Technika spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera do badania samoorganizacji peptydów

Streszczenie

Źródło: Neves, R., et al. Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje samoorganizację peptydów amyloidowych w bogatą w warstwy beta strukturę supramolekularną za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera. Wiązka podczerwieni jest przepuszczana przez kryształ o wysokim współczynniku załamania światła i rejestrowana jest absorpcja energii przez granicę kryształu i próbki. Drugorzędowe struktury białek próbki są identyfikowane poprzez analizę ich charakterystycznych pików absorpcji w określonych regionach widma podczerwonego, co pomaga w identyfikacji tworzenia się zespołu supramolekularnego.

Protokół

1. Charakterystyka supramolekularnych struktur samoorganizujących się

1. Powstawanie włókien amyloidowych
   1. Aby przygotować roztwór do samodzielnego organizowania, odważyć 1 mg proszku peptydowego za pomocą wagi analitycznej. Rozpuścić w mieszaninie (pH 7,5) 20% acetonitrylu i 10 mM (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego kwasu (HEPES) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, do końcowego stężenia 1 mg/ml mieszaniny zespołu peptydów. Zmieszaj roztwór montażowy i pozostaw go do złożenia w temperaturze pokojowej.
2. Charakterystyka spektroskopowa włókien amyloidowych
   1. Śledź proces składania peptydów za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) co kilka dni. Szeroki pik wyśrodkowany około 1670 ^cm-1 to sygnatura IR powstająca z niezmontowanych peptydów w próbce. Próbki składania peptydów zwykle potrzebują od jednego do dwóch tygodni, aby szeroki, niezłożony pik zniknął i osiągnął dojrzałość.
      1. Wysuszyć podwielokrotność 8-10 μl roztworu montażowego w postaci cienkiej warstwy na krysztale diamentu ATR. Monitoruj zanikanie dużego i szerokiego szczytu wody od 1640 do 1630 ^cm-1 w miarę tworzenia się suchego filmu.
      2. Pobieraj widma podczerwieni z zakresu 1500-1800 ^cm-1, wykonując średnio 50 skanów z rozdzielczością 2 ^cm-1. Pobieraj i odejmuj skany w tle przed każdym skanowaniem próbki. Sygnatura IR dla montażu β arkuszy to ostry szczyt między 1625 a 1635 ^cm-1 (rysunek 1A).

Wyniki

Rysunek 1. Supramolekularna charakterystyka peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem. (A) FT-IR z 1 mg/ml włókien 1,2-ditiolan-KLVFFAQ-NH₂ połączonych w 10 mM HEPES, pH 7,5 w 20%_CH3CN. Szczyt na wysokości 1627 ^cm-1 jest zgodny z peptydami...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetonitryl	Fisher Scientific	A998-4	Łatwopalny; działa drażniąco na oczy; Stosować środki ochrony osobistej; Używać tylko pod wyciągiem; Przechowywać z dala od otwartego ognia lub gorących powierzchni; W przypadku kontaktu płukać wodą przez co najmniej 15 minut i zasięgnąć porady lekarza
kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy	Acros Organics	AC172571000	Nie wdychać; używać na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu
Spektrometr podczerwieni z transformacją Fouriera	Alpha Tensor, Bruker