Izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Podsumowanie

W niniejszym protokole opisujemy sekcję łożysk myszy w 10,5 dniu ciąży, a następnie izolację komórek trofoblastycznych z wykorzystaniem gradientu Percoll. Następnie demonstrujemy zastosowanie wyizolowanych komórek w teście inwazji na Matrigelu.

Streszczenie

Łożeka odpowiada za transport składników odżywczych, gazów i czynników wzrostu do płodu, a także za usuwanie produktów przemiany materii. W związku z tym wady rozwoju łożyska mają istotne konsekwencje dla płodu i matki oraz stanowią główną przyczynę śmiertelności zarodkowej. Głównym typem komórek płodowej części łożyska jest trofoblast. Pierwotne komórki trofoblastu łożyska myszy są użytecznym narzędziem do badania prawidłowego i nieprawidłowego rozwoju łożyska i, w przeciwieństwie do linii komórkowych, mogą być izolowane i wykorzystywane do badania trofoblastu na określonych etapach ciąży. Ponadto pierwotne hodowle trofoblastu z myszy transgenicznych mogą być stosowane do badania roli konkretnych genów w komórkach łożyska. Przedstawiony tutaj protokół opiera się na opisie Thordarsona et al.¹, w którym zastosowano gradient Percoll w celu uzyskania względnie czystej populacji komórek trofoblastu z wyizolowanych łożysk myszy. Jest on podobny do częściej stosowanych metod izolacji komórek trofoblastu człowieka^2-3. Czystość można ocenić za pomocą barwienia immunocytochemicznego wyizolowanych komórek na cytokeratynę 7⁴. Następnie wyizolowane komórki poddaje się analizie za pomocą testu inwazji w matrigelu w celu oceny inwazyjności trofoblastu in vitro^5-6. Komórki, które dokonały inwazji, są analizowane immunocytochemicznie i barwione w celu ich policzenia.

Protokół

1. Disekcja łożyska myszy

1. Przygotuj pary myszy do kojarzenia.
2. W kolejnych dniach sprawdzaj obecność czopa kopulacyjnego. Dzień, w którym wykryto czop, uznaje się za 0,5 dnia po kopulacji (dpc)⁷.
3. Łożek można pobierać na pożądanym etapie ciąży; czysta dyssekcja łożyska jest możliwa począwszy od rozwoju dojrzałego łożyska w dniu 10,5. W niniejszej procedurze demonstrujemy etap 14,5 dpc. Przy podanych objętościach, 40-60 łożysk w 10,5 dpc oraz 10-20 łożysk w 14,5 dpc zapewnią wyraźnie widoczną warstwę komórek trofoblastu.
4. Uśmierć ciężarną mysz i usuń macicę, przecinając ją w obrębie szyjki oraz wzdłuż mesometrium.
5. Za pomocą ostrych nożyczek przetnij tkankę pomiędzy poszczególnymi produktami poczęcia (Rycina 1A).
6. Używając dwóch par pęset, uchwyć ścianę macicy na krawędzi cięcia i rozdziel ją, usuwając mięsień macicy (myometrium) (Rycina 1B). Zaleca się użycie jednej pary pęset ząbkowanych, średnio precyzyjnych (zakrzywionych lub prostych) oraz jednej pary pęset bardzo precyzyjnych (np. nr 5).
7. Naprzeciwko łożyska otwórz deciduę za pomocą pęsety lub nożyczek, odsłaniając łożysko. Trzymając tkankę macicy jedną pęsetą, przesuń drugą pęsetą pod łożysko, aby je oddzielić (Rycina 1C). W razie potrzeby oddziel płód i błony płodowe od łożyska. Nie jest możliwe usunięcie całej tkanki deciduy poprzez dyssekcję bez utraty części tkanki łożyskowej, jednak dodatkową tkankę deciduy (bladą) można usunąć z powierzchni łożyska, delikatnie zdejmując ją pęsetą. W celu dalszego oczyszczania zastosujemy gradient Percoll.
8. Każde wypreparowane łożysko umieść w 25 ml schłodzonego do temperatury lodu buforu do dysocjacji w probówce stożkowej o pojemności 50 ml, aż wszystkie dyssekcje zostaną zakończone. W późniejszych etapach, przed przeniesieniem do buforu do dysocjacji, grubo posiekaj tkankę łożyskową nożyczkami lub żyletką.

2. Izolacja trofoblastów

1. Luźno zakręć probówkę stożkową i umieść ją w kąpieli w temperaturze 37°C na 45-60 minut. Energicznie mieszaj roztwór dysocjujący, pipetując go w przybliżeniu co 10 min. Całkowity czas trawienia należy ściśle monitorować; osiągnięcie optymalnej odzyskiwalności komórek prawdopodobnie będzie wymagało kilku prób. Tkanki powinny być możliwe do przepuszczenia przez pipetę 10 ml, jednak widoczne będą pozostałości fragmentów tkanek. Nadmierne trawienie spowoduje niską przeżywalność komórek i niską wydajność wysiewania. Optymalna przeżywalność i wydajność wysiewania występuje, gdy obecne są skupiska kilku komórek, a nie w przypadku osiągnięcia całkowitej dysocjacji. Z kolei niewystarczające trawienie doprowadzi do zmniejszonej czystości po separacji w Percollu. Po osiągnięciu odpowiedniego stopnia trawienia umieść probówkę na lodzie, aby zatrzymać aktywność kolagenazy.
2. Przepuść roztwór przez sitko komórkowe, aby usunąć nietrawione materiały, a następnie wiruj przy 50 x g przez 5 minut.
3. W celu przemycia usuń supernatant i resuspenduj komórki w 10 ml roztworu do przemywania. Wiruj przy 50 x g przez 5 minut.
4. Podczas wirowania przygotuj roztwór Percollu, mieszając 9,6 ml Percollu, 13,4 ml roztworu do przemywania oraz 1,1 ml 10x medium 19 w probówce 50 ml odpowiedniej do wirowania przy wysokich prędkościach.
5. Usuń supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 2 mL roztworu do przemywania.
6. Dodaj komórki do roztworu Percollu i wiruj przy 30 0 x g przez 30 minut w temperaturze 4°C.
7. Wyjmij probówkę z wirówki, nie naruszając gradientu. Aby zwizualizować gradient, ustaw probówkę przed jasnym źródłem światła. Zlokalizuj prążek trofoblastu (Rysunek 2) i odessać go pipetą, uważając, aby nie naruszyć znajdującego się poniżej prążka erytrocytów. Objętość prążka trofoblastu będzie wynosić 5-8 ml.
8. Przenieś komórki trofoblastu do probówki stożkowej 50 ml. Dodaj roztwór do przemywania do uzyskania całkowitej objętości 45 ml.
9. Wiruj przy 50 x g przez 5 minut. Usuń supernatant i resuspenduj w medium hodowlanym (NCTC-135). Komórki można hodować na cienkiej warstwie Matrigelu lub na plastiku do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i 5% CO₂. W dniu 10,5 każda łożysko daje około 50 00 żywych komórek, z czego 80-90% jest cytokeratyna-dodatnich.

3. Test inwazji trofoblastycznej

1. Do każdej komory z matrigelem dodać 1-2 ml pożywki hodowlanej (NCTC-135) i inkubować w temperaturze 37°, przy 5% CO₂ przez 30-90 min.
2. Usunąć pożywkę i do górnej komory dodać 1,5 ml x 10⁵ świeżo wyizolowanych komórek w 2 ml pożywki. Do dolnej komory dodać 1 ml pożywki, aby przykryć dolną powierzchnię membrany.
3. Hodować komórki w insertach przez 18-24 godziny.
4. Zeskrobać komórki i matrigel z insertu za pomocą tamponu z pianki.
5. Przepłukać górną i dolną część komory w 2 ml PBS.
6. Utrwalić przez 5 min w 1 ml 4% paraformaldehydu w PBS.
7. Przebarwić, wypełniając dolną komorę 40 μl DAPI (30nM) i inkubując przez 30 min.
8. Przemyć krótko trzy razy w PBS.
9. Usunąć membrany z insertów za pomocą ostrego ostrza skalpela.
10. Na szkiełko nanieść kroplę 10 μl medium montażowego (50% glicerolu w PBS). Za pomocą pęsety położyć membranę na kropli. Dodać kolejną kroplę 10 μl medium, a następnie ostrożnie przykryć szkiełkiem nakrywką.
11. Wykonanie fotografii i przeliczenie komórek. Należy pamiętać o odpowiednim zorientowaniu membrany (stroną z komórkami do góry lub do dołu) w zależności od używanego mikroskopu. Oprogramowanie Image J (National Institutes of Health) zawiera funkcję ręcznego liczenia, która może być wykorzystana w tym celu, podobnie jak Adobe Photoshop lub licznik ręczny.

4. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Disekcja łożyska myszy. (a) Macicę usuwa się poprzez przecięcie wzdłuż jajowodów (żółte), wzdłuż powierzchni mezometrialnej oraz w obrębie szyjki macicy (na dole). Poszczególne konceptusy można następnie oddzielić, przecinając je nożyczkami w sposób przedstawiony na schemacie. (b) Ścianę macicy usuwa się, umieszczając dwie pęsety w przeciętej powierzchni macicy i rozdzierając ją wzdłuż strony antymezometrialnej, blisko płodu i z dala od łożyska. (c) Następnie izoluje się łożysko, chwytając je pęsetą i wsuwając drugą pęsetę pomiędzy łożysko a tkankę macicy. Pępowinę oraz pozostałe błony pozazarodkowe można następnie oddzielić od łożyska.

Rysunek 2. Separacja komórek trofoblastu metodą Percoll. Po wirowaniu widoczne będą trzy główne pasma, zgodnie z przedstawionym po lewej stronie schematem i zdjęciem po prawej stronie. Górne pasmo, najbardziej wyraźne, zawiera debris komórkowy oraz fibroblasty. Tuż poniżej rozproszonego pasma trofoblastu widoczne będzie wąskie (czerwone) pasmo zawierające erytrocyty. W paśmie trofoblastu prawdopodobnie pojawią się agregaty komórkowe, takie jak dwa widoczne bezpośrednio po lewej stronie strzałki na zdjęciu.

Rysunek 3. Inwazyjne komórki trofoblastyczne (biała strzałka) przejdą przez warstwę matrigelu oraz pory membrany, pojawiając się na jej dolnej powierzchni. Widoczne są również pory (czarna grot strzałki). Można policzyć liczbę komórek na całej powierzchni membrany lub na reprezentatywnym obszarze próbkowym. Obraz w skali szarości z fluorescencyjnym barwieniem jąder DAPI został odwrócony w celu poprawy wizualizacji komórek.

Rycina 4.Komórki trofoblastyczne można zidentyfikować, a czystość wyizolowanej populacji ocenić za pomocą immunobarwienia na cytokeratynę 7 (środek, magenta). Komórki przeciwbarwiono DAPI (góra, niebieski). Obraz złożony, dół.

Dyskusja

W tym filmie prezentujemy izolację trofoblastów z łożyska myszy. Następnie przedstawiamy test in vitro inwazji trofoblastów. Dzięki zastosowaniu tej procedury można uzyskać w dużej mierze, choć nie całkowicie, czystą populację komórek trofoblastycznych. Jeśli wymagana jest większa czystość, można przeprowadzić separację za pomocą kulek magnetycznych lub cytometrię przepływową, zgodnie z opisem dla pierwotnych ludzkich trofoblastów. Odpowiedni czas etapu dysocjacji kolagenazą musi być określony przy każdym eksperymencie i...