Wykrywanie i genogrupowanie norowirusów z kału dzieci za pomocą jednoetapowej reakcji RT-PCR TaqMan

Podsumowanie

Opisano jednokrokowy test RT-PCR do detekcji i identyfikacji genogrup izolatów norowirusa z kałków dziecięcych, wykorzystujący primery i sondy TaqMan specyficzne dla regionu złącza otwartej ramki odczytu 1 (ORF1)-ORF2, który jest najbardziej konserwatywnym regionem genomu norowirusa. Szczegółowo przedstawiono niekomercyjną, kosztowo efektywną metodę ekstrakcji RNA.

Streszczenie

Norowirusy (NoVs) są główną przyczyną sporadycznych ognisk ostrego zapalenia żołądkowo-jelitowego u ludzi w każdym wieku na całym świecie. Stanowią one istotną przyczynę hospitalizacji dzieci, wywierając wpływ na zdrowie publiczne podobny do rotawirusów. NoV są wirusami RNA o dużej różnorodności genetycznej, a nowe szczepy pojawiają się stale. Rozpoznaje się pięć genogrup, z czego GI i GII wraz z ich licznymi genotypami i podtypami są najważniejsze w kontekście zakażeń ludzkich. Niemniej jednak diagnostyka tych dwóch genotypów pozostaje problematyczna, co opóźnia rozpoznanie i leczenie. ^{1, 2, 3}

W przypadku ekstrakcji RNA z próbek kału najczęściej stosowaną metodą jest wykorzystanie komercyjnego zestawu QIAmp Viral RNA firmy Qiagen. Metoda ta łączy właściwości wiążące membrany z żelu krzemionkowego, bufory kontrolujące aktywność RNaz i zapewniające optymalne wiązanie RNA z kolumną, a także szybkość wirowania w mikrocentryfudze. Jest to metoda prosta, szybka i niezawodna, realizowana w kilku krokach szczegółowo opisanych w instrukcji producenta.

Norowirus jest drugim po rotawirusie najczęstszymy powodem występowania biegunki. Diagnostyka norowirusa powinna być dostępna we wszystkich badaniach nad patogenezą biegunki, a także podczas ognisk epidemicznych lub w indywidualnych przypadkach biegunki. Obecnie jednak diagnostyka norowirusa jest ograniczona do zaledwie kilku ośrodków ze względu na brak prostych metod diagnostycznych. Opóźnia to proces rozpoznania i leczenia ^{1, 2, 3}. Dodatkowo, ze względu na koszty i regulacje dotyczące transportu żrących buforów w obrębie i pomiędzy krajami, stosowanie gotowych zestawów komercyjnych wiąże się z problemami logistycznymi. W związku z tym w niniejszym protokole opisujemy alternatywną, ekonomiczną metodę opracowaną wewnątrz laboratorium, opartą na pierwotnej metodzie Boom et al.⁴, która wykorzystuje właściwości wiązania kwasów nukleinowych przez cząsteczki krzemionki wraz z właściwościami antynukleazowymi tiocyjanianu guanydinium.

W celu detekcji i przypisania do genogrup (GI i GII) izolatów NoV z próbek kału opracowano kilka protokołów RT-PCR wykorzystujących różne cele. Panuje konsensus, że RT-PCR z wykorzystaniem chemii TaqMan byłby najlepszą techniką molekularną do diagnostyki, ponieważ łączy wysoką czułość, swoistość i powtarzalność z wysoką przepustowością i łatwością użycia. W niniejszej pracy opisujemy test celujący w region złącza ramki odczytu 1 (ORF1)-ORF2; jest to najbardziej konserwatywny region genomu NoV, a zatem najodpowiedniejszy do diagnostyki. Do dalszej analizy genetycznej szczegółowo opisano konwencjonalny RT-PCR celujący w wysoce zmienny N-końcowy fragment białek kapsydu (Region C) z wykorzystaniem starterów pierwotnie opisanych przez Kojimę et al. ⁵. Sekwencjonowanie produktu PCR z konwencjonalnego PCR umożliwia rozróżnienie genotypów należących do genogrup GI i GII.

Protokół

1. Próbki kału

1. Próbki kału należy przechowywać w zamrożeniu, aby zachować RNA. W celu przygotowania 10% zawiesiny fekalnej, należy odważyć około 0,1 g rozmrożonej próbki kału i uzupełnić objętość do 1 ml za pomocą PBS.
2. Należy przygotować alikwoty po 200 μl, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Alikwoty należy przechowywać w temperaturze -70 °C.
3. Przed użyciem w procesie ekstrakcji, alikwoty należy rozmrozić i odwirować przy 4,000 g przez 10 min.

2. Przygotowanie cząsteczek krzemionki do ekstrakcji z użyciem guanidyny i krzemionki

1. W temperaturze pokojowej zawiesić 30 g dwutlenku krzemu i dopełnić dH₂O do objętości 250 mL.
2. Po 24 h sedymentacji odessać 215 mL nadosadu. Dopełnić dH₂O do 250 mL i zawiesić osad krzemionki poprzez wstrząsanie.
3. Po kolejnych 24 h odessać nadosad i dostosować pH zawiesiny krzemionki do pH 2,0 za pomocą kwasu solnego (HCl). Rozdzielić zawiesinę krzemionki do butelek szklanych i poddać autoklawowaniu.

3. Przygotowanie buforu L6 do ekstrakcji z użyciem guanidyny i krzemionki

1. W temperaturze pokojowej przygotować bufor L6, rozpuszczając 60 g tiocyjanianu guanydyny (GuSCN) oraz 1,3 g Triton X-100 w 50 mL 0,1 M Tris-HCl, pH 6,4, oraz w 11 mL roztworu 0,2 M EDTA, pH 8,0.

4. Przygotowanie buforu L2 do ekstrakcji z użyciem guanidyny i krzemionki

1. W temperaturze pokojowej przygotować bufor L2, rozpuszczając 180 g tiocyjanianu guanydynium (GuSCN) w 150 mL 0,1 M Tris-HCl o pH 6,4.

5. Procedura ekstrakcji

1. W każdej ekstrakcji należy uwzględnić próbkę kału dodatnią pod kątem NoV jako kontrolę dodatnią oraz wodę traktowaną DEPC jako kontrolę ujemną.
2. W probówce do mikrocentrifugi wymieszać następujące składniki: 1 mL buforu L6, 20 μL cząsteczek krzemionkowych, a następnie dodać 200 μL 10% zawiesiny ekstraktu z kału. Krótko wymieszać na wirówce typu vortex i pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na 15 min.
3. Wirować zawiesinę przy 6000 g przez 10 s i dwukrotnie przemyć osad 1 ml buforu L2, a następnie dwukrotnie przemyć 70% etanolem i raz acetonem. Suszyć osad w suchym bloku grzejnym w temperaturze 56 °C przez 5 min.
4. Nawodnić RNA w osadzie krzemionkowym, dodając 50 μL dH₂0 wolnej od RNaz. Dodać 1 μL RNasin, wymieszać poprzez odwracanie probówki i inkubować w temperaturze 56 °C przez 15 min.
5. Wirować przez 3 min z maksymalną prędkością w wirówce stołowej i zebrać 40 μL nadnadistratu zawierającego RNA.
6. Ilość wyekstrahowanego RNA w próbkach oznaczyć za pomocą spektrofotometru Nanodrop 2000 (Thermo scientific). Następnie przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu użycia, maksymalnie przez 6 miesięcy. (Uwaga: Lepszym sposobem na zachowanie nienaruszonego całkowitego RNA jest jego konwersja do cDNA).

6. Alternatywna ekstrakcja z użyciem komercyjnego zestawu QIAamp Viral RNA Kit

Pełne instrukcje znajdują się w instrukcji dołączonej do zestawu QIAGEN. W skrócie procedura przebiega następująco:

1. Do probówki 1,5 mL pipetować 560 μL Buforu AVL zawierającego RNA nośnikowe, a następnie dodać 140 μL 10% zawiesiny kałowej. Mieszać przez 15 s za pomocą pulsacyjnego wstrząsania w wirówce (vortexingu). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min.
2. Do próbki dodać 560 μL etanolu (96-100%) i mieszać przez 15 s za pomocą pulsacyjnego vortexingu, a następnie krótko odwirować.
3. Nanieść 630 μL otrzymanego roztworu na kolumnę wirówkową umieszczoną w 2 mL probówce zbiorczej. Wirować przez 1 min przy 6 000 g, a następnie przenieść kolumnę do czystej probówki 2 mL.
4. Przemyć kolumnę zawierającą związane RNA przy użyciu 500 μL Buforu AW1 i wirować przy 6 000 g przez 1 min. Umieścić kolumnę w czystej 2 mL probówce zbiorczej.
5. Przemyć kolumnę za pomocą 500 μL Buforu AW2 i wirować z maksymalną prędkością (20 000 g lub 14 000 rpm) przez 3 min.
6. Umieścić kolumnę wirówkową w czystej mikroprobówce 1,5 mL, dodać 40 μL wody traktowanej DEPC i eluować RNA z maksymalną prędkością wirowania. Powtórzyć czynność raz, aby uzyskać końcową objętość 80 μL elowanego RNA.
7. Oznaczyć ilość wyekstrahowanego RNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop 2000 (Thermo scientific). Następnie przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu użycia, maksymalnie przez 6 miesięcy. (Uwaga: Lepszą metodą zachowania całkowitego RNA w nienaruszonej formie jest jego konwersja do cDNA).

7. Detekcja norowirusa w wyekstrahowanym RNA za pomocą jednokrokowego Real Time RT-PCR z zastosowaniem specyficznych sond Taqman

Systemy do PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems).

Metodyka

1. Przetrzyj i oczyść wszystkie powierzchnie robocze, pipety i wirówki preparatem RNase AWAY, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia RNazami.
2. Przygotuj mieszaniny główne (master mixy) do przesiewowego badania NoV GI i GII zgodnie z Tabelą 1. Primery i sondy Taqman wymieniono w Tabeli 2.
3. Odważ 10 μL odpowiedniego master mixu do każdej probówki reakcyjnej.
4. Do odpowiednich studniek reakcyjnych dodaj 5 μL nierozcieńczonego RNA nieznanej próbki, wody traktowanej DEPC jako kontrolę negatywną lub RNA kontroli pozytywnej GI odpowiednio GII. Wszystkie próbki należy analizować w duplikacie. Kontrole pozytywne i standardy o stężeniu odpowiednio 300 μg/μL i 500 μg/μL zostały dostarczone przez National Calicivirus Laboratory Center for Disease Control and Prevention (CDC).
5. Wiruj płytkę reakcyjną z prędkością 6 000 g przez 10 s.
6. W ekranie właściwości eksperymentu zdefiniuj i wybierz typ eksperymentu dla danego przebiegu. Upewnij się, że odczynniki TaqMan są wyświetlane jako typ odczynników oraz że wybrano odczyt Pre-PCR i amplifikację.
7. Przeprowadź reakcje o objętości 15 μL zgodnie z profilem termicznym w Tabeli 3.
8. Przeanalizuj wyniki.

8. Genotypowanie NoV GI i GII z wykorzystaniem konwencjonalnej RT-PCR i sekwencjonowania

(Nie wspomniano o tym w tym filmie, ponieważ jest to metoda powszechna i szeroko stosowana.)

Instrument. Systemy PCR w czasie rzeczywistym Applied Biosystems StepOne i StepOnePlus z szablonem Quantitec.

Metodyka

1. Przed genotypowaniem, za pomocą opisanego powyżej przesiewowego badania RT-PCR, należy określić genogrupę (GI lub GII) próbek. RNA NoV grupy GI musi zostać powielone przy użyciu master mixu do genotypowania GI, a RNA NoV grupy GII przy użyciu master mixu do genotypowania GII.
2. Pipetować master mixy do genotypowania NoV GI i GII zgodnie z Tabelą 4. Primery GI SKF/SKR oraz G2 SKF/SKR wymieniono w Tabeli 5.
3. Do probówek reakcyjnych o pojemności 0,2 mL odmierzyć aliquoty po 45 μL odpowiedniego master mixu.
4. Do każdej probówki kontroli negatywnej dodać 5 μL wody traktowanej DEPC, a do odpowiedniej probówki reakcyjnej dodać 5 μL wcześniej przebadanego, pozytywnego pod kątem NoV (GI i/lub GII) RNA.
5. Przeprowadzić reakcje o objętości 50 μL zgodnie z profilem termicznym zawartym w Tabeli 6.
6. Produkty PCR zawierające co najmniej 100 ng/μL powielonego regionu kapsydu wysłać do firmy Macrogen w celu oczyszczenia i sekwencjonowania. (9700 Great Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 oraz koszt 10 USD za próbkę za sekwencjonowanie).

9. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wyniki badania Taqman One-Step RT-PCR wykonanego w celu analizy RNA wyizolowanego z próbek kału pobranych od dzieci z biegunką. Cykl progowy (Ct) dla próbki pozytywnej ustalono na wartość mniejszą lub równą Ct 37 dla GI oraz Ct 39 dla GII. Wartości Ct dla kontroli pozytywnych w obrębie złącza ORF1-ORF2 wyniosły odpowiednio mniej niż 27 dla GI i 18 dla GII. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Rycina 2 przedstawia bezpośrednie porównanie wartości Ct uzyskanych metodą in silica z użyciem guanidynium oraz przy użyciu zestawu QiAmp Viral RNA. Dane z obu testów znajdują się bardzo blisko linii równości (nachylenie = 1 i punkt przecięcia = 0). Potwierdzają to analiza regresji oraz współczynnik korelacji. Wszystkie kontrole negatywne zostały ocenione i w obu metodach uzyskały wynik 0.

Mieszanina Master Mix	Stężenie końcowe	Objętość (μL)
H20 PCR		2.875
Quantitect RT-PCR Master Mix	1x	6.250
Mieszanina do RT	1x	0.125
50 μM starter Cog R	1 μM	0.250
50 μM Starter Cog F	1 μM	0.250
10 μM Sonda pierścieniowa	1 μM	0.125/0.250*
		10.00

* Do testów GI wykorzystano 0,250 μL każdej sondy, natomiast do testów GII wykorzystano 0,125 μL każdej sondy.

Tabela 1. Master mix Qiagen Quantitect do przesiewowego wykrywania GI i GII (Trujillo et al., 2006).⁷

Nazwa	grupa Geno-	Zastosowanie	Sekwencja (5' do 3')
Cog 1R	GI	Starter	CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C
Cog 1F	UK	Starter	CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA
Cog 2R	GII	Starter	TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA
Cog 2F	GII	Starter	CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG
Pierścień 1A	Układ pokarmowy	Sonda	FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1
Pierścień 1B	UKW	Sonda	FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1
Ring2-TP	GII	Sonda	FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1

Tabela 2. Oligonukleotydy starterów i sond wykorzystane do ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym dla genogrup I i II (Kageyama et al., 2003).⁸

Krok	Temp (°C)	Czas (min)
1	50	30:00	synteza cDNA
2	95	15:00	aktywacja polimerazy Taq HotStart
3	95	00:15
	60	01:00	45 cykli

Tabela 3. Profil termiczny dla jednowykrocznej reakcji RT-PCR Taqman w czasie rzeczywistym (Trujillo et al., 2006).⁷

Mieszanina główna (Master Mix)	Stężenie końcowe	Objętość (μL)
H2O PCR		29.50
5X Qiagen RT-PCR Buffer	1x	10.00
10 mM dNTP Mix	0.4 mM	2.00
Mieszanina enzymów		2.00
40 U/μL RNAsin	20 U/μL	0.50
10 μM SKF	0.1 μM	0.50
10 μM SKR	0.1 μM	0.50
		45.00

Tabela 4. Master mix Qiagen One-Step RT-PCR do genotypowania GI i GII.

Nazwa	Grupa genetyczna	Zastosowanie	Sekwencja (5' do 3')
G1SKF	GI	Starter	5'- CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3
G1SKR	GI	Starter	5'- CCA ACC CAR CCA TTR TAC A -'3
G2SKF	GII	Starter	5'- CNT GGG AGG GCG ATC GCA A - 3
G2SKR	GII	Starter	5'- CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT- 3

Tabela 5. Primery użyte do amplifikacji regionu C obszaru kapsydu (Kojima et al., 2002).⁵

Krok	Temp. (°C)	Czas (min)
1	60	30:00	synteza cDNA
2	96	15:00	aktywacja polimerazy Taq HotStart
3	94	00:30
	52	01:00	40 cykli
	72	00:30
4	72	10:00	Wyżarzanie

Tabela 6. Profil termiczny dla Taqman One-Step RT-PCR.

Dyskusja

Stosując ekonomiczną, wewnętrzną metodę izolacji kwasów nukleinowych z próbek kału, uzyskujemy wyniki równoważne z wynikami otrzymanymi przy użyciu komercyjnego zestawu QIAmp Viral RNA firmy Qiagen, a w połączeniu z opracowaną w naszym laboratorium metodą TaqMan RT-PCR jesteśmy w stanie wykryć szeroki zakres genotypów NoV należących do genogrup GI i GII. W niedawnej publikacji dotyczącej protokołu dla regionu C zgłoszono wskaźniki genotypowania na poziomie 78%⁶. Ponieważ różnorodność współczesnych szczepów NoV...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Izotiocyjanian guanidyny	Sigma-Adrich	G9277
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T5941
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Krzemionka	Sigma-Aldrich	S5631
Triton X 100	VWR	14530
Węglan dwuetylowopirokarbonianu	Sigma-Aldrich	D-5758
Zestaw QIAamp viral RNA Mini Kit (250)	Qiagen	52906
Zestaw QuantiTec Probe RT-PCR kit (200)	Qiagen	204443
Zestaw Qiagen One Step RT-PCR Kit (200)	Qiagen	210212
Inhibitor RNazy 2000 jednostek	A. Biosystems	N808-0119	2000 jednostek/fiolka
Probówki do mikrowirówek nieprzywierające i wolne od RNaz	Ambion	AM12450
Agaroza UltraPure 1000	Invitrogen	16550-100