Bezsoczewkowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie

Podsumowanie

Bezsoczewkowa platforma mikroskopii fluorescencyjnej na chipie jest demonstrowana, która może obrazować obiekty fluorescencyjne w ultraszerokim polu widzenia, np. >0,6-8 cm2 z rozdzielczością <4μm, używając algorytmu dekodowania opartego na kompresyjnym próbkowaniu. Tak kompaktowa i szerokokątna metoda obrazowania fluorescencyjnego na chipie może być cenna dla wysokoprzepustowej cytometrii, badań nad rzadkimi komórkami i analizy mikromacierzy.

Streszczenie

Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie bezsoczewkowe na chipie ma na celu zastąpienie nieporęcznych mikroskopów optycznych opartych na soczewkach prostszymi i bardziej kompaktowymi konstrukcjami, szczególnie dla zastosowań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Ta powstająca platforma technologiczna ma potencjał, aby wyeliminować potrzebę stosowania nieporęcznych i/lub kosztownych komponentów optycznych dzięki nowatorskim teoriom i algorytmom rekonstrukcji cyfrowej. W ten sam sposób demonstrujemy wbudowaną w układ mikroskopii fluorescencyjnej, która może osiągnąć np. rozdzielczość przestrzenną <4 μm w ultraszerokim polu widzenia (FOV) wynoszącym >0,6-8 cm² bez użycia jakichkolwiek obiektywów, skanowania mechanicznego lub cienkowarstwowych filtrów interferencyjnych. W tej technice wzbudzenie fluorescencyjne uzyskuje się przez pryzmat lub granicę faz półkulisto-szklaną oświetloną przez niespójne źródło. Po interakcji z całą objętością obiektu, to światło wzbudzenia jest odrzucane w procesie całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR), który zachodzi na dnie chipa mikroprzepływowego próbki. Emisja fluorescencyjna ze wzbudzonych obiektów jest następnie zbierana przez światłowodową płytę czołową lub stożek i dostarczana do optoelektronicznego układu czujników, takiego jak urządzenie sprzężone z ładunkiem (CCD). Dzięki zastosowaniu algorytmu dekodowania opartego na kompresyjnym próbkowaniu, uzyskane surowe obrazy fluorescencyjne próbki bez soczewek można szybko przetworzyć, aby uzyskać np. rozdzielczość <4 μm przy polu widzenia >0,6-8^cm2. Co więcej, pionowo ułożone mikrokanały, które są oddzielone np. 50-100 μm, mogą być również z powodzeniem obrazowane przy użyciu tej samej bezsoczewkowej platformy mikroskopowej na chipie, co dodatkowo zwiększa ogólną przepustowość tej modalności. Ta kompaktowa, wbudowana w układ scalony platforma obrazowania fluorescencyjnego, z szybkim dekoderem kompresyjnym za nią, może być bardzo cenna w wysokoprzepustowej cytometrii, badaniach nad rzadkimi komórkami i analizie mikromacierzy.

Protokół

W tej sekcji przyjrzymy się eksperymentalnym metodom naszej bezsoczewkowej platformy mikroskopii fluorescencyjnej^1-4. Aby zademonstrować możliwości tej techniki, pokażemy wyniki obrazowania na chipie dla fluorescencyjnych mikrocząstek i znakowanych białych krwinek. Chociaż nie zostało to tutaj omówione, ta sama platforma mikroskopii fluorescencyjnej bez soczewek może być również używana do obrazowania małych zwierząt modelowych, takich jak transgeniczne próbki C. elegans ³.

1. Projekt bezsoczewkowej platformy obrazowania na chipie

Nasza bezsoczewkowa platforma obrazowania na chipie składa się z kilku komponentów optycznych, w tym cyfrowego układu czujników (np. chipa CCD), niespójnego źródła oświetlenia, pryzmatu, filtra absorpcyjnego, światłowodowej płyty czołowej lub stożka światłowodowego. Jak pokazano na rys. 1, elementy te są montowane za pomocą urządzeń mikroprzepływowych w celu uzyskania obrazowania fluorescencyjnego dużej objętości próbki na chipie, bez użycia jakichkolwiek soczewek, skanerów mechanicznych lub cienkowarstwowych filtrów interferencyjnych.

1. Cyfrowa matryca czujników: Nasza konfiguracja obrazowania bezsoczewkowego wykorzystuje optoelektroniczną matrycę czujników do rejestrowania emisji fluorescencji z docelowych mikroobiektów. Na tej platformie, do wykrywania sygnału fluorescencyjnego, można stosować różne typy matryc czujników, takie jak przetworniki CCD (np. modele: KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000, wszystkie firmy KODAK) i komplementarne przetworniki półprzewodnikowe metal-tlenek (CMOS, np. Model: MT9T031C12STCD, firmy Micron Technologies). Kluczowe parametry interesujące dla tych matryc sensorów obejmują rozmiar piksela (np. 5,4 μm, 9 μm, 6,8 μm i 3,2 μm odpowiednio dla KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 i MT9T031C12STCD) oraz aktywny obszar obrazowania (np. 2,4 cm², 8 cm², 18 cm² i 32 mm² dla KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 i MT9T031C12STCD, odpowiednio). W przypadku obrazowania na chipie bez użycia soczewek czujniki CCD mogą być generalnie preferowane w celu osiągnięcia wyższej przepustowości (szerszy obszar aktywny) i lepszej czułości, podczas gdy czujniki CMOS mogą być preferowane w przypadku stosunkowo tańszych i lżejszych konstrukcji (np. do użytku w terenie).
2. Źródła światła: W naszej platformie do wzbudzenia fluorescencji można zastosować niespójne źródło światła, np. prostą diodę elektroluminescencyjną (LED np. firmy Thorlabs, M455L2-C2 i LEDD1B). W układzie doświadczalnym pokazanym na rys. 1 wielomodowy kabel światłowodowy (Thorlabs, BFH37-1000) o średnicy rdzenia 1 mm jest sprzężony doczołowo ze źródłem LED (bez użycia jakichkolwiek soczewek lub optyki sprzęgającej), a następnie światło wzbudzenia jest dostarczane do objętości próbki przez otwór wyjściowy tego światłowodu. W tym układzie wymagany poziom mocy wzbudzenia fluorescencji powinien wynosić około ~ 0,2- 5 mW dla pola widzenia > 2-8^cm2 na wyjściu światłowodu oświetleniowego; jednak diody LED powinny być w stanie wyprowadzać poziomy mocy ~ 5mW-1W, ponieważ podejście sprzężenia doczołowego jest znacznie stratne, co zmniejsza moc wzbudzenia na wyjściu światłowodu. Aby uzyskać wzbudzenie różnych barwników, diody LED o różnych kolorach mogą być również multipleksowane za pomocą łącznika światłowodowego.
   Oprócz wbudowanego w układ obrazowania fluorescencyjnego, za pomocą tej platformy można również uzyskać obrazy transmisji holograficznej tej samej próbki bez soczewek, wykorzystując pionowe źródło oświetlenia, jak pokazano na rys. 2. W przeciwieństwie do światłowodu wzbudzającego fluorescencję, w celu akwizycji obrazu holograficznego inny kabel światłowodowy o mniejszym rozmiarze rdzenia (np. ~50-400 μm) jest sprzężony doczołowo z innym źródłem LED (Mightex, FCS-0625-000). To pionowe światło świetlne, po wyjściu z końca światłowodu, zaczyna nabierać częściowej spójności przestrzennej, gdy rozchodzi się w kierunku próbki. Średnica tego przestrzennie spójnego obszaru jest proporcjonalna do odległości, jaką pokonuje światło i jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości otworu wyjściowego światłowodu. Tak długo, jak ta przestrzenna średnica koherencji na płaszczyźnie próbki jest większa niż rozmiar dyfrakcji każdej próbki na płaszczyźnie czujnika, rozproszone światło z każdego obiektu może wiernie interferować ze światłem tła, tworząc bezsoczewkowy hologram próbki. Te pozyskane hologramy bez soczewek mogą być następnie szybko przetworzone przy użyciu iteracyjnych podejść do odzyskiwania fazy w celu zrekonstruowania obrazu transmisyjnego jasnego pola objętości próbki^5-7. Do tego holograficznego końca oświetlenia wybiera się diodę LED o dłuższej długości fali (tj. ~ 625-700 nm), ponieważ filtry absorpcyjne, które są używane do blokowania światła wzbudzenia, są filtrami górnoprzepustowymi o typowych długościach fal odcięcia, np. 500-600 nm, co pozwala na bezproblemowe pozyskiwanie transmisyjnych hologramów próbek w linii.
3. Inne elementy optyczne: W tej wbudowanej platformie mikroskopii fluorescencyjnej dwie różne metody filtrowania wzbudzenia są stosowane równolegle w celu stworzenia wymaganego tła ciemnego pola, jak pokazano na rys. 2. Po pierwsze, szklany pryzmat (np. Edmund Optics, romboidalne lub gołębie pryzmaty) lub szklana półkula jest używana do wytworzenia całkowitego wewnętrznego odbicia (dla światła wzbudzenia) na dolnej powierzchni mikroprzepływowego chipa, w którym znajdują się interesujące nas próbki. Równolegle stosuje się niedrogi filtr absorpcyjny (np. firmy Roscolux), który usuwa słabo rozproszone światło wzbudzenia, które nie jest posłuszne procesowi TIR. Po pomyślnym odrzuceniu wzbudzenia za pomocą tych dwóch mechanizmów, w płaszczyźnie detektora uzyskuje się tylko emisję fluorescencyjną próbek. Zauważ tutaj, że pewna część emitowanego sygnału fluorescencyjnego również doświadcza TIR na tym samym interfejsie. Jednak ogranicza to tylko aperturę numeryczną wykrywania tego bezsoczewkowego podejścia do obrazowania na chipie do ~1,0, tak że tylko ukośne promienie powyżej tak wysokiej apertury numerycznej detekcji pozostają uwięzione w mikrochipie, podczas gdy reszta promieni fluorescencyjnych może nadal uderzać w aktywny obszar matrycy czujnika, który ma być próbkowany przez jego piksele.
   Pomimo tak dużej apertury numerycznej detekcji, surowe plamki fluorescencyjne na matrycy czujników stają się dość szerokie (np. ~150-200 μm), ponieważ emisja fluorescencyjna nie jest kierunkowa i dlatego szybko się rozchodzi. Aby zaprojektować i lepiej kontrolować przestrzenne rozchodzenie się tego sygnału fluorescencyjnego w naszej platformie bezsoczewkowej, wykorzystaliśmy planarny komponent optyczny, tj. światłowodową płytę czołową (np. Edmund Optics, NT55-142), która jest umieszczona między obiektem a płaszczyznami czujnika. Światłowodowa płyta czołowa składa się z zestawu światłowodowych 2D, które przenoszą informacje o natężeniu optycznym z jednej strony urządzenia na drugą. Jego główną funkcją w naszej bezsoczewkowej mikroskopii chipowej jest sprzężenie trybów wolnej przestrzeni emisji fluorescencji z objętości próbki z kierowanymi falami optycznymi poruszającymi się bez rozpraszania przestrzennego w każdym włóknie, co może częściowo zawęzić funkcję punktowego rozproszenia fluorescencji bezsoczewkowej (PSF) między obiektem a płaszczyznami detektora. To jeszcze bardziej zwiększa nasz stosunek sygnału do szumu (SNR), a także rozdzielczość przestrzenną, którą można osiągnąć za pomocą naszej platformy bezsoczewkowej.
   Jako alternatywę dla zwykłej płyty czołowej, możemy również wykorzystać w naszej platformie obrazowania na chipie "stożkową" światłowodową płytę czołową, która ma znacznie większą gęstość światłowodowych na górnej ścianie w porównaniu z dolną. Taka zwężająca się płyta czołowa nie tylko pomaga nam uzyskać lepszy PSF, ale także może wprowadzić powiększenie w naszej platformie (np. >2-3X), co dodatkowo pomaga nam poprawić rozdzielczość bezsoczewkową do np. <4 μm. Należy również zauważyć, że pole widzenia takiej stożkowej konstrukcji jest zmniejszone co najmniej o kwadrat wprowadzonego współczynnika powiększenia w porównaniu ze zwykłym systemem obrazowania opartym na płycie czołowej, co może stanowić zmniejszenie np. z ~8 cm² FOV początkowo (CCD: KAI-11002) do <2 cm² przy stożku.
   Na koniec powinniśmy również zauważyć, że zastosowanie światłowodowej płyty czołowej lub stożka zniekształca hologramy próbki bez soczewek ze względu na różne tryby optyczne matrycy światłowodowej³. Podczas gdy takie zniekształcone wzory bez soczewek w układzie detektorów mogą być nadal przydatne w niektórych zastosowaniach związanych z relacjami cytometrycznymi, do holograficznej rekonstrukcji obrazów transmisyjnych matryca światłowodowa (np. płyta czołowa lub stożek) musi zostać usunięta z zespołu na chipie kosztem nieznacznie zmniejszonej rozdzielczości przestrzennej w trybie fluorescencyjnym³.
4. Chipy mikroprzepływowe: Chipy mikroprzepływowe, które są używane w naszej platformie, są wytwarzane przy użyciu ścianek PDMS (Polydimethylsiloxane) umieszczonych na szklanych szkiełkach, tworząc mikrokanały potrzebne do obrazowania na chipie. Aby wytworzyć te kanały mikroprzepływowe, postępujemy zgodnie z następującym przepisem:
   1. Elastomery PDMS A i B są równomiernie mieszane i mieszane w stosunku objętościowym 1:10.
   2. Po przelaniu tego niejednorodnego roztworu na szalkę Petriego, utwardza się go w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
   3. Za pomocą noża X-acto z płytki Petriego wydobywa się wymagany rozmiar i kształt ścianki kanału mikroprzepływowego.
   4. Klejenie urządzenia odbywa się następnie za pomocą generatora plazmy wysokiej częstotliwości (Electro-Technic Products Inc., BD-10AS), który musi odsłonić zarówno szkiełka nakrywkowe, jak i obszar łączenia PDMS.
   5. Po tej obróbce plazmowej urządzenie umieszcza się w piekarniku na ~40-50 minut w temperaturze 70 °C w celu wzmocnienia wiązania.
5. Montaż i wyrównanie bezsoczewkowej platformy mikroskopii na chipie:
   Procedury montażu naszej platformy obrazowania on-chip bez soczewek można szczegółowo opisać w następujący sposób:
   1. Szkło osłonowe optoelektronicznego układu czujników jest usuwane.
   2. Za pomocą pióra próżniowego (Edmund Optics, NT57-636) cienki filtr absorpcyjny jest delikatnie umieszczany w górnej części obszaru aktywnego detektora.
   3. Na górze tego filtra absorpcyjnego umieszczona jest światłowodowa płyta czołowa lub stożek.
   4. Wyprodukowany chip mikroprzepływowy jest następnie umieszczany bezpośrednio na górze układu światłowodowego.
   5. Szklany pryzmat lub półkula są montowane nad chipem mikroprzepływowym za pomocą oleju dopasowującego indeks (Cargille, Immersion Oil 300 Series) w taki sposób, że współczynnik załamania światła granicy faz jest dopasowany do szklanego współczynnika załamania światła.
   6. Włókno oświetlenia bocznego jest przesuwane bliżej pryzmatu (lub półkuli), a jego kąt jest regulowany tak, aby zapewnić całkowite odbicie wewnętrzne na granicy faz szkło-powietrze odpowiadającej dolnemu podłożu chipa mikroprzepływowego. Oświetlenie pionowe (dla obrazowania transmisyjnego bez soczewek) jest ustawione tak, aby było prostopadłe do matrycy detektorów i wyśrodkowane do żądanego pola widzenia.
   7. Boczne i pionowe źródła światła są sekwencyjnie włączane/wyłączane, aby uzyskać zarówno obrazowanie fluorescencyjne, jak i obrazowanie transmisyjne w jasnym polu przy użyciu tej samej platformy w układzie scalonym.
   8. Surowe obrazy Lensfree są następnie rejestrowane za pomocą specjalnie opracowanego interfejsu Labview za pośrednictwem komputera (np. procesora 3,2 GHz, Intel Core).

2. Przygotowanie próbki

Użyliśmy mikrokulek fluorescencyjnych (np. Invitrogen, Fluospheres) do kalibracji naszej platformy obrazowania, mierząc jej funkcję punktowego rozproszenia (PSF) bez soczewek. Po wykonaniu wstępnego pomiaru PSF, różne komórki lub małe modele zwierząt (np. transgeniczne próbki C. elegans) mogą być obrazowane przy użyciu tej samej platformy na chipie.

Zaczynając od następnego podrozdziału, przedstawimy dalsze szczegóły dotyczące naszych etapów przygotowania próbki.

1. Mikrokulki fluorescencyjne:
   1. Surowe roztwory kulek fluorescencyjnych łączy się z wodą demineralizowaną w celu optymalizacji stężenia próbek.
   2. ~10 μl roztworu kulek fluorescencyjnych miesza się z 40 μl, 5 ml i 20 ml wody DI, aby uzyskać odpowiednio kulki o średnicy 10 μm, 4 μm i 2 μm. Heterogeniczne roztwory różnych kulek (np. niefluorescencyjne i fluorescencyjne) przygotowuje się w zależności od potrzeb, mieszając ze sobą różne roztwory kulek.
   3. Końcowy roztwór próbki jest następnie wstrzykiwany do chipa mikroprzepływowego z bocznych ścianek PDMS za pomocą ostrej igły strzykawkowej (Fisher Scientific, BD PrecisionGlide Needles, seria 14-826)
2. Oznaczanie białych krwinek:
   1. Objętość ~100 μl krwi pełnej miesza się z ~1 ml buforu lizującego czerwone krwinki (eBioscience).
   2. Po inkubacji przez ~3 min, lizowany roztwór krwi jest odwirowywany, a warstwa osadu jest ponownie zawieszana w ~200 μL PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
   3. Aby oznaczyć kwas nukleinowy komórek barwnikami fluorescencyjnymi, do 200 μl resuspension dodaje się 5 μL 1mM SYTO 16, po czym próbkę inkubuje się przez ~ 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
   4. Drugie odwirowanie stosuje się do tej znakowanej próbki, gdzie supernatant jest usuwany w celu zmniejszenia szumu tła spowodowanego emisją fluorescencyjną z niezwiązanych barwników.
   5. Warstwa osadów białych krwinek jest ponownie zawieszana w PBS, która może być następnie przeniesiona do mikroprzepływowego chipa w celu obrazowania fluorescencyjnego bez soczewek (patrz np. Ryc. 7).

3. Cyfrowe przetwarzanie uzyskanych bezsoczewkowych obrazów fluorescencyjnych

Na tej platformie obrazowania bezsoczewkowego, do cyfrowego zwiększania rozdzielczości systemu używane są dwa różne algorytmy, a mianowicie dekonwolucja Lucy-Richardson i dekodowanie oparte na kompresyjnym próbkowaniu. Korzystając z tych metod przetwarzania cyfrowego, określiliśmy ilościowo poprawę rozdzielczości, którą można osiągnąć przy każdym podejściu, rozwiązując ciasno upakowane pary koralików (patrz rys. 5-6). Zrekonstruowane obrazy fluorescencyjne bez soczewek mogą być następnie pseudokolorowane (w razie potrzeby) w celu podkreślenia naturalnego koloru mikroobiektów, co z pewnością wymaga wcześniejszej znajomości długości fali sygnału fluorescencyjnego, chyba że używany jest kolorowy (np. RGB: czerwono-zielono-niebieski CCD/CMOS) układ czujnika. W przypadku tych metod przetwarzania cyfrowego używane są niestandardowe algorytmy, które wymagają tylko procesora (np. procesora 3,2 GHz, Intel Core). Potencjalnie procesory graficzne (GPU) nowej generacji mogą być również wykorzystywane do szybszego przetwarzania. Oprócz obrazowania, w razie potrzeby, zdekodowane obiekty fluorescencyjne mogą być również automatycznie zliczane za pomocą specjalnie opracowanego interfejsu (patrz rys. 8) do zastosowań cytometrii na chipie.

1. Pomiar systemu z funkcją rozproszenia punktowego (PSF):
   Przed jakimkolwiek przetwarzaniem cyfrowym w celu poprawy rozdzielczości (takim jak dekonwolucja lub dekodowanie kompresyjne) należy oszacować niekoherentną funkcję rozproszenia punktowego systemu na chipie, co można osiągnąć poprzez uśrednienie kilku zmierzonych wzorów fluorescencyjnych bez soczewek utworzonych przez izolowane małe kulki fluorescencyjne umieszczone na określonej wysokości od chipa czujnika. Te indywidualne wzory fluorescencyjne są następnie wyrównywane względem ich współrzędnych środka masy, które mają być uśrednione po odpowiedniej normalizacji intensywności^1,2. Ten uśredniony wzór bez soczewek może być następnie wykorzystany jako funkcja fluorescencyjnego rozproszenia punktowego w naszym mikroskopie chipowym.
2. Dekonwolucja Lucy-Richardson¹: Aby cyfrowo poprawić rozdzielczość przestrzenną naszej platformy, wprowadzamy surowy uzyskany obraz fluorescencyjny i zmierzoną niespójną funkcję rozrzutu punktowego do przyspieszonego algorytmu Lucy-Richardson^8-10. Stosując twierdzenie Bayesa, algorytm Lucy'ego-Richardsona wykorzystuje zmierzoną funkcję rozpiętości punktowej do iteracyjnego udoskonalenia oszacowania maksymalnego prawdopodobieństwa rozkładu źródła fluorescencji na płaszczyźnie obiektu^8,9. Proces iteracji jest zwykle przerywany po kilkuset cyklach przed pojawieniem się wzmocnienia szumu, aby zapewnić minimalny błąd kwadratowy między wyświetlanymi a mierzonymi wzorami fluorescencyjnymi bez soczewek. Konwergencja tego algorytmu dekonwolucji została również przyspieszona przez metodę ekstrapolacji wektorowej w celu skrócenia czasu obliczeń¹⁰. Dla przykładu: algorytm ten zapewnia efektywną rozdzielczość przestrzenną ~20 μm (przy użyciu układu CCD/CMOS o rozmiarze piksela np. ~9μm) i może zdekonwolucjonizować pole widzenia ~ 8 cm² w ciągu kilkudziesięciu minut na zwykłym komputerze z zainstalowanym Matlabem¹. Zwróć uwagę, że ten sam czas obliczeń spada do zaledwie kilku sekund dla np. ~1mm² FOV, co jest porównywalne z FOV typowego obiektywu 10X.
3. Dekodowanie sygnału rzadkiego^oparte na kompresyjnym próbkowaniu/wykrywaniu 2: Dalszą poprawę rozdzielczości (do <4 μm)⁴ można osiągnąć dzięki zastosowaniu algorytmów dekodowania opartych na kompresyjnym wykrywaniu/próbkowaniu^11,12. Compressive Sampling/Sensing zapewnia niedawno pojawiające się ramy teoretyczne^13-15, które mają na celu odzyskanie rzadkiego sygnału ze znacznie mniejszej liczby próbek, niż jest to wymagane zgodnie z twierdzeniem o próbkowaniu. Podczas gdy ogólnie rzecz biorąc, odzyskiwanie sygnału z niedostatecznie próbkowanych pomiarów jest źle postawionym problemem, dla określonej klasy funkcji (a mianowicie dla funkcji rzadkich), dobrze znane twierdzenie o próbkowaniu i jego podstawa reprezentacji okazały się ostatnio dość nieefektywne pod względem liczby wymaganych pomiarów, tj. ten sam rzadki sygnał może być na ogół wyjątkowo odzyskany z bardzo niewielu próbek w porównaniu z klasyczną teorią próbkowania.
   Bezsoczewkowe obrazy fluorescencyjne rejestrowane przez nasz mikroskop wbudowany w układ scalony z natury spełniają ważne wymaganie dekodowania kompresyjnego: w przypadku zastosowań, które są przedmiotem tej pracy, takich jak cytometria fluorescencyjna o szerokim polu, analiza rzadkich komórek i wysokoprzepustowe obrazowanie mikromatrycowe, obiekty fluorescencyjne będące przedmiotem zainteresowania można uznać za już rzadkie. Dlatego w naszym bezsoczewkowym mikroskopie fluorescencyjnym dekodowanie rozkładu i względnej siły emiterów fluorescencyjnych znajdujących się na płaszczyźnie obiektu można modelować jako wielkoskalowy problem najmniejszych kwadratów l 1-regularyzowanych, który można rozwiązać za pomocą np. metody punktu wewnętrznego^2,12. Ten problem optymalizacyjny można matematycznie wyrazić jako:
   
   gdzie ||u||_k=(∑_iⁿ |u_i|^k )^(1/k) oraz ||u||_∞=max_i |u_i |. W związku z tym minimalizujemy l 1-regularyzowaną l_2-normę różnicy między zarejestrowanymi/zmierzonymi (y) a oszacowanymi (Ax) obrazami bez soczewek, gdzie x i A reprezentują odpowiednio rozkład źródłowy do dekodowania i matrycę pomiarową utworzoną przy użyciu eksperymentalnego PSF systemu. Używamy również funkcji ograniczenia, która wymusza, aby rozkład źródła na płaszczyźnie obiektu był nieujemny. Ten iteracyjny proces dekodowania kompresyjnego kończy się, gdy wartość funkcji kosztu osiągnie wstępnie określoną wartość tolerancji. Parametry regularyzacji (β) i tolerancji są ogólnymi funkcjami rzadkości obiektu i poziomu hałasu pomiaru i są optymalizowane w naszym systemie odpowiednio do ~βmax/10 i ~0,01.
   Opierając się na wyżej opisanym schemacie numerycznym, kompresyjne dekodowanie surowych obrazów fluorescencyjnych znacznie poprawia zdolność naszej platformy do rozpoznawania rzadkich obiektów i wykazuje szybkość przetwarzania porównywalną z dekonwolucją Lucy-Richardson². Oprócz obrazowania pojedynczej warstwy, obiekty fluorescencyjne znajdujące się na różnych głębokościach mogą być również dekodowane i oddzielane od siebie jednocześnie, uruchamiając ten sam algorytm przy użyciu wszystkich PSF odpowiadających różnym warstwom głębokości².
4. Pseudokolorowanie: Chociaż nie jest to fundamentalne ograniczenie, prezentowana platforma obrazowania na chipie wykorzystuje głównie monochromatyczne matryce czujników optoelektronicznych, które ogólnie zapewniają lepszy stosunek sygnału do szumu w obrazowaniu próbek biologicznych. W związku z tym surowe obrazy fluorescencyjne są pozyskiwane w formacie skali szarości, który nie zawiera rzeczywistych informacji o kolorach próbek. Można to złagodzić, stosując kolorowe chipy CCD/CMOS w naszej architekturze obrazowania bez soczewek, tak aby 3 kanały kolorów (czerwony, zielony i niebieski) były rejestrowane w każdym pomiarze fluorescencyjnym bez soczewek. Z drugiej strony, jeśli charakterystyka emisji barwnika do etykietowania jest już znana, surowe obrazy fluorescencyjne w skali szarości monochromatycznego układu czujnika i ich zdekodowane/zdekonwolucjonowane wersje mogą być również sztucznie konwertowane na obrazy kolorowe za pomocą algorytmu pseudokolorowania zaimplementowanego np. w MATLAB. W tym celu uzyskane obrazy w skali szarości można przekształcić w trójwymiarowe kostki danych, w których można zsyntetyzować dowolny kolor zainteresowania przy użyciu odpowiednich współczynników ważenia w każdym pseudokanale kostki danych. W wyniku tego przetwarzania monochromatyczne obrazy fluorescencyjne bez soczewek mogą być konwertowane (w razie potrzeby) na obrazy wielokanałowe, które dostarczają znanych informacji o kolorach danego obiektu fluorescencyjnego.
5. Automatyczne zliczanie komórek fluorescencyjnych: Do zastosowań cytometrycznych opracowaliśmy również specjalnie zaprojektowany interfejs użytkownika (patrz rys. 8), który może automatycznie zliczać obiekty/komórki fluorescencyjne na podstawie ich obrazów bez soczewek uzyskanych za pomocą naszej platformy mikroskopii chipowej. W tym celu początkowo do surowych obrazów bez soczewek stosuje się miękki próg, aby zawęzić potencjalne lokalizacje obiektów fluorescencyjnych. Następnie szereg funkcji (zwłaszcza regionprops) jest używany do pomiaru właściwości obrazu każdego podregionu zainteresowania, takich jak położenie, obszar, kształt i intensywność. Korzystając z tych danych obiektowych, obiekty binarne są klasyfikowane w podgrupy, takie jak komórki, martwe piksele, a także kurz lub automatyczna fluorescencja tła. Gdy końcowy wynik funkcji regionprops zostanie przefiltrowany tak, aby pokazywał tylko interesujące komórki, długość wynikowej tablicy struktur może być użyta do uzyskania liczby komórek w całym polu widzenia naszego bezsoczewkowego imagera na chipie.

4. Reprezentatywne wyniki:

Przegląd naszego zestawu jest pokazany na rysunku 1, z kilkoma elementami optycznymi, które są używane do jego montażu. Kluczowe cechy naszej platformy mikroskopii on-chip są wyjaśnione na rysunku 2, w tym wzbudzenie i detekcja fluorescencyjna, całkowite odbicie wewnętrzne, a także częściowo spójne oświetlenie dla holograficznego obrazowania transmisyjnego na tej samej platformie. Wyniki bezsoczewkowego obrazowania fluorescencyjnego na chipie heterogenicznej mieszaniny zawierającej różne mikrocząstki (4 μm zielone i 10 μm zielono-czerwone) przedstawiono na rysunkach 3-4. Porównanie dekonwolucji Lucy-Richardson i dekodowania opartego na kompresyjnym próbkowaniu/wykrywaniu przedstawiono na rysunku 5 w celu cyfrowego zwiększenia rozdzielczości surowych, bezsoczewkowych obrazów fluorescencyjnych. Rozdzielczość przestrzenna z możliwością dekodowania kompresyjnego (<4 μm) jest określona ilościowo na rysunku 6. Bezsoczewkowa mikroskopia na chipie znakowanych fluorescencyjnie białych krwinek jest zilustrowana na rycinie 7, która zawiera również obrazy porównawcze wykonane za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Wreszcie, nasz zautomatyzowany interfejs zliczania obiektów fluorescencyjnych jest pokazany na rysunku 8.

Rysunek 1. Przegląd naszego bezsoczewkowego zestawu do obrazowania na chipie jest pokazany z kilkoma komponentami optycznymi, które są używane do jego montażu.

Rysunek 2. Pokazano schemat ideowy wbudowanej platformy obrazowania fluorescencyjnego bez soczewek (zdjęcie po lewej). Wzbudzenie fluorescencji uzyskuje się przez boczną ścianę romboidalnego pryzmatu przy użyciu niespójnego źródła. Pokazano również eksperymentalną konfigurację naszej wbudowanej platformy obrazowania fluorescencyjnego (zdjęcie po prawej). Próbka krwi pełnej w chipie mikroprzepływowym (wymiary: 2,5 x 3,5 x 0,3 cm) została wzbudzona przez interfejs pryzmatu, gdzie do złożenia chipa i pryzmatu użyto oleju dopasowującego indeks. Po odrzuceniu światła wzbudzającego przez TIR i filtr barwny, tylko emisja fluorescencyjna z oznakowanych komórek krwi została zarejestrowana przez nasz chip czujnika CCD (KODAK 11002) przy polu widzenia ~2,5 x 3,5 cm.

Rysunek 3. Pokazano szerokokątne, bezsoczewkowe, fluorescencyjne obrazowanie na chipie mieszaniny zawierającej 4 μm i 10 μm zielonych cząstek fluorescencyjnych. Dla porównania dostępne są również obrazy obiektywów mikroskopowych 10X, które dobrze zgadzają się z naszymi bezsoczewkowymi obrazami fluorescencyjnymi.

Rysunek 4. Przedstawiono szerokokątne, bezsoczewkowe obrazowanie fluorescencyjne mieszaniny zawierającej 10 μm zielonych i 10 μm czerwonych cząstek fluorescencyjnych. Nasze bezsoczewkowe obrazy fluorescencyjne zapewniają przyzwoite dopasowanie do 10-krotnych obrazów obiektywów mikroskopowych tych samych próbek.

Rysunek 5. Przedstawiono porównanie wydajności algorytmów dekodowania opartych na dekonwolucji Lucy-Richardson (LR) i próbkowaniu kompresyjnym (CS) dla obrazowania różnych par kulek 10 μm. Górny rząd ilustruje surowe obrazy fluorescencyjne bez soczewek. Obrazy wstawkowe w górnym rzędzie pokazują porównania mikroskopowe tych samych cząstek, które zostały uzyskane za pomocą soczewki obiektywowej 10X. Środkowy wiersz przedstawia nasze wyniki dekodowania kompresyjnego, podczas gdy dolny wiersz ilustruje wyniki dekonwolucji Lucy-Richardson. d, d_CS i d_LR odnoszą się odpowiednio do odległości od środka do środka na obrazach mikroskopowych, obrazach bezsoczewkowych dekodowanych przez CS i obrazach bezsoczewkowych dekonwoluowanych LR.

Rysunek 6. Zilustrowano cyfrowe przetwarzanie bezsoczewkowych fluorescencyjnych obrazów surowych. Algorytm oparty na próbkowaniu kompresyjnym służy do osiągnięcia rozdzielczości przestrzennej <4 μm poprzez rozwiązywanie ciasno upakowanych par kulek o średnicy 2 μm. Wstawki pokazują również porównania obiektywów mikroskopowych 40X, które bardzo dobrze zgadzają się z zdekodowanymi obrazami fluorescencyjnymi. Tutaj d odnosi się do odległości od środka do środka na obrazach mikroskopowych, podczas gdy d_CS odnosi się do odległości od środka do środka w dekodowanych bezsoczewkowych obrazach fluorescencyjnych CS.

Rysunek 7. Zilustrowano bezsoczewkowe obrazowanie białych krwinek znakowanych fluorescencyjnie (SYTO 16). Surowe obrazy bez soczewek są szybko dekodowane za pomocą dekodera opartego na CS, który bardzo dobrze zgadza się z konwencjonalnym obrazem mikroskopowym tej samej próbki, który jest uzyskiwany za pomocą soczewki obiektywowej 10X.

Rysunek 8. Zilustrowano specjalnie zaprojektowany interfejs automatycznego zliczania obiektów fluorescencyjnych (w programie MATLAB).

Dyskusja

Zademonstrowaliśmy wbudowaną platformę mikroskopii fluorescencyjnej, która może osiągnąć np. rozdzielczość przestrzenną <4 μm w polu widzenia np. >0,6-8^cm2 bez użycia jakichkolwiek soczewek, skanowania mechanicznego lub cienkowarstwowych filtrów interferencyjnych. W tej technice, za pomocą światłowodowej płyty czołowej lub stożka, emisja fluorescencyjna z obiektów jest zbierana za pomocą zestawu kabli światłowodowych 2D, a następnie dostarczana do optoelektronicznego układu czujników, takiego jak chip CCD/CMOS...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD)	KODAK	KAF-8300
Urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD)	KODAK	KAF-11002
Urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD)	KODAK	KAF-39000
Komplementarny półprzewodnik metalowo-tlenkowy (CMOS)	Mikronowe	MT9T031C12STCD
Źródło światła LED dużej mocy	Thorlabs Inc.	M455L2-C2
Sterownik LED dużej mocy	Thorlabs Inc.	LEDD1B
Źródło światła LED sprzężone światłowodem	Mightex	FCS-0625-000
Pióro próżniowe	Edmund Scientific	NT57-636
2, 4, 10 i mu; m Fluospheres	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
RBS bufor do lizy 1X	eBioscience	00-4333
SYTO 16 odczynnik do znakowania	Invitrogen	S7578
Światłowodowa płyta czołowa	Edmund Scientific	NT55-142
Stożek światłowodowy	Edmund Scientific	NT55-134
Pryzmaty	Edmund Scientific	NT47-626, NT45-403
Filtry	Edmund Scientific	NT39-417
PDMS Elastomery	Dow Corning	Slygard 184