Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

Podsumowanie

Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Streszczenie

Wnętrze naszych jelit jest zasiedlone przez ogromną liczbę bakterii komensalnych. Powierzchnia błony śluzowej przewodu pokarmowego jest nieustannie wystawiona na ich działanie, a sporadycznie także na działanie patogenów. Tkanka limfatyczna związana z jelitami (GALT) odgrywa kluczową rolę w indukcji odpowiedzi immunologicznej błon śluzowych na te drobnoustroje^{1, 2}. Aby zainicjować odpowiedź immunologiczną błon śluzowych, antygeny śluzówkowe muszą zostać przetransportowane z światła jelita przez barierę nabłonkową do zorganizowanych mieszków limfatycznych, takich jak kępki Peyera. Transcytoza antygenów ta jest pośredniczona przez wyspecjalizowane komórki M nabłonka^{3, 4}. Komórki M są atypowymi komórkami nabłonkowymi, które aktywnie fagocytują makrocząsteczki i drobnoustroje. W przeciwieństwie do komórek dendrytycznych (DCs) i makrofagów, które kierują antygeny do lizosomów w celu ich degradacji, komórki M głównie dokonują transcytozy zinternalizowanych antygenów. Ta intensywna transcytoza makrocząsteczek przez komórki M dostarcza antygen antygeny do leżących poniżej zorganizowanych mieszków limfatycznych i uważa się, że jest ona niezbędna do zainicjowania swoistych odpowiedzi immunologicznych błon śluzowych. Jednakże molekularne mechanizmy promujące to pobieranie antygenów przez komórki M są w dużej mierze nieznane. Wcześniej zgłosiliśmy, że glikoproteina 2 (Gp2), specyficznie eksprymowana na apikalnej błonie plazmatycznej komórek M spośród enterocytów, służy jako receptor transcytozy dla podgrupy komensalnych i patogennych enterobakterii, w tym Escherichia coli oraz Salmonella enterica serowaru Typhimurium (S. Typhimurium), poprzez rozpoznawanie FimH, składnika pili typu I na zewnętrznej błonie bakteryjnej ⁵. Przedstawiamy tutaj metodę zastosowania testu pętli jelitowej w kępkach Peyera myszy w celu oceny pobierania bakterii przez komórki M. Metoda ta jest ulepszoną wersją wcześniej opisanego testu pętli jelitowej myszy ^{6, 7}. Ulepszenia są następujące: 1. Jako środek znieczulający zastosowano izofluran. 2. Przygotowano podwiązaną pętlę jelitową o długości około 1 cm, zawierającą kępkę Peyera. 3. Bakterie pobrane przez komórki M zostały znakowane fluorescencyjnie za pomocą odczynnika do znakowania fluorescencyjnego lub poprzez nadekspresję białka fluorescencyjnego, takiego jak zielone białko fluorescencyjne (GFP). 4. Komórki M w nabłonku związanym z mieszkami pokrywającym kępkę Peyera wykryto za pomocą immunobarwienia całego preparatu z użyciem przeciwciała anty-Gp2. 5. Fluorescencyjną transcytozę bakterii przez komórki M obserwowano za pomocą analizy mikroskopii konfokalnej. Test pętli jelitowej w kępkach Peyera myszy może dostarczyć odpowiedzi na pytanie, jakie rodzaje bakterii komensalnych lub patogennych są transcytowane przez komórki M i może pomóc nam zrozumieć molekularny mechanizm stymulacji układu odpornościowego błon śluzowych za pośrednictwem komórek M.

Protokół

1. Przygotowanie komórek bakteryjnych

1. Wysiać bakterie fluorescencyjne z zapasu w glicerolu (np. S. Typhimurium ekspresujące GFP) na płytkę z agarem LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny.
2. Hodować pojedynczą koloni z agaru LB przez noc w 2 ml świeżej pożywki LB.
3. Dodać 0,5 ml hodowli bakteryjnej do 4,5 ml świeżej pożywki LB i inkubować do osiągnięcia gęstości optycznej 1,0 przy 600 nm.
4. Zebrać komórki bakteryjne poprzez wirowanie (3,000 x g, 5 min, 4°C).
5. Odlać nadsącz i dwukrotnie przemyć osad 5,0 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej z fosforanem (PBS).
6. Resuspendować osad bakteryjny w 5 ml PBS i wykorzystać 50 μl zawiesiny zawierającej około 10⁷ jednostek tworzących kolonie (CFU) jako inokulum.
7. W przypadku użycia bakterii znakowanych fluorescencyjnie, komórki bakteryjne znakowano odczynnikiem do znakowania fluorescencyjnego zgodnie ze standardowym protokołem.

2. Znieczulenie

1. Napełnić niewielkie plastikowe pudełko (10 x 10 x 5 cm) 5% (v/v) odparowanego izofluranu zmieszanego z powietrzem (przepływ: 200 ml/min).
2. Zanestetyzować myszy samce lub samice w wieku od ośmiu do szesnastu tygodni w pudełku.
3. Po znieczuleniu przenieść myszy na stół sekcyjny.
4. Podtrzymać znieczulenie myszy, stosując 2% (v/v) odparowany izofluran zmieszany z powietrzem (przepływ: 200 ml/min) (Rysunek 1). Jest to procedura terminalna.

3. Analiza pętli z podwiązanymi kępkami Peyera

1. Naciąć skórę brzucha na 1 cm, a następnie rozciąć otrzewnę brzuszna u znieczyszonej myszy i wyciągnąć jelito cienkie zawierające kępki Peyera.
2. Podwiązać jelito nicią chirurgiczną, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Uwaga: należy podwiązać tylko jedną stronę jelita, pozostawiając drugą stronę wolną.
3. Za pomocą strzykawki wstrzyknąć 50 μl zawiesiny bakteryjnej lub PBS (kontrola) do podwiązanej pętli kępki Peyera od strony wolnej jelita (Rycina 2).
4. Podwiązać stronę wolną i zamknąć brzuch myszy za pomocą klipsa.
5. Po 1 h usunąć podwiązaną pętlę kępki Peyera, a następnie uśmiercić mysz poprzez zwichnięcie szyi.
6. Wyciąć kępkę Peyera z podwiązanej pętli.
7. Przepłukać stronę apikalną kępki Peyera 1 ml PBS za pomocą strzykawki z igłą, aby usunąć nadmiar płynu śluzówkowego i bakterii. Przepłukać kępkę Peyera dodatkowo dwa razy.

4. Barwienie całego preparatu i analiza mikroskopowa kłaczków Peyer'a za pomocą mikroskopu konfokalnego

1. Utkwić kępki Peyerów w roztworze BD Cytofix/Cytoperm na lodzie przez 1 hr.
2. Przemyć kępki Peyerów trzy razy 1 ml buforu BD Perm/Wash przez 5 min, a następnie zablokować 1 ml buforu blokującego zawierającego 0,1% (w/v) saponiny i 0,2% (w/v) BSA w PBS przez 30 min na lodzie.
3. Do preparatu dodać 200-krotnie rozcieńczone przeciwciało monoklonalne anty-mysie GP2 (5 μg/ml) w celu detekcji komórek M.
4. Inkubować przez 2 hrs w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.
5. Przemyć trzy razy 1 ml zimnego PBS, a następnie do preparatu dodać 200-krotnie rozcieńczone przeciwciało anty-szczurze IgG sprzężone z DyLight549 (20 μg/ml).
6. Inkubować próbkę na lodzie przez 2 hrs.
7. Przemyć trzy razy 1 ml zimnego PBS, a następnie do preparatu dodać 50-krotnie rozcieńczoną faloidynę sprzężoną z Alexa 633 w celu detekcji F-aktyny.
8. Inkubować na lodzie przez 2 hrs.
9. Przemyć delikatnie 1 ml zimnego PBS. Następnie umieścić trzy do czterech okrągłych szkiełek nakrywkowych na preparacie i zatopić preparaty w 30% roztworze glicerolu w PBS na szkiełku (Rycina 3).
10. Obserwować preparaty przy użyciu konfokalnego mikroskopu laserowego DM-IRE2 lub mikroskopu dekonwolucyjnego DeltaVision Restoration.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykładowy preparat z analizy pętli kępki Peyera myszy z podwiązaniem z zastosowaniem GFP-S. Typhimurium był obserwowany przy użyciu mikroskopu dekonwolucyjnego DeltaVision Restoration (Rysunek 4). GFP-S. Typhimurium jest transportowane przez transcytozę przez komórki M GP2⁺. Analiza pętli jelitowej kępki Peyera myszy pozwala zidentyfikować rodzaje bakterii komensalnych lub patogennych, które mogą być transportowane przez transcytozę przez komórki M.

Rysunek 1. Anestezja myszy z wykorzystaniem odparowanego izofluranu. Odparowany izofluran był dostarczany za pomocą dedykowanego aparatu do anestezji (lewa strona).

Rysunek 2. Podsumowanie testu pętli jelitowej z podwiązanym kęcikiem Peyera. Zawiesinę fluorescencyjnych bakterii wstrzyknięto za pomocą strzykawki do podwiązanej pętli z kęcikiem Peyera po luźnej stronie jelita.

Rycina 3. Montaż preparatów. Preparaty zatopiono w 30% roztworze glicerolu w PBS na specjalnym szkiełku, w którym perforowana plastikowa płytka (o grubości 1 mm) została przymocowana do szkiełka przedmiotowego za pomocą substancji klejącej.

Rysunek 4. Przykład testu pętli z podwiązaną kępką Peyera u myszy z użyciem GFP-S. Typhimurium. Marker GP2, uznawany za specyficzny marker komórek M⁵, został zabarwiony przeciwciałami anty-mysim GP2 (kolor czerwony). Preparat obserwowano za pomocą mikroskopu dekonwolucyjnego DeltaVision Restoration. GFP-wyrażające S. Typhimurium współlokalizowały z GP2 na apikalnej błonie plazmatycznej komórki M oraz w podapikalnych pęcherzykach cytoplazmatycznych (groty strzałek). Góra: widok apikalny. Dół i bok: widoki boczne. Pasek skali: 10 μm.

Dyskusja

Czas inkubacji podwiązanej kępki Peyera z zawiesiną bakteryjną wynosi zazwyczaj 1 hr, aby zaobserwować wbudowywanie się bakterii w komórki M. W przypadku 4 hr inkubacji bakterie są często wykrywane w strefie komórek T kępek Peyera. Ponieważ anestezja wziewna izofluranem w formie par pozwala utrzymać stabilny stan myszy, czas inkubacji podwiązanej kępki Peyera z zawiesiną bakteryjną można wydłużyć, aby zaobserwować bakterie przemieszczające się do strefy komórek T w kępce Peyera. Kluczowym punktem tego eksperymentu jest z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LB Agar z ampicyliną- 100	SIGMA	L5667
Zestaw barwnika reaktywnego Cy3 mono	GE Healthcare	PA23001
Alexa Fluor 350 kwas karboksylowy, ester succinimidylowy	Invitrogen	A10168
Aparat do znieczulenia inhalacyjnego	Shinano Seisakusho	SN-487
Roztwór do fiksacji i permeabilizacji	BD	554722
Przeciwciało przeciwko mysiej glikoproteinie 2	MBL	D278-3	rozcieńczenie 200-krotne (5μg/ml)
Kozie przeciwciało anty-szczur IgG, specyficzne dla fragmentu F(ab')2	Jackson ImmunoResearch	112-505-006	rozcieńczenie 200-krotne (20μg/ml)
Alexa Fluor 633 Falloidyna	Molecular Probes	A22284	rozcieńczenie 50-krotne
Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy	Leica Microsystems	DMIRE2
Mikroskop dekonwolucyjny DeltaVision Restoration	Applied Precision	DeltaVision Core