Podejście oparte na porównaniu gatunków pozwala neurobiologom behawioralnym badać różne czynniki neurobiologiczne związane z określonymi zachowaniami, uznawanymi za charakterystyczne dla danego modelu zwierzęcego. Wykorzystując naturalnie występujące różnice w zachowaniu między blisko spokrewnionymi gatunkami, technika ta nie wymaga stosowania inwazyjnych metod w celu manipulacji ekspresją danego zachowania.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie podejścia porównawczego gatunków do badania neurobiologii reakcji ojcowskich
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem neuronauki behawioralnej jest zidentyfikowanie podstawowych czynników neurobiologicznych regulujących konkretne zachowania. W celu osiągnięcia tego celu, przy wykorzystaniu modeli zwierzęcych, wiele strategii metodologicznych wymaga zastosowania technik inwazyjnych w celu manipulacji intensywnością badanego zachowania (np. metodyzacja uszkodzeń, manipulacje farmakologiczne, techniki mikrodializy, genetycznie modyfikowane modele zwierzęce). Wykorzystanie podejścia gatunków porównawczych pozwala badaczom wykorzystać naturalnie występujące różnice w strategiach reakcji u blisko spokrewnionych gatunków. W naszym laboratorium wykorzystujemy dwa gatunki z rodzaju Peromyscus, które różnią się reakcjami ojcowskimi. Samiec myszy kalifornijskiej (Peromyscus californicus) wykazuje takie same reakcje rodzicielskie jak samica, podczas gdy jego krewny, mysz pręgowana (Peromyscus maniculatus), praktycznie nie wykazuje reakcji opiekuńczych/rodzicielskich w obecności młodych. Przedmiotem szczególnego zainteresowania w niniejszym artykule jest analiza czynników neurobiologicznych powiązanych z afiliacyjnymi reakcjami społecznymi wykazanymi przez ojców myszy kalifornijskiej. Ponieważ podejście neuronauki behawioralnej jest wieloaspektowe, krótko omówione zostaną następujące kluczowe elementy badania: identyfikacja odpowiednich gatunków do tego typu badań; gromadzenie danych do analizy behawioralnej; przygotowanie i sekcjonowanie mózgów; podstawowe etapy immunocytochemii w celu ilościowego oznaczenia immunoreaktywności wazopresyny; wykorzystanie oprogramowania do neuroobrazowania w celu kwantyfikacji tkanki mózgowej; zastosowanie mikrosekwencyjnej analizy wideo do oceny zachowania oraz, na koniec, odpowiednie analizy statystyczne w celu zapewnienia jak najbardziej rzetelnych interpretacji wyników badań.
Protokół
1. Identyfikacja modelu zwierzęcego
- Mysz kalifornijska (Peromyscus californicus) jest idealnym modelem do badania odpowiedzi ojcowskich. Jak widać, mysz ta pielęgnuje młode tak samo jak samice – kuca nawet nad nimi, sprawiając wrażenie, jakby młode ssały mleko. Zachowanie myszy kalifornijskiej porównuje się z gatunkiem z tego samego rodzaju, myszą pospolitą (Peromyscus maniculatus), która wykazuje niewielkie zainteresowanie młodymi, często próbując uciec lub nawet je zaatakować. (Rysunek 1 przedstawia interakcje tych gatunków z młodymi).
- Po zidentyfikowaniu modelu gatunkowego należy utworzyć odpowiednie grupy. W niniejszym badaniu wykorzystano biologicznych ojców, samce dziewicze bez doświadczenia w opiece oraz samce dziewicze z ograniczoną ekspozycją na młode (eksponowane na młode lub ojcowie zastępczy) obu gatunków, aby ocenić zarówno wrodzone, jak i nabyte cechy ojcowskie. W tym konkretnym badaniu wszystkie grupy poddano również ekspozycji na sztuczną mysz, aby upewnić się, że interakcje społeczne były specyficzne dla młodego osobnika, a nie stanowiły ogólnej odpowiedzi na jakikolwiek przedmiot umieszczony w klatce (Patrz Rysunek 2).
- Przed zbadaniem czynników neurobiologicznych istotne jest potwierdzenie, że wybrane gatunki wykazują wyraźne różnice w analizowanym zachowaniu. W tym badaniu samce umieszcza się w klatce z młodym osobnikiem na pięć minut, a do oceny zachowań, takich jak czas latencji do podejścia do młodego osobnika oraz czas kontaktu z nim, wykorzystuje się etogram zachowań ojcowskich (przykład etogramu znajduje się w Tabeli 1). W przypadku zaobserwowania reakcji agresywnych młody osobnik jest natychmiast usuwany. Sesje te są często nagrywane wideo, co pozwala na późniejszą przeprowadzenie dokładnej analizy behawioralnej.
2. Przygotowanie tkanki mózgowej
- Po przeprowadzeniu standardowej perfuzji każdej myszy (protokół w załączniku), mózgi zostają usunięte, aby można było wykonać ich przekroje w konkretnym obszarze zainteresowania (pokazanie mózgu).
- Standardowy atlas mózgu myszy (pokazanie atlasu) jest wykorzystywany do zlokalizowania jądra przykomorowego w podwzgórzu – obszaru znanego z wysokiej zawartości komórek produkujących neuropeptyd będący przedmiotem niniejszego badania – wazopresynę (AVP).
- Mózg zostaje następnie zablokowany i zamocowany na uchwycie mrożącym, aby tkanka zamarzła przed pocięciem mikrotomem. Mózg jest cięty w trybie wstępnym do momentu zidentyfikowania konkretnych punktów orientacyjnych, a następnie ustawiana jest docelowa grubość przekrojów mózgu, w tym przypadku 30 µm, dla sekcji wykorzystywanych do analizy.
- Przekroje mózgu są ostrożnie umieszczane w płytkach wielodołkowych wypełnionych solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS); (protokół przygotowania PBS w załączniku; należy pamiętać, że jest to tylko jeden z przykładów standardowego protokołu immunocytochemicznego).
3. Immunocytochemia
- W trakcie poszczególnych etapów tego procesu (patrz załączony protokół) kluczowe jest posiadanie precyzyjnych umiejętności pipetowania, aby zapewnić dokładne pomiary odczynników i innych składników istotnych dla tej techniki (pokazanie studenta pipetującego).
- Pierwszym krokiem w tym procesie jest płukanie mózgów, które polega na trzykrotnej lub pięciokrotnej wymianie PBS w płytkach wielodołkowych; pomiędzy każdym płukaniem płytki są umieszczane na wytrząsarce przez 10 minut (pokazanie studenta wymieniającego PBS i umieszczającego płytki na wytrząsakach).
- Następnie skrawki mózgu są eksponowane na roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce (pokazanie procesu).
- Po kolejnym płukaniu skrawki mózgu są eksponowane na przeciwciało drugorzędowe przez jedną godzinę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie płukane.
- Następnie mózgi są eksponowane na roztwór kompleksu awidyny i biotyny w celu przygotowania do wizualizacji komórek pozytywnych pod kątem neurochemicznym.
- W ostatnim kroku wizualizacji mózgi są eksponowane na DAB. Jest to produkt niebezpieczny i zawsze należy z nim obchodzić się ostrożnie. Jak widać tutaj, skrawki mózgu zaczynają ciemnieć na Twoich oczach (pokazanie procesu).
- Po ekspozycji na DAB mózgi przechodzą ostatnią serię płukań, a następnie są ostrożnie umieszczane na preparatowych szkiełkach z powłoką adhezyjną i pozostawiane do wyschnięcia przez noc (pokazanie umieszczania skrawka mózgu na szkiełku; patrz załącznik w celu zapoznania się z protokołem dla szkiełek z powłoką).
- Szkiełka są następnie przejrzyszczane poprzez serię płukań wodą destylowaną i alkoholem, a na koniec zanurzane w Citrosolv przed nałożeniem szkiełek zakrywowych i przechowywaniem w kasecie na preparaty w celu ich zabezpieczenia (pokazanie różnych aspektów tego procesu; patrz załącznik w celu zapoznania się z procesem przejrzyszczania).
4. Neurokwantyfikacja
- Po wyschnięciu preparatów można poddać je ocenie przy użyciu specjalistycznego oprogramowania do neurokwantyfikacji. W tym przypadku wykorzystano oprogramowanie Bioquant do ilościowego oznaczenia komórek i włókien wykazujących obecność wazopresyny w jądrze przykomorowym mózgów myszy (pokaż oprogramowanie na ekranie... oraz mikroskop).
- Konkretny obszar zainteresowania jest identyfikowany za pomocą opcji pomiarowych oprogramowania w celu ustalenia pola widzenia dla neurokwantyfikacji. Ważne jest, aby dla każdego zwierzęcia analizować pole widzenia o jednakowej wielkości (pokaż studenta wykonującego tę czynność).
- Tutaj widoczne są ciemno zabarwione, immunoreaktywne ciała komórek i włókna wazopresyny. Ze względu na trudność w liczeniu lub śledzeniu tej tkanki, specjalna funkcja tego oprogramowania wykorzystuje progowanie światła do określenia całkowitej ilości dodatnio zabarwionej tkanki w wyznaczonym obszarze zainteresowania. Progowanie to informuje, jaka część określonego obszaru zawierała tkankę wykazującą obecność wazopresyny (pokaż wartość danych na ekranie komputera).
5. Analiza behawioralna
- Jeśli nagrania wideo będą oceniane przez więcej niż jednego obserwatora, ważne jest ustalenie niezawodności międzyoceniającej (inter-rater reliability), aby upewnić się, że obserwatorzy oceniają zachowania w spójny sposób. Do właściwej sesji oceniania należy przygotować arkusz oceniania zachowań, który umożliwi łatwe zapisywanie wyników podczas sesji obserwacyjnych (przykład arkusza oceniania znajduje się w Tabeli 2).
- W przypadku zachowań, które nie są szybkie reakcjami epizodycznymi, analiza mikrosekwencyjna może ujawnić subtelności dotyczące przebiegu konkretnych reakcji. Na przykład zachowanie pielęgnacyjne składa się z łańcucha bardzo szybkich reakcji. Chociaż jedną z opcji jest zwykłe rejestrowanie występowania i czasu trwania pielęgnacji, inną jest dokumentowanie łańcucha zdarzeń towarzyszących tej reakcji. Korzystając z oprogramowania do mikrosekwencjonowania, obserwatorzy oceniają występowanie konkretnego zachowania w każdej sekundzie, zgodnie z poleceniami programu (pokaż oprogramowanie i wideo).
- Po zakończeniu zbierania danych określa się interesujące parametry i analizuje odpowiednie wyniki behawioralne. Przykładami mogą być całkowity czas spędzony w kontakcie z młodym lub liczba zakłóceń w sekwencji pielęgnacyjnej (pokaż komputer z arkuszem kalkulacyjnym z wprowadzonymi danymi dla każdego zwierzęcia).
- Po ocenieniu zachowania ważne jest potwierdzenie, że dwa gatunki wykazały różne strategie reakcji w odniesieniu do badanego zachowania. W tym przypadku myszy jeleniowate z Kalifornii powinny wykazywać więcej zachowań ojcowskich niż pospolite myszy jeleniowate. Dodatkowo, różne miary behawioralne można skorelować z pomiarami mózgu, aby uzyskać pełniejszy obraz istotnych wpływów.
6. Reprezentatywne wyniki:
- Aby zwalidować model, dane powinny jasno wskazywać, że dwa gatunki wykazywały odmienne zachowania w zakresie analizowanego parametru. W tym przypadku widać, że samce P. californicus poświęcały więcej czasu na pielęgnację i kucanie nad młodymi, co stanowi dwie charakterystyczne cechy reakcji ojcowskich (patrz Rycina 4).
- Aby ustalić, czy analizowana zmienna neurobiologiczna jest istotna w reakcjach ojcowskich, ilościowo określono ilość tkanki pozytywnej na wazopresynę (AVP) w kilku istotnych obszarach mózgu; jak widać, u ojcowskich osobników P. californicus w kilku z tych obszarów mózgu stwierdzono więcej tkanki immunopozytywnej (patrz Rycina 5).
- W powiązanym badaniu z wykorzystaniem analizy mikrosekwencjonowania postawiono hipotezę, że ojcowskie myszy kalifornijskie będą wykazywać mniejszy poziom lęku niż ich odpowiedniki, które nie miały potomstwa; w konsekwencji, po wystawieniu na zapach drapieżnika, u ojców odnotowano mniej przerw w sekwencji pielęgnacyjnej niż u osobników dziewiczych (patrz Rycina 6).
Rycina 1: (A) Samiec myszy kalifornijskiej wykazujący reakcje ojcowskie wobec obcego młodego osobnika tego samego gatunku. (B) Samiec myszy jeleniej wykazujący ostrożne podejście (postawa „stretch attend”) i reakcję unikania w obecności obcego młodego osobnika tego samego gatunku. Uwaga: W tych ocenach interakcji społecznych, jeśli samiec wykazuje agresywne reakcje wobec młodego osobnika, eksperymentatorzy natychmiast uderzają w górną część klatki, aby odwrócić uwagę samca. W tym momencie sesja zostaje zakończona, a młody osobnik jest usuwany, sprawdzany pod kątem obrażeń i oddawany matce. W naszym laboratorium rzadko obserwuje się to u samców P. californicus, lecz sporadycznie u P. maniculatus; jednak uważna obserwacja i natychmiastowa interwencja zapobiegają wyrządzeniu krzywdy zwierzętom.
Rycina 2: Mysz kalifornijska wchodząca w interakcję z zabawką w kształcie myszy; większość osobników próbowała gryźć te bodźce.
Rycina 3: Projekt eksperymentalny badania; w każdej grupie dla każdego gatunku znajdowało się około 6 zwierząt.
Rysunek 4: Graficzne przedstawienie procesu immunocytochemii.
Rycina 5. Reakcje ojcowskie u myszy kalifornijskiej i myszy jeleniowatej; u myszy kalifornijskiej zaobserwowano więcej reakcji ojcowskich (pielęgnacja, kucanie, szybsze zbliżanie się). U myszy jeleniowatej zaobserwowano więcej zachowań typu stretch attend (reakcja stresowa).
Rycina 6. Immunoreaktywność wazopresyny w różnych obszarach mózgu u obu gatunków. U myszy kalifornijskich stwierdzono silniejsze barwienie w komórkach i włóknach PVN.
Rysunek 7: Myszy kalifornijskie z doświadczeniem ojcowskim wykazywały mniej zakłóceń w sekwencjach pielęgnacji w obecności zapachu drapieżnika niż grupy wystawione na kontakt z młodymi oraz grupy dziewicze.
Dyskusja
W niniejszym artykule omówiono trzy kluczowe elementy uznawane za krytyczne dla pomyślnego przeprowadzenia badań w dziedzinie neuronauki behawioralnej: (1) reprezentatywny i walidacyjny model zwierzęcy; (2) dokładny i czuły protokół immunocytochemiczny oraz (3) właściwą analizę (obserwacyjną i statystyczną) danych behawioralnych oraz mózgowych. Błędy w choćby jednej z tych kategorii z pewnością wpłyną negatywnie na wyniki całego badania. Dlatego po starannym wyborze odpowiedniego modelu zwierzęcego należy poświęcić znaczną uwagę testom pilotażowym procedur behawioralnych i histologicznych, aby zapewnić rzetelną obserwację zachowań w badaniu, a następnie prawidłowe przetworzenie mózgów.
Jak wspomniano wcześniej, wykorzystanie gatunków porównawczych do identyfikacji mechanizmów neurobiologicznych konkretnej reakcji jest cennym podejściem metodologicznym, ponieważ technika ta nie wymaga inżynierii genetycznej ani bolesnych manipulacji chirurgicznych. W związku z tym podejście to pozwala na wykorzystanie zwierząt nienaruszonych i mniej zagrożonych. Wykorzystanie naturalnych wariacji zwierząt jest jednak wzmacniane przez wprowadzenie środowisk przypominających naturalne, nawet jeśli zwierzęta są przetrzymywane w laboratorium. Ponadto zaleca się wykonanie kolejnego kroku, jakim jest rozszerzenie badań laboratoryjnych na warunki terenowe w celu dalszej walidacji autentyczności różnic międzygatunkowych w badanym zachowaniu. Chociaż podejście porównawcze oferuje wiele zalet, ograniczeniem jest korelacyjny charakter danych; w konsekwencji należy zastosować dodatkowe techniki, takie jak manipulacje farmakologiczne, aby dalej potwierdzić rolę ukierunkowanych systemów neurobiologicznych w analizowanym zachowaniu.
Po upewnieniu się badaczy co do poprawności procedur behawioralnych, histologicznych i statystycznych, należy zadbać o to, aby warunki bytowe zwierząt pozostały stałe dla wszystkich grup, z wyjątkiem oczywiście manipulacji eksperymentalnej. Zmiany zmiennych takich jak harmonogramy oświetlenia, poziom hałasu, opiekunowie, poziom wilgotności i zapachy w laboratorium mogłyby mieć istotny wpływ na odpowiedzi neurobiologiczne zwierząt.
W niniejszym artykule przeciwciało pierwszorzędowe zostało wykorzystane do wykrywania wazopresyny, jednak można zastosować inne przeciwciała pierwszorzędowe dla wielu różnych interesujących neurochemikaliów. Jeśli badacz pracuje z nowym przeciwciałem, ważne jest przeprowadzenie badań miareczkowania w celu ustalenia optymalnego rozcieńczenia nowego przeciwciała. Bardzo często stosuje się zbyt dużą ilość przeciwciała (zgodnie z sugestią producenta), co skutkuje zbyt ciemnym zabarwieniem tkanki, uniemożliwiającym odróżnienie sygnału; ponadto nadmierne zużycie przeciwciał wiąże się z wysokimi kosztami.
Wreszcie, jeśli do przedstawienia alternatywnych ujęć i interpretacji danych można zastosować więcej niż jedną analizę statystyczną, należy z nich skorzystać. W niniejszym badaniu wykorzystano ogólne modele liniowe, analizy korelacyjne oraz wielowymiarowe skalowanie, aby uzyskać najbardziej informacyjne ujęcia danych.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badania te zostały sfinansowane z grantu nr 0723341 (przyznanego KGL) przez National Science Foundation. Jesteśmy również wdzięczni za wsparcie zapewnione przez program stypendialny Schapiro Undergraduate Research Fellowship oraz Katedrę Psychologii na Randolph–Macon College. Na koniec dziękujemy Craigowi Kinsleyowi za wkład w ramach współpracy przy tych badaniach oraz Amandzie Rzucidlo za pomoc w przygotowaniu laboratorium R-MC na potrzeby tego artykułu wideo.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Binokularny mikroskop złożony | Motic | BA400 | |
| Oprogramowanie do nauk biologicznych BIOQUANT | BioQuant Image Analysis Corporation | Wersja 8.40.20 | |
| Kriostat | Microm International | HM525 | |
| Napęd konsolowy Masterflex Easy-Load L/S (pompa perfuzyjna) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Kasetka do hodowli komórkowej z 24 dołkami (poddana obróbce do hodowli tkanek; niepirogenny polistyren; sterylna) | Corning | 3526 | |
| szkiełka przedmiotowe 25x75x1 mm | Globe Scientific, Inc. | 1324W | |
| szkiełko nakrywkowe nr 1 22x50 mm | Globe Scientific, Inc. | 1414-10 | |
| Niesterylne graduate pipety transferowe z dużym balonem o pojemności 3 ml | Nauki o mikroskopii elektronowej | 70962-9 | & |
| Proszek detergentowy Alconox | Alconox, Inc. | 1104 | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S9888-1kg | CAS 7647-14-5 |
| Wodorofosforan sodu | Widmo | SO130 | CAS 10049-21-5 |
| fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny | Sigma-Aldrich | 30412 | CAS 10028-24-7 |
| Triton X | Widmo | TR135 | CAS 9002-93-1 |
| Medium montażowe | Fisher Scientific | SP15-500 | CAS 108-88-3 |
| Siarczan potasu i chromu | Sigma-Aldrich | C-5926 | CAS 7788-99-0 |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Etanol, butelki z polietylenu o wysokiej gęstości (HDPE), 200 proof, 24 x 1 pint | Pharmco-AAPER | 111000200CSPP | |
| Normalne surowica kozia | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Króliczy przeciwciało przeciwko wazopresynie, odczynnik specyficzny dla anality** | Immunostar, Inc. | 20069 | |
| Biotynilowane przeciwciała anty-królicze IgG (H+L) oczyszczone metodą powinowactwa | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Zestaw Elite Standard Vectastain ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Zestaw substratu peroksydazy DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Oryginalna żelatyna bezsmakowa (opakowanie 4 kopert), pudełko 1 uncja | Knox | Kupić w lokalnym sklepie spożywczym | |
| 3% nadtlenek wodoru | CareOne | Zakup w lokalnej aptece | |
| Wybielacz | Clorox | Kupić w lokalnym sklepie spożywczym |
Bibliografia
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
Przedruki i uprawnienia
