki powinny zlewać się w 50 do 70% w dniu transdukcji.
3. W dniu transdukcji odessać pożywkę z komórek. Połączyć pożywkę hodowlaną z TransDux do 1 x końcowego stężenia (na przykład 2,5 μl TransDux na 500 μl pożywki). Następnie przenieś mieszaninę pożywki do hodowli komórek TransDux do każdego dołka.
4. Do każdej studzienki należy pobrać pipetą odpowiednią objętość wirusa, która odpowiada optymalnemu MOI dla komórek docelowych. Jeśli optymalny MOI jest nieznany, zalecamy wypróbowanie szeregu różnych MOI (takich jak MOI 1, 2 i 5 dla łatwych do zakażenia komórek hodowli tkankowej oraz MOI 1, 10 i 20 dla trudniejszych do zakażenia komórek pierwotnych). Jeśli stężenie cząstek lentiwirusa nie jest znane (określone za pomocą protokołu mianowania wirusa), można spróbować różnych objętości wirusa, takich jak 1, 2 i 5 μl wirusa. Wirus może pozostawać w kontakcie z komórkami docelowymi do 72 godzin.
5. Dalsze eksperymenty z transdukowanymi komórkami docelowymi będącymi przedmiotem zainteresowania można rozpocząć 72 godziny po transdukcji, po zintegrowaniu się konstruktu wirusa z genomem komórki gospodarza. Zmień pożywkę i przejdź przez docelowe komórki zainteresowania zgodnie z ich konkretnymi potrzebami.

4. Reprezentatywne wyniki

Transfekcja komórek 293TN

Początkowa gęstość komórek 293TN jest kluczowa dla udanego pakowania wirusa. Komórki 293TN muszą być między 60 -80% zlewające się w dniu transfekcji (Rysunek 2). Jeśli komórki 293TN są mniej niż 60% zlewające się, pozwól im rosnąć jeszcze przez kilka godzin przed próbą transfekcji. Jeśli ogniwa 293TN są w >80% zlewane, należy je ponownie pokryć przed transfekcją.

Jeśli używasz lentiwektora wyrażającego GFP, co najmniej 90% komórek 293TN powinno fluoryzować na zielono 24 godziny po transfekcji, co wskazuje na udaną transfekcję (Rysunek 3). Jeśli mniej niż 90% komórek jest GFP-dodatnich, nie przechodź do następnego kroku, ponieważ oznacza to, że transfekcja nie powiodła się, a miana wirusa będą niskie. Zamiast tego płytkuj nowe ogniwa 293TN i zacznij od nowa, upewniając się, że ogniwa 293TN mają odpowiednią gęstość komórek przed transfekcją.

293TN komórki mogą ściągnąć płytki hodowli tkankowej 48-72 godziny po transfekcji. Nie wpływa to negatywnie na produkcję cząstek lentiwirusowych.

Miareczkowanie za pomocą komórek HT1080

Miana wirusów można obliczyć za pomocą zestawu do globalnego ultraszybkiego miareczkowania SBI zgodnie z instrukcjami producenta. System ten wykorzystuje qPCR do pomiaru integracji wirusowej sekwencji WPRE z wektora lentiwirusowego do komórek HT1080 i porównuje to ze standardową krzywą, opartą na genomowej sekwencji referencyjnej w celu dokładnego pomiaru jednostek zakaźnych na ml (ryc. 4).

Transdukcja komórek docelowych

Jeśli używasz cząsteczek lentiwirusowych wyrażających konstytutywnie aktywny marker GFP, komórki GFP powinny zacząć pojawiać się w ciągu 12-24 godzin od transdukcji, jeśli reakcja transdukcji działa. Ekspresja GFP powinna być kontynuowana po stabilnej integracji konstruktu lentiwirusowego z genomem komórki gospodarza. W przypadku transdukcji z różnymi MOI, fluorescencja GFP powinna w przybliżeniu odpowiadać MOI, gdzie niskie MOI wykazują mniejszą fluorescencję GFP, a wyższe MOI wykazują zwiększoną fluorescencję GFP (Figura 5).

Rysunek 1. Przegląd protokołu produkcji wirusa. Plazmidy pakujące lentiwektor i pPACK są mieszane i współtransfekowane do komórek 293TN. Po 48 -72 godzinach zbiera się supernatant wirusa, a cząsteczki wirusa wytrąca się za pomocą PEG-it. Po mianowaniu cząstek lentiwirusa można je wykorzystać do transdukcji docelowych komórek będących przedmiotem zainteresowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 2. Obraz z kontrastem fazowym komórek 293TN. Gęstość komórek powinna wynosić od 60 do 80% zlewania się w dniu transfekcji.

Rysunek 3. Obraz fluorescencyjny komórek 293TN GFP-dodatnich 24 godziny po transfekcji z Purefection, pPACKH1 i konstruktem lentiwektorowym kodującym GFP.

Rysunek 4. Wyniki WPRE qPCR i krzywa wzorcowa uzyskane przy użyciu zestawu Global UltraRapid Titering firmy SBI do obliczenia MOI i odpowiadającego mu miana upakowanych cząstek wirusa.

Rysunek 5. Obrazy fluorescencyjne komórek HT1080 transdukowanych z rosnącą ilością lentiwirusa. Zdjęcia pochodzą z 72 godzin po transdukcji.

Dyskusja

Ten protokół pakowania i transdukcji wirusów komórek docelowych został zoptymalizowany do użytku z odczynnikami do pakowania wirusów SBI. Zastąpienie innych odczynników może mieć wpływ na wynik protokołu. Protokół ten został zoptymalizowany tylko pod kątem produkcji lentiwirusów i może nie być odpowiedni do produkcji innych typów wirusów lub pseudowirusów.

Skuteczne pakowanie wirusów zależy od kilku kluczowych kroków. Komórki 293TN wyrażają duży antygen T SV40, który jest absolutnie niezbędny do wydzielania cząstek lentiwirusa do supernatantu hodowli komórkowej. Gęstość, w jakiej znajdują się komórki 293TN w momencie transfekcji, jest szczególnie ważna, aby odczynnik PureFection mógł wystarczająco przenieść lentiwektor i plazmidy pakujące do komórek. Dodanie mieszaniny PureFection do płytki hodowli tkankowej w sposób kroplowy, a następnie dokładne zawirowanie płytki jest ważne dla dyspersji plazmidów pakujących i konstruktu lentiwektora we wszystkich komórkach. Niewłaściwe rozmieszczenie wektorów może skutkować niewystarczającą ilością cząstek lentiwirusa. Reakcja pakowania wirusa może być skalowana w celu wytworzenia wirusa o wysokim mianie, w oparciu o powierzchnię płytek do hodowli tkankowych. Można zdecydować się na umieszczenie na talerzu kilku szalek do hodowli tkankowej zawierających komórki 293TN na konstrukt, który należy zapakować. Stężenie supernatantów wirusa jest szczególnie pomocne w tworzeniu wirusa o wysokim mianie. Supernatant wirusowy z wielu płytek komórkowych może być łączony i zagęszczany do stosowania w eksperymentach in vivo lub w komórkach, które są trudne do transdukcji.

Mianowanie wytwarzanych cząstek lentiwirusa jest ważne dla obliczenia dokładnego MOI, który można wykorzystać do transdukcji komórek docelowych. Znajomość MOI, który został użyty w danej transdukcji, umożliwia rozwiązywanie problemów w przypadku, gdy transdukcja się nie powiedzie. Na przykład użycie zbyt niskiego MOI może spowodować, że bardzo niewiele komórek docelowych wyrazi interesujący nas konstrukt. Użycie zbyt wysokiego MOI może jednak spowodować, że komórki docelowe będą wykazywać oznaki stresu. Celem jest wykorzystanie MOI, który maksymalizuje ekspresję interesującego konstruktu, jednocześnie zachowując zdrowie komórek. Chociaż zalecamy protokół miareczkowania oparty na qPCR, który mierzy zintegrowane kopie konstruktu lentiwirusowego w komórkach HT1080, można również zastosować inne podejścia do miareczkowania, takie jak test ELISA p24 lub oszacowanie procentu komórek GFP-dodatnich.

Skuteczna transdukcja komórek docelowych zależy również od kilku kluczowych czynników. TransDux to unikalny odczynnik do infekcji, który umożliwia wysoką wydajność transdukcji, ale nie jest toksyczny dla komórek. TransDux może być stosowany zamiast polibrenu, który często jest toksyczny dla komórek docelowych. Włączenie TransDux do transdukcji komórek docelowych pomaga zneutralizować ładunki na cząsteczkach wirusa i umożliwia wirusowi wniknięcie do komórek. Ponieważ TransDux nie jest toksyczny dla komórek, można pozwolić, aby cząsteczki lentiwirusa pozostawały w kontakcie z komórkami do 72 godzin (czas, w którym konstrukty wirusowe zintegrowały się z genomem komórki gospodarza), zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo przedostania się cząstek wirusa do komórki. W przypadku niektórych trudnych do transdukcji komórek transdukcje można powtarzać w kolejnych dniach, aby zwiększyć wydajność transdukcji. Na przykład, transdukuj komórki w dniu 1, pozwól komórkom odpocząć w dniu 2, a następnie ponownie transdukuj komórki w dniu 3. Ważne jest, aby odczekać 72 godziny po ostatniej transdukcji przed rozpoczęciem selekcji, dalszych eksperymentów lub charakterystyki komórek docelowych.

Skuteczne pakowanie wirusa zależy również od wielkości konstruktu lentiwirusowego, między regionami 5' i 3'LTR. Ten fragment konstruktu lentiwirusowego powinien mieć około 9 kb lub mniej, co odpowiada rozmiarowi rodzimego genomu wirusa HIV. Przekroczenie 9 kb może obniżyć miano wytwarzanych cząstek pseudowirusowych. Nowe technologie, takie jak wektory transpozonów piggyBac, pozwalają na niezawodną, stabilną integrację transgenów o wielkości do 100 kb podczas jednej transfekcji. Podejście to może być stosowane w przypadku konstruktów, które przekraczają limit wielkości dla wektorów lentiwirusowych, w przypadkach, gdy możliwa jest transfekcja komórek docelowych, i zapewnia dodatkową zaletę polegającą na tym, że nie jest wymagany etap pakowania wirusa ^9,10.

Cząsteczki pseudowirusowe wytwarzane przy użyciu tego protokołu są zakaźne, ponieważ mogą infekować większość typów komórek ssaków. Produkty stosowane w tym protokole są jednak biobezpieczne trzeciej generacji, ponieważ wytwarzają niereplikujące i samoinaktywujące się pseudowirusy. Dlatego po transdukcji do komórek docelowych lub zwierząt, komórki docelowe lub zwierzęta nie są zakaźne ani zaraźliwe. Zastąpienie innych plazmidów lentiwektorowych, które nie są bezpieczne biologicznie trzeciej generacji, jest możliwe, chociaż nie jest to zalecane z punktu widzenia bezpieczeństwa biologicznego. Protokół produkcji wirusa i późniejsza transdukcja komórek docelowych powinny być przeprowadzane na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, zgodnie z wytycznymi NIH ¹¹, a naukowcy powinni zawsze nosić fartuch laboratoryjny i rękawice podczas pracy z cząsteczkami wirusa. Zużyte ogniwa produkcyjne 293TN, probówki z cząstkami wirusa i jednorazowe pipety należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na zagrożenia biologiczne. Pipety wielokrotnego użytku i naczynia szklane należy odkazić wybielaczem i sterylizować w autoklawie, aby zmniejszyć narażenie personelu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM Medium o wysokiej zawartości glukozy	GIBCO, firmy Life Technologies	11995-073
Komórki 293TN	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	Dla lentywektorów na bazie HIV
pPACKF1	SBI	LV100A-1	Dla lentiwektorów opartych na FIV
Dowolny wektor lentiwirusowy	SBI	Różne	cDNA, shRNA, mikroRNA, transkrypcja reporterzy
Specyfikacja	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Zestaw do miareczkowania Global UltraRapid	SBI	LV961A-1	Nie opisano w tym protokole, ale potrzebny do mianowania cząstek wirusa
TransDux	SBI	LV850A-1