Bezosobnikowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie

Podsumowanie

Zaprezentowano bezsoczewkową platformę do fluorescencyjnej mikroskopii na chipie, która umożliwia obrazowanie obiektów fluorescencyjnych w bardzo szerokim polu widzenia, np. >0,6-8 cm2, z rozdzielczością <4μm, przy użyciu algorytmu dekodującego opartego na próbkowaniu kompresyjnym. Taka kompaktowa modalność obrazowania fluorescencyjnego na chipie z szerokim polem widzenia może być cenna w cytometrii wysokoprzepustowej, badaniach rzadkich komórek oraz analizach mikromacierzy.

Streszczenie

Obrazowanie bezsoczewkowe na chipie ma w ogólnym założeniu na celu zastąpienie dużych mikroskopów optycznych opartych na soczewkach prostszymi i bardziej kompaktowymi konstrukcjami, szczególnie w zastosowaniach do wysokoprzepustowych przesiewów. Ta rozwijająca się platforma technologiczna ma potencjał do wyeliminowania potrzeby stosowania dużych i/lub kosztownych komponentów optycznych dzięki nowym teoriom i algorytmom rekonstrukcji cyfrowej. W związku z tym prezentujemy tutaj metodę on-chip fluorescencyjnej mikroskopii, która może osiągnąć np. <4μm rozdzielczości przestrzennej przy ultraszerokim polu widzenia (FOV) o powierzchni >0,6-8 cm², bez użycia jakichkolwiek soczewek, skanowania mechanicznego czy interferencyjnych filtrów cienkowarstwowych. W tej technice wzbudzenie fluorescencyjne odbywa się poprzez pryzmat lub hemisferyczny interfejs szklany oświetlony niespójnym źródłem. Po oddziaływaniu z całą objętością obiektu, światło wzbudzające jest odrzucane przez proces całkownego wewnętrznego odbicia (TIR), który zachodzi na spodzie mikrofluidycznego chipa z próbką. Emisja fluorescencyjna z wzbudzonych obiektów jest następnie zbierana przez światłowodową płytkę czołową lub taper i dostarczana do optoelektronicznej matrycy czujników, takiej jak urządzenie ładunkowo-sprzężone (CCD). Dzięki zastosowaniu algorytmu dekodowania opartego na próbkowaniu kompresyjnym, pozyskane surowe obrazy fluorescencyjne próbki wykonane bez soczewek mogą być szybko przetwarzane w celu uzyskania np. rozdzielczości <4μm przy FOV o powierzchni >0,6-8 cm². Ponadto, pionowo ułożone mikrokanały oddzielone od siebie np. o 50-100 μm mogą być również skutecznie obrazowane przy użyciu tej samej bezsoczewkowej platformy mikroskopii on-chip, co dodatkowo zwiększa całkowitą przepustowość tej metody. Ta kompaktowa platforma do obrazowania fluorescencyjnego on-chip, wsparta szybkim dekoderem kompresyjnym, może być bardzo wartościowa w wysokoprzepustowej cytometrii, badaniach rzadkich komórek oraz analizach mikroarray.

Protokół

W tej sekcji omówimy metody eksperymentalne naszej bezsoczewkowej platformy do on-chip mikroskopii fluorescencyjnej^1-4. Aby zademonstrować możliwości tej techniki, przedstawimy wyniki obrazowania on-chip dla fluorescencyjnych mikrocząsteczek oraz znakowanych białych krwinek. Chociaż nie jest to tutaj omawiane, ta sama bezsoczewkowa platforma mikroskopii fluorescencyjnej może być również wykorzystana do obrazowania małych zwierząt modelowych, takich jak transgeniczne próbki C. elegans³.

1. Projekt platformy do obrazowania on-chip bezsoczewkowego

Nasza bezsoczewkowa platforma obrazowania na chipie składa się z kilku komponentów optycznych, w tym z matrycy czujnika cyfrowego (np. chipu CCD), niespójnego źródła oświetlenia, pryzmatu, filtra absorpcyjnego, czoła światłowodowego lub zwężki światłowodowej. Jak pokazano na Ryc. 1, komponenty te są zintegrowane z urządzeniami mikroprzepływowymi, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne dużej objętości próbki na chipie, bez użycia soczewek, skanerów mechanicznych czy cienkowarstwowych filtrów interferencyjnych.

1. Cyfrowa matryca detektorów: Nasza konfiguracja obrazowania bezsoczewkowego wykorzystuje optoelektroniczną matrycę detektorów do rejestracji emisji fluorescencyjnej z docelowych mikroobiektów. W tej platformie, do detekcji sygnału fluorescencji, można zastosować różne rodzaje matryc, takie jak detektory CCD (np. modele: KAF-830, KAI-102, KAF-390, wszystkie firmy KODAK) oraz detektory CMOS (dopełniony metal-tlenek-półprzewodnik, np. model: MT9T031C12STCD, firmy Micron Technologies). Kluczowe parametry tych matryc to rozmiar piksela (np. 5.4 μm, 9 μm, 6.8 μm i 3.2 μm odpowiednio dla KAF-830, KAI-102, KAF-390 i MT9T031C12STCD) oraz aktywny obszar obrazowania (np. 2.4 cm², 8 cm², 18 cm² i 32 mm² odpowiednio dla KAF-830, KAI-102, KAF-390 i MT9T031C12STCD). W przypadku bezsoczewkowego obrazowania na chipie, detektory CCD są zazwyczaj preferowane w celu uzyskania wyższej przepustowości (szerszy obszar aktywny) i lepszej czułości, natomiast detektory CMOS mogą być preferowane w konstrukcjach relatywnie tańszych i lżejszych (np. do zastosowań terenowych).
2. Źródła światła: W naszej platformie do wzbudzenia fluorescencji można wykorzystać niespójne źródło światła, np. prostą diodę emitującą światło (LED, np. Thorlabs, M45L2-C2 i LEDD1B). W układzie doświadczalnym przedstawionym na Rys. 1, wielomodowy kabel światłowodowy (Thorlabs, BFH37-100) o średnicy rdzenia 1 mm jest sprzęgany czołowo ze źródłem LED (bez użycia soczewek lub optyki sprzęgającej), a światło wzbudzające jest następnie dostarczane do objętości próbki poprzez otwór wylotowy tego włókna. W tym systemie wymagana moc wzbudzenia fluorescencji powinna wynosić około ~ 0.2- 5 mW dla pola widzenia (FOV) > 2-8 cm² na wylocie włókna oświetlającego; jednak diody LED powinny być zdolne do generowania mocy rzędu ~ 5mW-1W, ponieważ metoda sprzęgania czołowego wiąże się ze znacznymi stratami, co obniża moc wzbudzenia na wyjściu włókna. Aby uzyskać wzbudzenie różnych barwników, można również zastosować multipleksowanie diod LED o różnych kolorach za pomocą sprzęgacza światłowodowego.
   Oprócz fluorescencyjnego obrazowania na chipie, za pomocą tej platformy można również uzyskać bezsoczewkowe holograficzne obrazy transmisyjne tej samej próbki, wykorzystując pionowe źródło oświetlenia, jak pokazano na Rys. 2. W przeciwieństwie do włókna wzbudzającego fluorescencję, do akwizycji obrazu holograficznego stosuje się inny kabel światłowodowy o mniejszej średnicy rdzenia (np. ~50-40 μm), sprzęgany czołowo z innym źródłem LED (Mightex, FCS-0625-0). Światło tego pionowego oświetlenia, po opuszczeniu końca włókna, zaczyna nabywać częściową spójność przestrzenną w miarę rozchodzenia się w stronę próbki. Średnica tego obszaru spójności przestrzennej jest proporcjonalna do drogi, jaką pokonuje światło, i odwrotnie proporcjonalna do rozmiaru otworu wylotowego włókna. Dopóki ta średnica spójności przestrzennej w płaszczyźnie próbki jest większa niż rozmiar dyfrakcyjny każdej próbki w płaszczyźnie detektora, rozproszone światło z każdego obiektu może wiernie interferować ze światłem tła, tworząc bezsoczewkowy hologram w linii (in-line) próbki. Uzyskane w ten sposób bezsoczewkowe hologramy mogą być następnie szybko przetwarzane przy użyciu iteracyjnych metod odzyskiwania fazy w celu rekonstrukcji obrazu transmisyjnego w jasnym polu objętości próbki^5-7. Do oświetlenia holograficznego wybrano diodę LED o dłuższej fali (tj. ~625-70 nm), ponieważ filtry absorpcyjne stosowane do blokowania światła wzbudzającego są filtrami górnoprzepustowymi z typowymi długościami odcięcia np. 50-60nm, co pozwala na bezproblemową akwizycję transmisyjnych hologramów w linii.
3. Inne komponenty optyczne: W tej platformie fluorescencyjnej mikroskopii na chipie równolegle stosuje się dwie różne metody filtrowania wzbudzenia w celu uzyskania wymaganego tła ciemnego pola, jak pokazano na Rys. 2. Po pierwsze, do wytworzenia całkowitego wewnętrznego odbicia (dla światła wzbudzającego) na dolnej powierzchni chipu mikrofluidycznego, w którym znajdują się badane próbki, stosuje się szklany pryzmat (np. Edmund Optics, pryzmaty romboidalne lub Dove) lub szklaną półkulę. Równolegle stosowany jest tani filtr absorpcyjny (np. firmy Roscolux), aby usunąć słabo rozproszone światło wzbudzające, które nie ulega procesowi TIR. Po skutecznym odrzuceniu wzbudzenia za pomocą tych dwóch mechanizmów, w płaszczyźnie detektora rejestrowana jest jedynie emisja fluorescencyjna próbek. Należy zauważyć, że pewna część emitowanego sygnału fluorescencyjnego również ulega TIR na tym samym interfejsie. Ogranicza to jednak aperturę numeryczną detekcji w tym bezsoczewkowym podejściu do obrazowania na chipie do wartości ~1.0, tak że tylko promienie skośne powyżej tak wysokiej apertury numerycznej detekcji pozostają uwięzione w mikrochipie, podczas gdy reszta promieni fluorescencyjnych może nadal trafiać na obszar aktywny matrycy detektorów i być próbkowana przez jej piksele.
   Mimo tak dużej apertury numerycznej detekcji, surowe plamy fluorescencyjne w matrycy detektorów stają się dość szerokie (np. ~150-20 μm), ponieważ emisja fluorescencyjna nie jest kierunkowa i w związku z tym szybko rozbiega się. Aby zaprojektować i lepiej kontrolować przestrzenne rozprzestrzenianie się tego sygnału fluorescencyjnego w naszej bezsoczewkowej platformie, zastosowaliśmy płaski komponent optyczny, tj. płytkę czołową światłowodową (np. Edmund Optics, NT5-142), umieszczoną pomiędzy płaszczyzną obiektu a płaszczyzną detektora. Płytka czołowa światłowodowa składa się z dwuwymiarowej matrycy kabli światłowodowych, które przenoszą informacje o natężeniu światła z jednej strony urządzenia na drugą. Jej główną funkcją w naszym bezsoczewkowym układzie mikroskopii na chipie jest sprzęganie wolnoprzestrzennych modów emisji fluorescencyjnej z objętości próbki w prowadzone fale optyczne, które przemieszczają się bez rozpraszania przestrzennego wewnątrz każdego włókna, co może częściowo zwęzić bezsoczewkową funkcję rozproszenia punktu (PSF) między płaszczyzną obiektu a detektorem. Zwiększa to dodatkowo nasz stosunek sygnału do szumu (SNR), a także rozdzielczość przestrzenną, jaką można osiągnąć za pomocą naszej bezsoczewkowej platformy.
   Jako alternatywę dla zwykłej płytki czołowej, w naszej platformie obrazowania na chipie możemy również wykorzystać „zwężającą się” (tapered) płytkę czołową światłowodową, która ma znacznie większą gęstość kabli światłowodowych na górnej fasetce w porównaniu z dolną. Taka zwężająca się płytka nie tylko pomaga uzyskać lepszą PSF, ale może również wprowadzić powiększenie w naszej platformie (np. >2-3X), co pozwala dodatkowo poprawić naszą bezsoczewkową rozdzielczość aż do poziomu np. <4 μm. Należy również zauważyć, że pole widzenia takiej konstrukcji zwężającej się jest zredukowane co najmniej o kwadrat wprowadzonego czynnika powiększenia w porównaniu z systemem obrazowania opartym na zwykłej płytce czołowej, co może oznaczać redukcję np. z początkowego FOV ~8 cm² (CCD: KAI-102) do <2 cm² przy zastosowaniu zwężki.
   Na koniec należy zaznaczyć, że zastosowanie światłowodowej płytki czołowej lub zwężki zniekształca bezsoczewkowe hologramy próbki ze względu na różne mody optyczne matrycy światłowodowej³. Choć takie zniekształcone wzory bezsoczewkowe w matrycy detektora mogą być nadal użyteczne w niektórych zastosowaniach cytometrycznych, w celu holograficznej rekonstrukcji obrazów transmisyjnych matryca światłowodowa (np. płytka czołowa lub zwężka) musi zostać usunięta z zestawu na chipie, kosztem nieznacznie zmniejszonej rozdzielczości przestrzennej w trybie fluorescencyjnym³.
4. Chip mikrofluidyczny: Chipy mikrofluidyczne stosowane w naszej platformie są wytwarzane z wykorzystaniem ścianek z PDMS (polidimetylosiloksanu) umieszczonych na szklanych slajdach, co tworzy mikrokanały niezbędne do obrazowania na chipie. Do wykonania tych mikrokanałów mikrofluidycznych stosujemy następującą procedurę:
   1. Elastomery PDMS A i B są jednorodnie mieszane i mieszane w stosunku objętościowym 1:10.
   2. Po wlanym do szalki Petriego roztworze heterogennym, jest on utwardzany w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
   3. Za pomocą noża X-acto z szalki Petriego wycina się ściankę mikrokanału mikrofluidycznego o wymaganym rozmiarze i kształcie.
   4. Wiązanie urządzenia jest następnie realizowane za pomocą wysokoczęstotliwościowego generatora plazmy (Electro-Technic Products Inc., BD-10AS), który musi poddać działaniu plazmy zarówno szklane slajdy przykrywowe, jak i obszar wiązania PDMS.
   5. Po tej obróbce plazmowej urządzenie jest umieszczane w piekarniku na ~40-50 minut w temperaturze 70 °C w celu wzmocnienia wiązania.
5. Montaż i pozycjonowanie bezsoczewkowej platformy mikroskopii na chipie:
   Procedury montażu naszej bezsoczewkowej platformy obrazowania na chipie można szczegółowo opisać następująco:
   1. Szkło przykrywowe optoelektronicznej matrycy detektorów zostaje usunięte.
   2. Za pomocą pisaka próżniowego (Edmund Optics, NT57-636) cienki filtr absorpcyjny jest ostrożnie kładziony na górze aktywnego obszaru detektora.
   3. Światłowodowa płytka czołowa lub zwężka jest pozycjonowana na tym filtrze absorpcyjnym.
   4. Wykonany chip mikrofluidyczny jest następnie bezpośrednio kładziony na górze matrycy światłowodowej.
   5. Pryzmat szklany lub półkula jest montowana nad chipem mikrofluidycznym przy użyciu oleju dopasowującego współczynnik załamania (Cargille, Immersion Oil 30 Series), tak aby współczynnik załamania interfejsu był dopasowany do współczynnika załamania szkła.
   6. Boczne włókno oświetlające jest przesuwane bliżej pryzmatu (lub półkuli) i regulowany jest jego kąt, aby zapewnić wystąpienie całkowitego wewnętrznego odbicia na interfejsie szkło-powietrze odpowiadającym dolnemu podłożu chipu mikrofluidycznego. Oświetlenie pionowe (do bezsoczewkowego obrazowania transmisyjnego) jest ustawiane prostopadle do matrycy detektora i centrowane do pożądanego pola widzenia.
   7. Boczne i pionowe źródła światła są sekwencyjnie włączane/wyłączane, aby uzyskać zarówno obrazowanie fluorescencyjne, jak i obrazowanie transmisyjne w jasnym polu przy użyciu tej samej platformy na chipie.
   8. Surowe obrazy bezsoczewkowe są następnie rejestrowane za pomocą opracowanego specjalnie interfejsu Labview poprzez komputer PC (np. procesor 3.2 GHz, Intel Core).

2. Przygotowanie próbek

Do kalibracji naszej platformy obrazowania wykorzystaliśmy fluorescencyjne mikrokulki (np. Invitrogen, Fluospheres), mierząc funkcję rozsyłu punktowego (PSF) systemu bezsoczewkowego. Po przeprowadzeniu tej wstępnej pomiaru PSF można obrazować różne komórki lub małe zwierzęta modelowe (np. próbki transgenicznych C. elegans) przy użyciu tej samej platformy zintegrowanej w układzie.

W następnej podsekcji przedstawimy szczegółowe informacje dotyczące etapów przygotowania próbek.

1. Fluorescencyjne mikro-kuleczki:
   1. Surowe roztwory fluorescencyjnych kuleczek łączy się z wodą DI w celu optymalizacji stężenia próbek.
   2. ~10 μL roztworu fluorescencyjnych kuleczek miesza się z 40 μL, 5 mL i 20 mL wody DI odpowiednio dla kuleczek o średnicach 10 μm, 4 μm i 2 μm. Heterogeniczne roztwory z różnych kuleczek (np. niefluorescencyjnych i fluorescencyjnych) przygotowuje się w razie potrzeby, mieszcząc ze sobą różne roztwory kuleczek.
   3. Końcowy roztwór próbki jest następnie wstrzykiwany do chipa mikroprzepływowego przez boczne ścianki PDMS za pomocą ostrej igły strzykawki (Fisher Scientific, BD PrecisionGlide Needles, seria 14-826).
2. Znakowanie białych krwinek:
   1. Objętość ~10 μL krwi pełnej miesza się z ~1 mL buforu do lizy erytrocytów (eBioscience).
   2. Po inkubacji przez ~3 min roztwór lizowanej krwi poddaje się wirowaniu, a warstwę osadu resuspenduje się w ~20 μL PBS (buforze fosforanowym).
   3. W celu oznakowania kwasów nukleinowych komórek barwnikami fluorescencyjnymi do 200 μL resuspensji dodaje się 5 μL 1mM SYTO 16, po czym próbkę inkubuje się przez ~30 min w ciemności w temperaturze pokojowej.
   4. Próbkę oznakowaną poddaje się ponownemu wirowaniu, po czym usuwa się nadosad, aby zmniejszyć szum tła wynikający z emisji fluorescencyjnej niezwiązanych barwników.
   5. Warstwę osadu białych krwinek resuspenduje się w PBS, który można następnie przenieść na chip mikroprzepływowy do bezsoczewkowego obrazowania fluorescencyjnego na chipie (patrz np. Rysunek 7).

3. Cyfrowe przetwarzanie uzyskanych bezsoczewkowych obrazów fluorescencyjnych

W tej platformie obrazowania bezsoczewkowego zastosowano dwa różne algorytmy do cyfrowego zwiększania rozdzielczości systemu, a mianowicie dekonwolucję Lucy-Richardson oraz dekodowanie oparte na próbkowaniu kompresyjnym. Dzięki zastosowaniu tych metod przetwarzania cyfrowego określono stopień poprawy rozdzielczości możliwy do osiągnięcia przy każdym z tych podejść, rozdzielając gęsto upakowane pary kulek (patrz rys. 5-6). Zrekonstruowane bezsoczewkowe obrazy fluorescencyjne można następnie pseudokolorować (jeśli jest to pożądane), aby podkreślić naturalny kolor mikroobiektów, co wymaga uprzedniej wiedzy o długości fali sygnału fluorescencyjnego, chyba że zastosowano matrycę sensora koloru (np. RGB: czerwony-zielony-niebieski CCD/CMOS). W tych metodach przetwarzania cyfrowego wykorzystywane są autorskie algorytmy, które wymagają jedynie procesora CPU (np. procesora 3,2 GHz, Intel Core). Potencjalnie do szybszego przetwarzania można by również użyć jednostek przetwarzania graficznego (GPU) nowej generacji. Oprócz obrazowania, w razie potrzeby, zdekodowane obiekty fluorescencyjne mogą być również automatycznie zliczane za pomocą autorskiego interfejsu (patrz rys. 8) w zastosowaniach cytometrii na chipie.

1. Pomiar funkcji rozproszenia punktu (PSF) układu:
   Przed jakimkolwiek cyfrowym przetwarzaniem w celu poprawy rozdzielczości (takim jak dekonwolucja lub dekodowanie kompresyjne) należy oszacować niespójną funkcję rozproszenia punktu (PSF) systemu zintegrowanego w układzie. Można to osiągnąć poprzez uśrednienie kilku zmierzonych, bezsoczewkowych obrazów fluorescencyjnych, utworzonych przez odizolowane małe kuleczki fluorescencyjne znajdujące się na określonej wysokości nad chipem z sensorem. Poszczególne obrazy fluorescencyjne są następnie wyrównywane względem współrzędnych ich środka masy, a po odpowiedniej normalizacji intensywności poddawane są uśrednieniu.^1,2Ten uśredniony wzorzec bezsoczewkowy może być następnie wykorzystany jako fluorescencyjna funkcja rozmycia punktowego naszego mikroskopu w układzie scalonym.
2. Dekonwolucja Lucy-Richardsona¹: Aby cyfrowo poprawić rozdzielczość przestrzenną naszej platformy, surowy pozyskany obraz fluorescencyjny oraz zmierzoną niespójną funkcję rozmycia punktowego wprowadzamy do przyspieszonego algorytmu Lucy-Richardsona^8-10Stosując twierdzenie Bayesa, algorytm Lucy-Richardson wykorzystuje zmierzoną funkcję rozmycia punktu (PSF) do iteracyjnego ulepszania estymacji maksymalnej wiarygodności rozkładu źródła fluorescencji w płaszczyźnie obiektu.^8,9Proces iteracji kończy się zazwyczaj po kilkuset cyklach, przed wystąpieniem wzmocnienia szumu, aby zapewnić minimalny błąd średniokwadratowy między rzutowanymi a zmierzonymi bezobiektywowymi obrazami fluorescencji. Zbieżność tego algorytmu dekonwolucji została dodatkowo przyspieszona za pomocą metody ekstrapolacji wektorowej w celu skrócenia czasu obliczeń.¹⁰Aby zobrazować skalę: algorytm ten zapewnia efektywną rozdzielczość przestrzenną na poziomie ~20 μm (przy użyciu chipu CCD/CMOS o rozmiarze piksela np. ~9μm) i może przeprowadzić dekonwolucję pola widzenia (FOV) o rozmiarze ok. 8 cm² w ciągu kilkunastu minut na zwykłym komputerze osobistym z uruchomionym programem Matlab¹Należy zauważyć, że ten sam czas obliczeń spada do zaledwie kilku sekund np. dla ~1 mm² pole widzenia, które jest porównywalne z polem widzenia typowego obiektywu 10X.
3. Dekodowanie rzadkich sygnałów w oparciu o próbkowanie/wykrywanie kompresyjne²: Dalsza poprawa rozdzielczości (aż do <4 μm)⁴ można osiągnąć poprzez zastosowanie algorytmów dekodowania opartych na próbkowaniu kompresyjnym (Compressive Sensing/Sampling)^11,12Próbkowanie/wykrywanie kompresyjne (Compressive Sampling/Sensing) stanowi nowo powstujące ramy teoretyczne^13-15 które ma na celu odzyskanie rzadkiego sygnału z znacznie mniejszej liczby próbek, niż wymagają tego twierdzenia o próbkowaniu. Choć w ujęciu ogólnym odzyskiwanie sygnału z niedopróbkowanych pomiarów jest problemem źle postawionym, w przypadku specyficznej klasy funkcji (mianowicie funkcji rzadkich) wykazano niedawno, że znane twierdzenie o próbkowaniu oraz jego baza reprezentacji są dość nieefektywne pod względem wymaganej liczby pomiarów; innymi słowy, ten sam rzadki sygnał można zazwyczaj jednoznacznie odtworzyć z bardzo niewielu próbek w porównaniu z klasyczną teorią próbkowania.
   Obrazy fluorescencyjne bezsoczewkowe rejestrowane przez nasz mikroskop na chipie z natury spełniają ważny wymóg dekodowania kompresyjnego (Compressive Decoding): w przypadku zastosowań interesujących w niniejszej pracy, takich jak szerokopolowa cytometria fluorescencyjna, analiza rzadkich komórek i wysokoprzepustowe obrazowanie mikroarray, fluorescencyjne obiekty będące przedmiotem zainteresowania mogą być uznane za już rzadkie. W związku z tym, w naszym bezsoczewkowym mikroskopie fluorescencyjnym dekodowanie rozkładu i względnej intensywności emiterów fluorescencyjnych znajdujących się w płaszczyźnie obiektu może być modelowane jako wielkoskalowe l₁-Problem regularyzowanych najmniejszych kwadratów, który można rozwiązać np. za pomocą metody punktu wewnętrznego^2,12Problem optymalizacyjny ten można wyrazić matematycznie w następujący sposób:
   
   gdzie ||u||_k=(∑_iⁿ |u_i|^k )^(1/k) oraz ||u||_∞=maksymalny_i Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia._i | Zatem minimalizujemy l₁zregularizowany Proszę o podanie tekstu do tłumaczenia.₂-norma różnicy między zarejestrowaną/zmierzoną(y) oraz szacowane (Ax) obrazy bezsoczewkowe, w których Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. i A reprezentują odpowiednio rozkład źródła do dekodowania oraz macierz pomiarową utworzoną z wykorzystaniem eksperymentalnej PSF systemu. Stosujemy również funkcję ograniczenia, która wymusza nieujemność rozkładu źródła w płaszczyźnie obiektu. Ten iteracyjny proces dekodowania kompresyjnego kończy się w momencie, gdy wartość funkcji kosztu osiągnie wcześniej określoną wartość tolerancji. Parametry regularyzacji (β) i tolerancji są zazwyczaj funkcjami rzadkości obiektu oraz poziomu szumu pomiarowego i zostały zoptymalizowane w naszym systemie odpowiednio do wartości ~βmax/10 oraz ~0,01.
   W oparciu o przedstawiony powyżej schemat numeryczny, dekodowanie kompresyjne surowych obrazów fluorescencyjnych znacznie poprawia zdolność naszej platformy do rozdzielania rzadkich obiektów i wykazuje prędkość przetwarzania porównywalną z dekonwolucją Lucy-Richardsona.²Oprócz obrazowania pojedynczej warstwy, obiekty fluorescencyjne znajdujące się na różnych głębokościach mogą być jednocześnie dekodowane i rozdzielane poprzez uruchomienie tego samego algorytmu z wykorzystaniem wszystkich funkcji rozproszonych punktu (PSF) odpowiadających poszczególnym warstwom głębokości.².
4. Pseudokolorowanie: Choć nie jest to ograniczenie zasadnicze, zaprezentowana platforma obrazowania na chipie wykorzystuje głównie monochromatyczne matryce czujników optoelektronicznych, które ogólnie zapewniają lepszy stosunek sygnału do szumu podczas obrazowania próbek biologicznych. W związku z tym surowe obrazy fluorescencyjne są pozyskiwane w formacie skali szarości, który nie zawiera informacji o rzeczywistym kolorze próbek. Można by to zniwelować poprzez zastosowanie kolorowych chipów CCD/CMOS w naszej architekturze obrazowania bezsoczewkowego, tak aby podczas każdego bezsoczewkowego pomiaru fluorescencji pozyskiwano trzy kanały kolorystyczne (czerwony, zielony i niebieski). Z drugiej strony, jeśli charakterystyka emisji barwnika znakującego jest znana, surowe obrazy fluorescencyjne w skali szarości z monochromatycznego chipu czujnika oraz ich wersje zdekodowane/dekonwolucyjnie mogą zostać sztucznie przekształcone w obrazy kolorowe przy użyciu algorytmu pseudokolorowania zaimplementowanego np. w programie MATLAB. W tym celu pozyskane obrazy w skali szarości mogą zostać rozszerzone do trójwymiarowych kostek danych, w których dowolny interesujący kolor można zsyntetyzować, stosując odpowiednie wagi dla każdego pseudokanału kostki danych. W wyniku takiego przetwarzania monochromatyczne bezsoczewkowe obrazy fluorescencyjne mogą zostać (jeśli jest to pożądane) przekształcone w obrazy wielokanałowe, które dostarczają znanych informacji kolorystycznych o danym obiekcie fluorescencyjnym.
5. Zautomatyzowane liczenie komórek metodą fluorescencyjną: Do zastosowań w cytometrii opracowaliśmy również specjalnie zaprojektowany interfejs użytkownika (patrz rys. 8), który potrafi automatycznie zliczać obiekty/komórki fluorescencyjne na podstawie ich obrazów bezsoczewkowych, uzyskanych za pomocą naszej platformy mikroskopii on-chip. W tym celu w pierwszej kolejności do surowych obrazów bezsoczewkowych stosowany jest próg miękki (soft threshold), aby zawęzić potencjalne lokalizacje obiektów fluorescencyjnych. Następnie szereg funkcji (w szczególności regionprops) jest wykorzystywanych do pomiaru właściwości obrazu każdego podregionu zainteresowania, takich jak pozycja, powierzchnia, kształt i intensywność. Wykorzystując dane o obiektach, obiekty binarne są klasyfikowane na podgrupy, takie jak komórki, martwe piksele, a także kurz lub autofluorescencja tła. Gdy końcowy wynik regionprops Funkcja jest filtrowana w celu wyświetlenia wyłącznie interesujących nas komórek; długość wynikowej tablicy struktur może zostać wykorzystana do wyznaczenia liczby komórek w całym polu widzenia (FOV) naszego bezsoczewkowego obrazownika on-chip.

4. Reprezentatywne wyniki:

Przegląd naszej aparatury przedstawiono na Rysunku 1, wraz z kilkoma komponentami optycznymi wykorzystanymi w jej konstrukcji. Główne cechy naszej platformy mikroskopii on-chip wyjaśniono na Rysunku 2, w tym wzbudzanie i detekcję fluorescencji, całkowite wewnętrzne odbicie, a także oświetlenie częściowo koherentne do holograficznego obrazowania transmisyjnego na tej samej platformie. Wyniki bezsoczewkowego obrazowania fluorescencyjnego on-chip dla heterogenicznej mieszaniny zawierającej różne mikrocząsteczki (4 μm zielone i 10 μm zielone/czerwone) przedstawiono na Rysunkach 3-4. Porównanie dekonwolucji Lucy-Richardson oraz dekodowania opartego na próbkowaniu/wykrywaniu kompresyjnym (Compressive Sampling/Sensing) w celu cyfrowej poprawy rozdzielczości surowych, bezsoczewkowych obrazów fluorescencyjnych przedstawiono na Rysunku 5. Rozdzielczość przestrzenna (<4 μm) uzyskana dzięki dekodowaniu kompresyjnemu została określona ilościowo na Rysunku 6. Bezsoczewkowa mikroskopia on-chip fluorescencyjnie znakowanych białych krwinek zilustrowana jest na Rysunku 7, który zawiera również obrazy porównawcze wykonane za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Na koniec, na Rysunku 8 przedstawiono nasz zautomatyzowany interfejs do liczenia obiektów fluorescencyjnych.

Rycina 1. Przegląd naszego zestawu do bezsoczewkowego obrazowania na chipie przedstawiono wraz z kilkoma komponentami optycznymi wykorzystanymi w jego budowie.

Rycina 2. Przedstawiono schemat blokowy platformy do bezsoczewkowego obrazowania fluorescencyjnego na chipie (obraz po lewej). Wzbudzenie fluorescencji odbywa się poprzez boczną ściankę pryzmatu rombowego przy użyciu źródła niespójnego. Przedstawiono również układ doświadczalny naszej platformy do obrazowania fluorescencyjnego na chipie (obraz po prawej). Próbka krwi pełnej w chipie mikroprzepływowym (wymiary: 2,5 x 3,5 x 0,3 cm) była wzbudzana poprzez interfejs pryzmatu, gdzie do montażu chipu i pryzmatu użyto oleju dopasowującego współczynnik załamania. Po odfiltrowaniu światła wzbudzenia poprzez całkowite wewnętrzne odbicie (TIR) oraz filtr kolorystyczny, chip sensora CCD (KODAK 102) zarejestrował wyłącznie emisję fluorescencyjną z oznakowanych komórek krwi w polu widzenia (FOV) o rozmiarze ok. 2,5 x 3,5 cm.

Rysunek 3. Szerokokątowe bezsoczewkowe obrazowanie fluorescencyjne na układzie scalonym mieszaniny zawierającej 4 μm i 10 μm przedstawiono zielone fluorescencyjne cząstki. W celach porównawczych dołączono również obrazy wykonane z użyciem obiektywu mikroskopowego 10X, które wykazują wysoką zgodność z naszymi obrazami fluorescencyjnymi bez użycia soczewek.

Rysunek 4. Szerokopolowe bezsoczewkowe obrazowanie fluorescencyjne mieszaniny zawierającej 10 μm zielony i 10 μm zaprezentowano czerwone fluorescencyjne cząstki. Nasze bezsoczewkowe obrazy fluorescencyjne stanowią dobrą odpowiedź dla obrazów tych samych próbek wykonanych za pomocą obiektywu mikroskopowego 10X.

Rysunek 5. Przedstawiono porównanie wydajności algorytmów dekodowania opartych na dekonwolucji Lucy’ego-Richardson (LR) oraz próbkowaniu kompresyjnym (CS) w obrazowaniu różnych 10 μm pary kulek. Górny rząd przedstawia surowe obrazy fluorescencyjne bez użycia soczewki. Obrazy wstawkowe w górnym rzędzie ukazują porównania mikroskopowe tych samych cząsteczek, zarejestrowane przy użyciu obiektywu 10X. Środkowy rząd demonstruje wyniki naszego dekodowania kompresyjnego, natomiast dolny rząd przedstawia wyniki dekonwolucji Lucy-Richardson. d, d_CS, oraz d_LR odnoszą się odpowiednio do odległości od środka do środka na obrazach mikroskopowych, obrazach bezsoczewkowych zdekodowanych metodą CS oraz obrazach bezsoczewkowych odszumionych metodą LR.

Rysunek 6. Przedstawiono cyfrowe przetwarzanie surowych obrazów fluorescencyjnych uzyskanych bez użycia soczewek. Aby osiągnąć ten cel, zastosowano algorytm oparty na próbkowaniu kompresyjnym. <4 μm rozdzielczość przestrzenna poprzez rozróżnianie gęsto upakowanych 2 μm pary kulek o danej średnicy. Wstawki przedstawiają również porównania wykonane przy użyciu obiektywu mikroskopowego 40X, które są bardzo zgodne zdekodowanymi obrazami fluorescencyjnymi. W tym przypadku d odnosi się do odległości mierzonych od środka do środka na obrazach mikroskopowych, podczas gdy d_CS odnosi się do odległości od środka do środka w zdekodowanych za pomocą CS obrazach fluorescencyjnych uzyskanych bez użycia soczewki.

Rysunek 7. Przedstawiono obrazowanie bezużyciem soczewek białych krwinek znakowanych fluorescencyjnie (SYTO 16). Surowe obrazy bezsoczewkowe są szybko dekodowane przy użyciu dekodera opartego na CS, co wykazuje bardzo wysoką zgodność z konwencjonalnym obrazem mikroskopowym tej samej próbki, wykonanym przy użyciu obiektywu 10X.

Rycina 8. Przedstawiono zaprojektowany na zamówienie zautomatyzowany interfejs do liczenia obiektów fluorescencyjnych (w programie MATLAB).

Dyskusja

Zaprezentowaliśmy zintegrowaną platformę mikroskopii fluorescencyjnej, która pozwala na uzyskanie np. rozdzielczości przestrzennej <4μm w polu widzenia o powierzchni np. >0,6-8 cm² bez użycia soczewek, skanowania mechanicznego czy cienkowarstwowych filtrów interferencyjnych. W tej technice, przy użyciu światłowodowej płytki czołowej lub stożka, emisja fluorescencyjna z obiektów jest zbierana przez dwuwymiarową macierz kabli światłowodowych, a następnie przekazywana do optoelektronicznej macierzy sensorów...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Urządzenie ładunkowe (CCD)	KODAK	KAF-8300
Urządzenie ładunkowe (CCD)	KODAK	KAF-11002
Urządzenie ładunkowe (CCD)	KODAK	KAF-39000
Krzemowy układ CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor)	Micron	MT9T031C12STCD
Wysokiej mocy źródło światła LED	Thorlabs Inc.	M455L2-C2
Sterownik wysokiej mocy LED	Thorlabs Inc.	LEDD1B
Źródło światła LED sprzężone światłowodowo	Mightex	FCS-0625-000
Przenośnik próżniowy	Edmund Scientific	NT57-636
Fluosfery 2, 4, 10 μm	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
Bufor do lizy RBS 1X	eBioscience	00-4333
Odczynnik znakujący SYTO 16	Invitrogen	S7578
Światłowodowa płyta czołowa	Edmund Scientific	NT55-142
Światłowodowy stożek	Edmund Scientific	NT55-134
Pryzmaty	Edmund Scientific	NT47-626, NT45-403
Filtry	Edmund Scientific	NT39-417
Elastomery PDMS	Dow Corning	Slygard 184