Pakowanie konstruktów ekspresyjnych lentiwektorów opartych na HIV lub FIV oraz transdukcja pseudotypowanych cząsteczek wirusowych VSV-G

Podsumowanie

Lentiwirusowe wektory ekspresyjne są najskuteczniejszymi nośnikami do stabilnej ekspresji różnych cząsteczek efektorowych lub konstruktów reporterowych w dzielących się i niedzielących się komórkach ssaków oraz w całych organizmach. Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący pakowania lentiwirusowych konstruktów ekspresyjnych w pseudowirusowe cząstki oraz transdukcji komórek docelowych przy użyciu tych cząstek.

Streszczenie

Podobnie jak w przypadku standardowych wektorów plazmidowych, możliwe jest transfekowanie lentivektorów w formie plazmidowej do komórek z niską lub średnią wydajnością w celu uzyskania przejściowej ekspresji efektorów. Jednakże pakowanie konstrukcji ekspresyjnych lentiwirusem do pseudowiralnych cząstek pozwala na uzyskanie do 100% transdukcji, nawet w komórkach trudnych do transfekcji, takich jak komórki pierwotne, macierzyste i zróżnicowane. Co więcej, dostarczanie lentiwirusowe nie wywołuje specyficznych odpowiedzi komórkowych typowo związanych z transfekcjami chemicznymi, takich jak śmierć komórek wynikająca z toksyczności odczynnika do transfekcji ^{1, 2}. Po transdukcji do komórek docelowych konstrukcja lentiwirusowa integruje się z DNA genomowym i zapewnia stabilną ekspresję krótkiego rybowego RNA w formie spinki (shRNA), cDNA, mikroRNA lub genu reporterowego ^{3, 4}. Komórki docelowe stabilnie eksprimujące cząsteczkę efektora można wyizolować za pomocą markera selekcyjnego zawartego w konstrukcji wektora ekspresyjnego, takiego jak puromycyna lub GFP. Po zainfekowaniu komórek docelowych przez cząstki pseudowiralne nie mogą one replikować się w tych komórkach, ponieważ brakuje wirusowych genów strukturalnych, a długie powtórzenia końcowe (LTRs) są zaprojektowane tak, aby ulegały samoinaktywacji po transdukcji ^{5, 6}.

Do wydajnego pakowania lentiwirusów niezbędne są trzy główne komponenty ^{1, 5, 6, 7}.
1. Lentiwirusowy wektor ekspresyjny, który zawiera niektóre z elementów genetycznych wymaganych do pakowania, stabilnej integracji konstruktu ekspresyjnego wirusa z DNA genomicznym oraz ekspresji efektora lub reportera.
2. Lentiwirusowe plazmidy pakujące, które dostarczają białek niezbędnych do transkrypcji i pakowania kopii RNA konstruktu ekspresyjnego w rekombinowane cząsteczki pseudowirusowe. W niniejszym protokole zastosowano plazmidy pPACK (SBI), które kodują gag, pol i rev z genomu HIV lub FIV oraz białko g wirusa zapalenia jamy ustnej (VSV-G) jako białko otoczki wirusowej.
3. Komórki producenta 293TN (pochodne komórek HEK293), które wykazują ekspresję dużego antygenu T SV40, niezbędnego do produkcji lentiwirusów o wysokim mianie, oraz genu oporności na neomycynę, przydatnego do ponownej selekcji komórek w celu ich utrzymania.

Przegląd protokołu produkcji wirusowej przedstawiono na Ryc. 1. Produkcja wirusów rozpoczyna się od kotransfekcji komórek producenta 293TN lentiwirusowym wektorem ekspresyjnym oraz plazmidami pakującymi. Cząstki wirusowe są wydzielane do pożywki. Po 48-72 godzinach pobiera się pożywkę z hodowli komórkowej. Z pożywki usuwa się zanieczyszczenia komórkowe, a cząstki wirusowe są wytrącane poprzez wirowanie z użyciem PEG-it w celu ich zagęszczenia. Wyprodukowane cząstki lentiwirusowe są następnie miareczkowane i mogą być wykorzystane do transdukcji komórek docelowych. Szczegóły miareczkowania wirusów nie zostały zawarte w niniejszym protokole, ale można je znaleźć pod adresem:

http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ⁸.

Protokół ten został zoptymalizowany z wykorzystaniem wskazanych konkretnych produktów. Można zastosować inne odczynniki, jednak nie gwarantuje to uzyskania identycznych wyników.

Protokół

1. Transfekcja komórek 293TN plazmidami pakującymi oraz konstruktem ekspresyjnym

1. Wysiać 7,0 - 8,0 x 10⁶ komórek 293TN na płytkę hodowlaną o powierzchni 15 cm² w 20 ml pożywki DMEM uzupełnionej o 4 mM L-glutaminy, 4,5 g/l glukozy oraz płodową surowicę bydlęcą (10%) bez antybiotyków. Inkubować przez 18-24 godziny w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂, tak aby w momencie transfekcji gęstość komórek osiągnęła 60-80% konfluencji. W niektórych przypadkach może być konieczne wysianie kilku płytek komórek, aby uzyskać miano wystarczająco wysokie do transdukcji komórek docelowych.
2. Dla każdej płytki komórek dodać 1,6 ml bezsurowiczego DMEM do autoklawowanej probówki Eppendorff o pojemności 2 ml. Do DMEM dodać 45 μl pPACKH1 lub pPACKF1 oraz 4,5 μg konstrukcji lentiwektora i wymieszać poprzez pipetowanie.
3. Do tej samej probówki dodać 55 μl PureFection. Mieszać w wirówce typu vortex przez 10 sekund. Inkubować mieszaninę DMEM-Plazmid-PureFection w temperaturze pokojowej przez 15 min.
4. Mieszaninę DMEM-Plazmid-PureFection dodawać kroplami do płytki hodowlanej i delikatnie zakręcić, aby równomiernie rozprowadzić ją po całej płytce. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i hodować w 37 °C przy 5% CO₂.
5. Po transfekcji nie ma potrzeby wymiany pożywki. Jeśli konstrukcja lentiwektora wykazuje ekspresję genu kodującego białko fluorescencyjne, takie jak GFP, należy sprawdzić komórki pod mikroskopem 12-24 godziny po transfekcji. Powinno być widocznych >90% komórek GFP-dodatnich, co wskazuje na powodzenie transfekcji.
6. Po 48 i 72 godzinach zebrać nadosód hodowli komórkowej do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Nadosód ten zawiera teraz zakaźne pseudowirusowe cząsteczki. (Należy przestrzegać zalecanych wytycznych dotyczących pracy z materiałem klasy bezpieczeństwa BSL-2). Wirować przy 1 500 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej, aby osadzić resztki komórkowe. Przenieść nadosód wirusowy do nowej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu.
7. Komórki 293TN wykorzystane do pakowania wirusów należy zutylizować w pojemniku na odpady biologiczne; nie mogą być one używane do kolejnych rund pakowania wirusów.

2. Koncentracja supernatantu wirusowego

1. Do każdych 4 objętości supernatantu zawierającego cząstki lentiwirusowe dodać 1 objętość schłodzonego (4 °C) roztworu do precypitacji wirusów PEG-it. Precypitację cząstek lentiwirusowych z dużych objętości można przeprowadzić, używając polipropylenowych probówek wirówkowych Corning 250 ml. Wymieszać roztwór, kilkukrotnie odwracając probówki, nie stosując jednak mieszania w wirówce typu vortex.
2. Przechowywać roztwór w lodówce w temperaturze 4 °C przez co najmniej 12 godzin (dopuszczalny czas do 4 dni). Podczas etapu chłodzenia nie potrząsać ani nie obracać probówek.
3. Odwirować mieszaninę supernatantu i PEG-it z prędkością 1,500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu cząstki lentiwirusowe będą widoczne w postaci beżowego lub białego osadu na dnie probówki. Odlać supernatant.
4. Usunąć wszystkie pozostałości cieczy za pomocą aspiracji, uważając, aby nie naruszyć precypitowanych cząstek lentiwirusowych w osadzie. Śladowe ilości pozostałego PEG-it rozcieńczą wirusa (zmniejszając tym samym miano), ale nie wpłyną na integralność komórek docelowych, ponieważ PEG-it jest substancją obojętną i nietoksyczną.
5. Resuspendować i połączyć cząstki lentiwirusowe w 1/100 objętości wyjściowej, używając schłodzonego (4 °C), sterylnego roztworu soli fizjologicznej fosforanowej (PBS) lub DMEM zawierającego 25 mM bufor HEPES.
6. Rozdzielić do sterylnych probówek kriogenicznych i przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu użycia.

3. Miareczkowanie wirusa i transdukcja komórek docelowych

1. Zalecamy oznaczenie miana cząstek lentiwirusowych przed transdukcją docelowych komórek oraz obliczenie odpowiedniej wielokrotności infekcji (MOI) dla tych komórek, aby zapewnić spójność między eksperymentami. Do oznaczania miana wirusa zalecamy stosowanie linii komórkowej HT1080 jako łatwej do zainfekowania kontroli pozytywnej. Należy pamiętać, że protokół oznaczania miana polega na transdukcji komórek HT1080 niewielką ilością zapakowanych cząstek lentiwirusowych. Po ustaleniu miana można przeprowadzić transdukcję docelowych komórek za pomocą otrzymanych cząstek lentiwirusowych. Zalecany protokół oznaczania miana znajduje się pod adresem: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ⁷.
2. Wysiać 50 000 docelowych komórek na dołek w płytce 24-dołkowej w pożywce hodowlanej. Należy użyć pożywki, w której komórki są zazwyczaj hodowane. Hodować komórki przez noc w określonych warunkach hodowli. W dniu transdukcji stopień konfluencji komórek powinien wynosić od 50 do 70%.
3. W dniu transdukcji odessać pożywkę z komórek. Połączyć pożywkę hodowlaną z TransDux do stężenia końcowego 1x (na przykład 2,5 μl TransDux na 500 μl pożywki hodowlanej). Następnie przenieść mieszaninę TransDux i pożywki do każdego dołka.
4. Do każdego dołka pipetować odpowiednią objętość wirusa odpowiadającą optymalnemu MOI dla docelowych komórek. Jeśli optymalne MOI jest nieznane, zalecamy przetestowanie zakresu różnych wartości MOI (na przykład MOI 1, 2 i 5 dla łatwych do zainfekowania komórek hodowli tkankowej oraz MOI 1, 10 i 20 dla trudniejszych do zainfekowania komórek pierwotnych). Jeśli stężenie cząstek lentiwirusowych nie jest znane (wyznaczone za pomocą protokołu oznaczania miana wirusa), można przetestować różne objętości wirusa, np. 1, 2 i 5 μl. Wirus może pozostawać w kontakcie z komórkami docelowymi do 72 godzin.
5. Dalsze eksperymenty z transdukowanymi komórkami docelowymi można rozpocząć 72 godziny po transdukcji, gdy konstrukt wirusowy zostanie zintegrowany z genomem komórki gospodarza. Należy wymienić pożywkę i przeprowadzić pasaż komórek docelowych zgodnie z ich specyficznymi wymaganiami.

4. Reprezentatywne wyniki

Transfekcja komórek 293TN

Gęstość początkowa komórek 293TN ma kluczowe znaczenie dla skutecznego pakowania wirusów. W dniu transfekcji komórki 293TN muszą osiągnąć stopień konfluencji między 60% a 80% (Rysunek 2). Jeśli komórki 293TN wykazują konfluencję poniżej 60%, należy pozwolić im rosnąć przez kilka kolejnych godzin przed przystąpieniem do transfekcji. Jeśli komórki 293TN są >Gdy osiągną 80% konfluencji, należy je przesiać przed transfekcją.

W przypadku użycia lentiwektora wykazującego ekspresję GFP, co najmniej 90% komórek 293TN powinno fluorescować na zielono 24 godziny po transfekcji, co świadczy o jej powodzeniu (Rysunek 3). Jeśli mniej niż 90% komórek jest GFP-dodatnich, nie należy przechodzić do następnego kroku, ponieważ oznacza to, że transfekcja nie powiodła się, a miana wirusa będą niskie. Zamiast tego należy wysiać nowe komórki 293TN i rozpocząć procedurę od nowa, upewniając się, że komórki 293TN osiągnęły odpowiednią gęstość przed transfekcją.

Komórki 293TN mogą odklejać się od płytek hodowlanych w ciągu 48–72 godzin po transfekcji. Nie wpływa to negatywnie na produkcję cząsteczek lentiwirusowych.

Miareczkowanie z użyciem komórek HT1080

Miana wirusowe można obliczyć, korzystając z zestawu Global UltraRapid Titering firmy SBI zgodnie z instrukcjami producenta. System ten wykorzystuje qPCR do pomiaru integracji wirusowej sekwencji WPRE z wektora lentiwirusowego w komórkach HT1080 i porównuje wynik z krzywą wzorcową, opartą na genomicznej sekwencji referencyjnej, aby dokładnie określić liczbę jednostek zakaźnych na ml (Rysunek 4).

Transdukcja komórek docelowych

W przypadku użycia cząstek lentiwirusowych wykazujących konstytutywnie aktywny marker GFP, komórki GFP-dodatnie powinny zacząć pojawiać się w ciągu 12-24 godzin od transdukcji, o ile reakcja transdukcji przebiega prawidłowo. Ekspresja GFP powinna być kontynuowana po stabilnej integracji konstruktu lentiwirusowego z genomem komórki gospodarza. W przypadku transdukcji z różnymi MOI, fluorescencja GFP powinna być w przybliżeniu zgodna z MOI, gdzie niskie MOI wykazują słabszą fluorescencję GFP, a wyższe MOI wykazują zwiększoną fluorescencję GFP (Rysunek 5).

Rysunek 1. Przegląd protokołu produkcji wirusowej. Lentiwektor i plazmidy pakujące pPACK są mieszane i kotransfekowane do komórek 293TN. Po 48–72 godzinach zbiera się nadsącz wirusowy, a cząstki wirusowe są wytrącane za pomocą PEG-it. Po oznaczaniu miana cząstek lentiwirusowych można je wykorzystać do transdukcji wybranych komórek docelowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rysunek 2. Obraz w kontraście fazowym komórek 293TN. W dniu transfekcji gęstość komórek powinna wynosić od 60-80% konfluencji.

Rysunek 3. Obraz fluorescencyjny komórek 293TN pozytywnych pod kątem GFP 24 godziny po transfekcji przy użyciu Purefection, pPACKH1 oraz konstrukcji lentiwektora kodującego GFP.

Rysunek 4. Wyniki qPCR dla WPRE oraz krzywa standardowa uzyskana przy użyciu zestawu Global UltraRapid Titering firmy SBI w celu obliczenia MOI i odpowiadającego mu miana zapakowanych cząsteczek wirusowych.

Rycina 5. Obrazy fluorescencyjne komórek HT1080 transdukowanych zwiększającymi się ilościami lentiwirusa. Obrazy wykonano 72 godziny po transdukcji.

Dyskusja

Niniejszy protokół pakowania wirusowego i transdukcji komórek docelowych został zoptymalizowany do stosowania z odczynnikami do pakowania wirusowego firmy SBI. Zastąpienie ich innymi odczynnikami może wpłynąć na wynik protokołu. Protokół ten został zoptymalizowany wyłącznie do produkcji lentiwirusów i może nie być odpowiedni do produkcji innych typów wirusów lub pseudowirusów.

Skuteczne pakowanie wirusa zależy od kilku kluczowych etapów. Komórki 293TN wykazują ekspresję dużego antygenu T SV40, który jest niezbędny do sekrecji cząstek lentiwirusowych do nadsączu hodowli komórkowej. Gęstość komórek 293TN w momencie transfekcji jest szczególnie istotna, aby odczynnik PureFection mógł w wystarczającym stopniu przenieść lentiwektor oraz plazmidy pakujące do wnętrza komórek. Dodawanie mieszaniny PureFection do płytki hodowlanej kroplami, a następnie dokładne zakręcenie płytką, jest ważne dla równomiernego rozprzestrzenienia plazmidów pakujących i konstrukcji lentiwektora we wszystkich komórkach. Niewłaściwa dystrybucja wektorów może skutkować produkcją niewystarczającej liczby cząstek lentiwirusowych. Reakcję pakowania wirusa można przeskalować w celu produkcji wirusa o wysokim mianie, bazując na powierzchni płytkek hodowlanych. Można zdecydować o wysianiu kilku naczyń z komórkami 293TN na każdą konstrukcję wymagającą pakowania. Zagęszczanie nadsączów wirusowych jest szczególnie pomocne w uzyskiwaniu wirusa o wysokim mianie. Nadsącz wirusowy z wielu płytek z komórkami można połączyć i zagęścić do zastosowania w eksperymentach in vivo lub w przypadku komórek trudnych do transdukcji.

Oznaczanie miana wyprodukowanych cząsteczek lentiwirusowych jest istotne dla obliczenia dokładnej MOI niezbędnej do transdukcji komórek docelowych. Znajomość MOI zastosowanej w danej transdukcji umożliwia rozwiązanie problemów w przypadku, gdy transdukcja nie powiedzie się. Na przykład zastosowanie zbyt niskiej MOI może skutkować tym, że bardzo niewiele komórek docelowych będzie wykazywać ekspresję interesującej nas konstrukcji. Z kolei zastosowanie zbyt wysokiej MOI może doprowadzić do wystąpienia oznak stresu w komórkach docelowych. Celem jest zastosowanie takiej MOI, która maksymalizuje ekspresję interesującej nas konstrukcji przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. Choć zalecamy protokół oznaczania miana oparty na qPCR, który mierzy liczbę zintegrowanych kopii konstrukcji lentiwirusowej w komórkach HT1080, można stosować również inne metody oznaczania miana, takie jak ELISA p24 lub szacowanie procentu komórek wykazujących ekspresję GFP.

Skuteczna transdukcja komórek docelowych zależy również od kilku kluczowych czynników. TransDux jest unikalnym odczynnikiem infekcyjnym, który umożliwia uzyskanie wysokiej wydajności transdukcji, a jednocześnie nie jest toksyczny dla komórek. TransDux można stosować zamiast polybrenu, który często wykazuje toksyczność wobec komórek docelowych. Dodanie TransDux podczas transdukcji komórek docelowych pomaga zneutralizować ładunki na cząsteczkach wirusa i umożliwia ich wniknięcie do komórek. Ponieważ TransDux nie jest toksyczny dla komórek, można pozostawić cząsteczki lentiwirusowe w kontakcie z komórkami do 72 godzin (do czasu, aż konstrukty wirusowe zintegrują się z genomem komórki gospodarza), co zwiększa prawdopodobieństwo wniknięcia cząsteczek wirusa do komórki. W przypadku niektórych komórek trudnych do transdukcji, proces ten można powtarzać w kolejne dni w celu zwiększenia wydajności. Na przykład: przeprowadzić transdukcję komórek w 1. dniu, pozostawić komórki do odpoczynku w 2. dniu, a następnie ponownie przeprowadzić transdukcję w 3. dniu. Ważne jest, aby odczekać 72 godziny po ostatniej transdukcji przed rozpoczęciem selekcji, dalszych eksperymentów lub charakterystyki komórek docelowych.

Wydajne pakowanie wirusowe zależy również od wielkości konstruktu lentiwirusowego pomiędzy regionami 5' i 3'LTR. Ta sekcja konstruktu lentiwirusowego powinna mieć wielkość około 9 kb lub mniej, co odpowiada wielkości natywnego genomu HIV. Przekroczenie 9 kb może obniżyć miano produkowanych pseudocząstek wirusowych. Nowe technologie, takie jak wektory transpozonu piggyBac, umożliwiają niezawodną i stabilną integrację transgenów o wielkości do 100 kb poprzez pojedynczą transfekcję. Podejście to może być stosowane w przypadku konstruktów przekraczających limit wielkości wektorów lentiwirusowych, o ile możliwa jest transfekcja komórek docelowych, i zapewnia dodatkową zaletę w postaci braku konieczności przeprowadzania etapu pakowania wirusowego ^9,10.

Pseudocząsteczki wirusowe wytworzone zgodnie z tym protokołem są zakaźne, w tym sensie, że mogą infekować większość typów komórek ssaków. Produkty użyte w tym protokole są jednak bezpieczne biologicznie w standardzie trzeciej generacji, ponieważ wytwarzają pseudowirusy niereplikujące się i samoinaktywujące. W związku z tym, po transdukcji do komórek docelowych lub organizmów zwierzęcych, komórki lub zwierzęta te nie są zakaźne ani zaraźliwe. Możliwa jest substytucja innych plazmidów lentiwektorowych, które nie są bezpieczne biologicznie w standardzie trzeciej generacji, choć nie jest to zalecane z punktu widzenia bezpieczeństwa biologicznego. Protokół produkcji wirusa oraz późniejsza transdukcja komórek docelowych powinny być przeprowadzane w warunkach 2. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (Biosafety Level 2), zgodnie z wytycznymi NIH ¹¹, a badacze powinni zawsze nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki podczas pracy z cząsteczkami wirusowymi. Zużyte komórki producenta 293TN, probówki z cząsteczkami wirusowymi oraz jednorazowe pipety należy utylizować w odpowiednim pojemniku na odpady biologiczne. Pipety wielorazowe i szkło laboratoryjne należy odkażać za pomocą wybielacza i autoklawowania, aby zmniejszyć ekspozycję personelu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka DMEM High Glucose	GIBCO, by Life Technologies	11995-073
Komórki 293TN	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	Do lentiwektorów opartych na HIV
pPACKF1	SBI	LV100A-1	Do lentiwektorów opartych na FIV
Dowolny wektor lentiwirusowy	SBI	Różne	cDNA, shRNA, microRNA, reportery transkrypcji
Purefection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Zestaw Global UltraRapid Titering	SBI	LV961A-1	Niewymieniony w tym protokole, ale niezbędny do miareczkowania cząstek wirusowych
TransDux	SBI	LV850A-1