Zastosowanie mysiego testu pętli jelitowej z łatką Peyera w celu oceny wychwytu bakterii przez limfocyty M

Summary

M komórek w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z pęcherzykami pokrywającymi plamy Peyera odgrywają ważną rolę w immunonadzorze błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. Tutaj opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez limfocyty M in vivo. Ta metoda zapewnia metodę zrozumienia funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Abstract

Wnętrze naszego jelita jest zamieszkane przez ogromną liczbę bakterii komensalnych. Powierzchnia błony śluzowej przewodu pokarmowego jest stale narażona na ich działanie, a czasami na patogeny. Tkanka limfatyczna związana z jelitami (GALT) odgrywa kluczową rolę w indukcji odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej na te drobnoustroje^{1, 2}. Aby zainicjować odpowiedź immunologiczną błony śluzowej, antygeny błony śluzowej muszą zostać przetransportowane ze światła jelita przez barierę nabłonkową do zorganizowanych pęcherzyków limfatycznych, takich jak plastry Peyera. W tej transcytozie antygenowej pośredniczą wyspecjalizowane nabłonkowe komórki M^{3, 4}. Komórki M to atypowe komórki nabłonkowe, które aktywnie fagocytozują makrocząsteczki i drobnoustroje. W przeciwieństwie do komórek dendrytycznych (DC) i makrofagów, które kierują antygeny do lizosomów w celu degradacji, komórki M głównie transcytozują zinternalizowane antygeny. Ta energiczna transcytoza makromolekularna przez komórki M dostarcza antygen do leżących pod spodem zorganizowanych pęcherzyków limfoidalnych i uważa się, że jest niezbędna do zainicjowania specyficznych dla antygenu odpowiedzi immunologicznych błony śluzowej. Jednak mechanizmy molekularne promujące ten wychwyt antygenu przez komórki M są w dużej mierze nieznane. Wcześniej informowaliśmy, że glikoproteina 2 (Gp2), specyficznie ulegająca ekspresji na wierzchołkowej błonie plazmatycznej komórek M wśród enterocytów, służy jako receptor transcytotyczny dla podzbioru enterobakterii komensalnych i patogennych, w tym Escherichia coli i Salmonella enterica serowar Typhimurium (S. Typhimurium), poprzez rozpoznawanie FimH, składnika pilusów typu I na zewnętrznej błonie bakteryjnej ⁵. W tym miejscu przedstawiamy metodę zastosowania mysiego testu pętli jelitowej z łatą Peyera w celu oceny wychwytu bakteryjnego przez limfocyty M. Metoda ta jest ulepszoną wersją testu pętli jelitowej myszy opisanego wcześniej ^{6, 7}. Poprawione punkty są następujące: 1. Izofluran był stosowany jako środek znieczulający. 2. Założono około 1 cm podwiązaną pętlę jelitową wraz z plastrem Peyera. 3. Bakterie pobrane przez komórki M znakowano fluorescencyjnie za pomocą odczynnika do znakowania fluorescencji lub przez nadekspresję białka fluorescencyjnego, takiego jak białko zielonej fluorescencji (GFP). 4. Limfocyty M w nabłonku związanym z pęcherzykami pokrywającym plaster Peyera wykryto za pomocą barwienia immunologicznego całej góry z przeciwciałem anty Gp2. 5. Fluorescencyjną transcytozę bakteryjną przez komórki M obserwowano za pomocą konfokalnej analizy mikroskopowej. Test pętli jelitowej z łatą Peyera u myszy może dostarczyć odpowiedzi, jakiego rodzaju bakterie komensalne lub chorobotwórcze są transcytozowane przez komórki M i może doprowadzić nas do zrozumienia molekularnego mechanizmu stymulacji układu odpornościowego błony śluzowej przez komórki M.

Protocol

1. Przygotowanie komórek bakteryjnych

1. Bakterie fluorescencyjne zawierające glicerol (takie jak GFP wykazujące ekspresję S. Typhimurium) na LB płytce agarowej zawierającej 100 μg/ml ampicyliny.
2. Hodować pojedynczą kolonię z agaru LB przez noc w 2 ml nowej pożywki LB.
3. Dodać 0,5 ml kultury bakteryjnej do 4,5 ml nowej pożywki LB i inkubować aż do osiągnięcia gęstości optycznej 1,0 przy długości fali 600 nm.
4. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie (3 000 x g, 5 min, 4°C).
5. Odrzucić sklarowany osad i przemyć go dwukrotnie 5,0 ml sterylnego buforu fosforanowego z solą fizjologiczną (PBS).
6. Zawiesić osad bakteryjny za pomocą 5 ml PBS i użyć 50 μl zawiesiny zawierającej około 10⁷ jednostek tworzących kolonie (CFU) jako inokulum.
7. W przypadku stosowania bakterii znakowanych fluorescencyjnie, komórki bakteryjne znakowano odczynnikiem do znakowania fluorescencyjnego zgodnie ze standardowym protokołem.

2. Znieczulenie

1. Napełnij małe plastikowe pudełko (10 x 10 x 5 cm) 5% (v/v) odparowanego izofluranu zmieszanego z powietrzem (przepływ: 200 ml/min).
2. Znieczul osiem do szesnastu słabych starych samców lub samic myszy w pudełku.
3. Po znieczuleniu przenieś myszy na stół autopsyjny.
4. Myszy należy w sposób ciągły znieczulać 2% (v/v) odparowanym izofluranem zmieszanym z powietrzem (szybkość przepływu: 200 ml/min) (ryc. 1). Jest to procedura terminalna.

3. Test pętli płatkowej ligated Peyera

1. Naciąć 1 cm skóry brzucha, a następnie przeciąć otrzewną brzuszną znieczulonej myszy i wyjąć jelito cienkie zawierające plaster Peyera.
2. Podwiązuj jelito przędzą do szycia, uważając, aby uniknąć naczyń krwionośnych. Uwaga: zwiąż tylko jedną stronę jelita, a drugą pozostaw luźną.
3. Wstrzyknąć 50 μl zawiesiny bakteryjnej lub PBS (kontrola) za pomocą strzykawki do związanej pętli plastra Peyera po luźnej stronie jelita (ryc. 2).
4. Zwiąż luźną stronę i zamknij brzuch myszy klipsem.
5. Po 1 godzinie usuń podwiązaną pętlę plastra Peyera i poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
6. Wytnij naszywkę Peyera z podwiązanej pętli łaty Peyera.
7. Flashowanie wierzchołkowej strony plastra Peyera za pomocą 1 ml PBS za pomocą strzykawki przymocowanej do igły w celu usunięcia nadmiaru płynu śluzówkowego i bakterii. naszywka Peyera dodatkowo dwa razy.

4. Barwienie całego mocowania i konfokalna analiza mikroskopowa łaty Peyera

1. Utrwalić plaster Peyera w roztworze BD Cytofix/Cytoperm na lodzie przez 1 godzinę.
2. Przemyj plaster Peyera trzykrotnie 1 ml buforu BD Perm/Wash przez 5 minut, a następnie zablokuj 1 ml buforu blokującego zawierającego 0,1% (w/v) saponiny, 0,2% (w/v) BSA w PBS przez 30 min na lodzie.
3. Dodać 200-krotnie rozcieńczone przeciwciało monoklonalne anty-mysie GP2 (5 μg/ml) do próbki w celu wykrycia komórek M.
4. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.
5. Przemyć trzykrotnie 1 ml zimnego PBS, a następnie dodać do próbki 200-krotnie rozcieńczone przeciwciało anty-szczurzej IgG sprzężone z DyLight549 (20 μg/ml).
6. Inkubować próbkę na lodzie przez 2 godziny.
7. Umyć trzykrotnie 1 ml zimnego PBS, a następnie dodać 50-krotnie rozcieńczoną sprzężoną falloidynę Alexa 633 do próbki w celu wykrycia F-aktyny.
8. Inkubować na lodzie przez 2 godziny.
9. Umyć lekko 1 ml zimnego PBS. Następnie umieść trzy do czterech kawałków okrągłego szkła nakrywkowego na szkiełku podstawowym i zanurz próbki w 30% roztworze glicerolu w PBS na szkiełku (ryc. 3).
10. Obserwuj próbki za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego DM-IRE2 lub mikroskopu dekonwolucyjnego DeltaVision Restoration.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykładowy przykład mysiego testu pętli łatki Peyera z GFP-S. Typhimurium zaobserwowano za pomocą mikroskopu dekonwolucyjnego DeltaVision Restoration (Rysunek 4). GFP-S. Typhimurium jest transcytozowane przez komórki GP2⁺M. Test pętli jelitowej z łatą Peyera u myszy może zidentyfikować rodzaj bakterii komensalnych lub chorobotwórczych, które mogą być transcytozowane przez komórki M.

Rysunek 1. Znieczulenie myszy w stanie odparowania izofluranu. Odparowany izofluran był dostarczany przez aparat do znieczulenia (lewa strona).

Rysunek 2. Podsumowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną łatką Peyera. Fluorescencyjną zawiesinę bakteryjną wstrzyknięto za pomocą strzykawki do podwiązanej pętli plastra Peyera po luźnej stronie jelita.

Rysunek 3. Mocowanie próbek. Próbki zanurzono w 30% roztworze glicerolu w PBS na specjalnym szkiełku, w którym perforowana płytka z tworzywa sztucznego (o grubości 1 mm) została połączona środkiem adhezyjnym na szkiełku

podstawowym.

Rysunek 4. Przykład mysiego testu pętli łatowej Peyera z GFP-S. Typhimurium. GP2, który jest zgłaszany jako marker⁵ specyficzny dla komórek M, został wybarwiony przeciwciałem anty-mysim GP2 (czerwony). Próbka była obserwowana za pomocą mikroskopu dekonwolucyjnego DeltaVision Restoration. S. Typhimurium wykazujący ekspresję GFP był kolokalizowany z GP2 na wierzchołkowej błonie plazmatycznej komórki M oraz w subwierzchołkowych pęcherzykach cytoplazmatycznych (grotach strzałek). Widok z góry, wierzchołkowy. Widok z dołu i z boku, z boku. Podziałka: 10 μm.

Discussion

Czas inkubacji podwiązanego plastra Peyera z zawiesiną bakteryjną wynosi zwykle 1 godzinę, aby zaobserwować włączenie bakterii do komórek M. W przypadku 4-godzinnej inkubacji bakterie są często wykrywane w strefie limfocytów T plastrów Peyera. Ponieważ znieczulenie wziewne odparowanym izofluranem może utrzymać myszy w stabilnej pozycji, czas inkubacji ligowanego plastra Peyera z zawiesiną bakteryjną można wydłużyć, aby obserwować bakterie, które przemieszczają się do strefy limfocytów T w plastrze Peyera. Ważnym punktem ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Agar Ampicillin-100	SIGMA	L5667
Cy3 mono-reaktywny zestaw barwników	GE Healthcare	PA23001
Alexa Fluor 350 kwas karboksylowy, ester sukcynimidylowy	Invitrogen	A10168
Aparat do znieczulenia wziewnego	Shinano Seisakusho	SN-487
Roztwór do utrwalania i przepuszczalności	BD	554722
Przeciwciało przeciw mysiej glikoproteinie 2	MBL	D278-3	200-krotne rozcieńczenie (5μ g / ml)
Koza Anty-Szczurza IgG, F(ab')2 specyficzny fragment	Jackson ImmunoResearch	112-505-006	200-krotne rozcieńczenie (20μ g / ml)
Alexa Fluor 633	Sondy molekularne	A22284	50-krotne rozcieńczenie
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy	Leica Microsystems	DMIRE2
DeltaVision Restoration Mikroskop dekonwolucyjny	Precyzja Zastosowana precyzja	DeltaVision Core