Monitorowanie zmian równowagi w strukturze RNA przez "peroksydacyjne" i "oksydacyjne" śladowanie rodników hydroksylowych

Summary

Ten protokół opisuje, jak określić ilościowo zależne od Mg(II) tworzenie trzeciorzędowej struktury RNA za pomocą dwóch metod śladu rodnika hydroksylowego.

Abstract

Cząsteczki RNA odgrywają istotną rolę w biologii. Oprócz przekazywania informacji genetycznej, RNA może składać się w unikalne struktury trzeciorzędowe, pełniąc określoną rolę biologiczną jako regulator, spoiwo lub katalizator. Informacje na temat tworzenia trzeciorzędowych kontaktów są niezbędne do zrozumienia funkcji cząsteczek RNA. Rodniki hydroksylowe (•OH) są unikalnymi sondami struktury kwasów nukleinowych ze względu na ich wysoką reaktywność i niewielkie rozmiary. ¹ Gdy jest używana jako sonda do śledzenia śladów, rodniki hydroksylowe mapują dostępną dla rozpuszczalnika powierzchnię szkieletu fosfodiestrowego DNA¹ i RNA² z rozdzielczością tak dokładną, jak pojedynczy nukleotyd. Ślad rodnika hydroksylowego może być stosowany do identyfikacji nukleotydów na powierzchni kontaktu międzycząsteczkowego, np. w kompleksach DNA-białko¹ i RNA-białko. Przejścia równowagi³ i kinetyczne⁴ można wyznaczyć, przeprowadzając ślad rodnika hydroksylowego w funkcji odpowiednio zmiennej roztworu lub czasu. Kluczową cechą footprintingu jest to, że ograniczona ekspozycja na sondę (np. "kinetyka pojedynczego trafienia") skutkuje jednolitym próbkowaniem każdego nukleotydu polimeru. ⁵

W tym artykule wideo używamy domeny P4-P6 rybozymu Tetrahymena do zilustrowania przygotowania próbki RNA i wyznaczenia izoterm fałdowania za pośrednictwem Mg(II). Opisujemy zastosowanie dobrze znanego protokołu śladu rodnika hydroksylowego, który wymaga_H2O2(nazywamy to protokołem "peroksydacyjnym") oraz cennej, ale nie powszechnie znanej alternatywy, która wykorzystuje naturalnie rozpuszczony_O2 (nazywamy to protokołem "oksydacyjnym"). Przedstawiono przegląd procedur redukcji, przekształcania i analizy danych.

Protocol

1. Przygotowanie odczynników do odciskania śladów

1. Przygotować 10-krotny bufor reakcyjny zawierający 100 mM kakodylanu sodu, 1 mM EDTA i 1 M KCl. Dostosować pH do 7,4. Przefiltrować bufor za pomocą urządzenia filtrującego octan 0,2 μM (Nalgene). Uwaga: nie pipetować RNA bezpośrednio do buforu 10x.
2. Przygotować mieszaninę reakcyjną do miareczkowania dla każdej reakcji, jak wskazano w tabeli 1. Objętość mieszaniny miareczkowej (1x bufor i Mg(II) w pożądanym stężeniu) powinna wynosić 90 μl, przed dodaniem 10 μl RNA do 1x buforu.
3. Przygotuj bufor do trawienia RNAzy T1 zawierający 6,63 M mocznika, 20 mM cytrynianu sodu, 1 mM EDTA, 0,25 μg/μl tRNA, 0,025% cyjanolu ksylenu i 0,025% błękitu bromfenolowego. Bufor ten może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
4. Reakcja Fentona wymaga świeżo przygotowanych roztworów wodnych 250 mM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂, 250 mM EDTA i 500 mM L-askorbinianu sodu. Stężenia podane w rozdziale 1.5 są optymalne do eksperymentów równowagowych w buforze, takim jak kakodylan sodu, który nie wymiata rodników i różnych stężeń jonów dwuwartościowych.
5. Odczynniki do reakcji śladowania peroksydacyjnego (1.5.1) i utleniającego (1.5.2).
   1. Peroksydacyjna reakcja Fentona wymaga świeżo przygotowanych roztworów wodnych 100 mM roztworu Fe-EDTA oraz 50 mM L-askorbinianu sodu i 1,5%_H2O2. Roztwór Fe-EDTA przygotowuje się przez zmieszanie Fe(NH₄)₂(_SO4)₂ z EDTA, aby uzyskać 1,1-krotny nadmiar EDTA nad żelazem.
   2. Tuż przed rozpoczęciem reakcji rozkładu oksydacyjnego (3.4.2) należy utworzyć mieszaninę reakcyjną Fentona, łącząc 2 μl Fe(NH)₂(_SO4)₂ (250 mM), 2,2 μl EDTA (250 mM), 62,5 μl L-askorbinianu sodu (500 mM), 22,5 μl 10x buforu reakcyjnego i 135,5 μl_H2O, aby osiągnąć końcowe stężenia w śladowej mieszaninie reakcyjnej (3.4.2) wynoszące 0,10 mM, Odpowiednio 0,11 mM i 6,61 mM.

2. Przygotowanie RNA do eksperymentu z odciskiem stopy

1. RNA może być wytwarzane przez standardową transkrypcję in vitro matryc DNA⁶ lub, jeśli są krótsze niż 50 nukleotydów, można je zakupić (np. w Integrated DNA Technologies, www.idtdna.com). Postępuj zgodnie z zalecanymi procedurami czystości laboratoryjnej, aby zachować integralność próbki RNA podczas eksperymentów z odciskami stóp. ⁷
2. Defosforylacja⁸ transkrybowanego RNA in vitro jest konieczna przed znakowaniem ³²P końca 5' RNA. 10 pmol RNA jest znakowane końcowo przez kinazowanie. ⁹ Roztwór powinien być mętny po udanej inaktywacji fosfatazy.
3. Oczyść znakowane radioaktywnie RNA za pomocą elektroforezy żelu denaturującego. RNA jest odzyskiwane przez dwie kolejne ekstrakcje żelem przy użyciu 0,3 M octanu sodu (pH 5,5). RNA wytrąca się przez zmieszanie 0,5 ml roztworu wodnego z 1 ml etanolu, a następnie inkubację przez 1 minutę na suchym lodzie. Wirować próbkę w temperaturze 4 °C, 12500 obr./min przez 0,5 godziny. Wyrzucić supernatant i przemyć osad RNA 70% etanolem. Usunąć supernatant po dodatkowym odwirowaniu i wysuszyć osad w próżni.
4. Rozpuść ³²próbki RNA znakowane P w 330 ul 1x Buffer.Odpipetuj 30 μl roztworu RNA w probówce reakcyjnej, wytrącić etanolem i suchym RNA w próżni; zachowaj tę probówkę do wygenerowania drabiny referencyjnej (krok 3.5). Denaturacja buforowanego roztworu RNA przez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 2 minuty. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej przez 15 minut i szybko zakręcić, aby sprowadzić kondensaty znajdujące się na pokrywkach probówek z powrotem do roztworu.

3. Eksperyment z odciskiem stopy

1. Grzebień do elektroforezy określa maksymalną liczbę punktów danych na żel analityczny. Używamy grzebienia z 30 dołkami. Drabina referencyjna zajmuje 2 studnie, a nieszczelna kontrolna jedna. Przygotować 27 probówek reakcyjnych. Końcowe stężenia Mg(II) powinny być równomiernie rozmieszczone w skali logarytmicznej obejmującej rzędy wielkości wokół punktu środkowego miareczkowania.
2. Oddzielnie inkubować roztwory RNA i Mg(II) w temperaturze 50°C przez 5 minut. Wymieszać 10 μl roztworu RNA z 90 μl odpowiedniej ilości Mg(II) w 1x buforze, aby osiągnąć końcową objętość 100 μl. Inkubować roztwory przez 30 minut w temperaturze 50°C.
3. Pozwól roztworom zrównoważyć się w temperaturze 25°C przez 1 godzinę, podczas gdy następuje składanie.
4. Reakcja śladu rodnika hydrooksydacyjnego (3.4.1) lub utleniającego (3.4.2).
   1. Rozpocznij reakcję peroksydacyjną, umieszczając kropelki 2 μl Fe-EDTA (100 mM), 2 μl L-askorbinianu sodu (50 mM) i 2 μl_H2O2 (1,5%) oddzielnie od siebie w górnej części probówki reakcyjnej zawierającej roztwór RNA i rozpocznij reakcję śladu przez energiczne mieszanie. Zatrzymaj reakcję po 15 sekundach, dodając 300 μl zimnego etanolu absolutnego. Obróć rurki 3-5 razy. Wytrącić, umyć i wysuszyć osad jak w kroku 2.4.
   2. Rozpocząć reakcję utleniania rodnika hydroksylowego, dodając 5 μl świeżo przygotowanej mieszaniny reakcyjnej Fentona (1.6). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 25°C. Dodać 300 μl zimnego absolutnego etanolu w celu wygaszenia reakcji i wymieszać, obracając probówki 3-5 razy. Wytrącić, umyć i wysuszyć osad, jak wskazano w kroku 2.4.
5. Wygeneruj próbkę referencyjną ekstraktu RNazy T1 zgodnie ze standardowymi procedurami¹⁰, korzystając z roztworu przygotowanego w kroku 1.3.
6. Rozpuść granulki RNA w 8 μl żelowego barwnika ładującego II (AMBION) i potwierdź, że RNA jest ponownie zawieszone za pomocą licznika Geigera.
7. Przygotuj denaturujący, 8% poliakryloamidowy żel do sekwencjonowania zgodnie ze standardowymi protokołami. ¹¹ Załaduj próbki, w tym dwa odniesienia i kontrolę. Oddziel fragmenty RNA przy 60 W - 75 W przez 2,5 godziny. Wystawić wysuszony żel na ekran fosforowy do przechowywania przez noc. Skanuj ekran luminoforowy z systemem obrazowania do autoradiografii bezfilmowej, np. Storm 865 (GE Healthcare) lub Typhoon (GE Healthcare). Przenieś plik obrazu żelu do swojego komputera.

4. Analiza danych

1. Reaktywność rodników hydroksylowych każdego nukleotydu określa się poprzez ilościowe określenie intensywności każdego pasma na żelu analitycznym. Pobierz, zainstaluj i otwórz SAFA, łatwe w użyciu oprogramowanie typu open source do dopasowania i kwantyfikacji pojedynczej taśmy. ^{12, 13} Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi. Krótko mówiąc, załaduj sekwencję RNA jako plik .txt, a następnie obraz żelu jako plik .gel. Dostosuj intensywność pasma, zdefiniuj pasy ruchu, wybierz pas kotwiczenia i wykonaj wyrównanie żelu. Przypisanie prążków nukleotydom następuje w odniesieniu do drabinki trawienia RNazy T1. Określ ilościowo całki pasmowe i użyj funkcji normalizacji/wykresu kolorów, aby znormalizować i przypisać potencjalnie niezmienne resztki. Zapisz dane wyjściowe jako plik .txt.
2. SAFA generuje arkusz kalkulacyjny zawierający kolumny reprezentujące pasy na żelu i wiersze reprezentujące zintegrowaną gęstość pasm poszczególnych prążków odpowiadających fragmentowi RNA. Po pierwsze, należy zidentyfikować miejsca ochrony, w których obserwuje się zmianę dostępności rozpuszczalnika, porównując profil ochrony uzyskany z próbki bez Mg(II) z profilem stężenia Mg(II) w punkcie końcowym (50 mM w naszym przykładzie). Im niższa wartość, tym bardziej nukleotyd jest chroniony przed atakiem rodników hydroksylowych i odwrotnie.
3. Utwórz izotermy fałdowania ze znormalizowanych całek pasmowych poszczególnych lub grup nukleotydów w funkcji stężenia Mg(II). Izotermy są indywidualnie skalowane do nasycenia ułamkowego przez fi = L + (U - L)• gdzie f oznacza zintegrowaną gęstość analizowanego pasma (pasm), L i U reprezentują dolną i górną granicę przejścia, a to nasycenie ułamkowe.¹⁴ Dane są dopasowywane za pomocą programu do nieliniowej analizy metodą najmniejszych kwadratów (używamy Origin (OriginLab) lub GraphPad (GraphPad Software, Inc.).) do równania Hilla (1),
   
   gdzie K_d jest stałą dysocjacji równowagi, [M] odpowiada stężeniu zmiennej, która pośredniczy w reakcji fałdowania, Mg(II) w tym przykładzie, a n_H jest współczynnikiem Hilla. Procedura ta skaluje przejście do nasycenia ułamkowego, określa jego punkt środkowy i zapewnia fenomenologiczny test tego, czy przejście jest sigmoidalne. Izotermy pochodzące z żeli sekwencjonujących (rysunek 3A), które zostały przeanalizowane przez SAFA (rysunek 3B) i pasują zgodnie z powyższym opisem, pokazano na rysunku 3C. Izotermy nasycenia ułamkowego pokazane na rysunku 3 zostały wygenerowane przez przeskalowanie w arkuszu kalkulacyjnym wartości wygenerowanych przez SAFA w stosunku do najlepiej dopasowanych górnych i dolnych granic (U i L) za pomocą równania ułamek = wartość /(U - L) - L /(U - L).

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne wyniki eksperymentów z śladem śladu P4-P6 RNA •OH. Obraz żelu (po lewej) wskazuje, że a) rozszczepienie tła jest minimalne (prawy pas), b) przypisanie pojedynczego nukleotydu jest możliwe dzięki dobrze zdefiniowanym pasmom na pasie T1 (RNaza T1 rozszczepia się na każdym G) i c) fragmentacja RNA wywołana rodnikiem hydroksylowym znajduje się znacznie powyżej tła. Przejście od niskiej do wysokiej Mg(II) jest związane ze zmniejszającą się zintegrowaną gęstością pasm poszczególnych i grup prążków, co wskazuje na tworzenie się struktury trzeciorzędowej RNA. Pojedynczy lub grupy sąsiadujących ze sobą nukleotydów, których rozszczepienie zmienia się równocześnie, określa się mianem "ochrony". Ochrona •OH charakterystyczna dla fałdowania RNA P4-P6 za pośrednictwem Mg(II) ściśle odpowiada niedostępnym dla rozpuszczalnika obszarom cząsteczki obserwowanym w jej strukturze krystalicznej. ¹⁵

Złożone cząsteczki RNA mogą mieć bardzo różne zakresy (np. jak blisko tła spada gęstość pasma) trzeciorzędowej ochrony kontaktu, które nie zostały skorelowane z wyraźnym zjawiskiem strukturalnym lub dynamicznym. Tak więc niektóre cząsteczki RNA będą wykazywać dobrze zdefiniowane przejścia strukturalne, jak pokazano na ryc. 3, a niektóre nie. Natężenia pasm są określane ilościowo i normalizowane za pomocą analizy SAFA¹² (rysunek 3B). Wynikiem jest wykres "termiczny" wizualizujący względny stopień ochrony przed •OH. Przejście kolorów opisuje zmianę dostępności po dodaniu Mg(II). Kolor od białego do czerwonego lub niebieskiego pokazuje odpowiednio bardziej dostępne lub lepiej chronione nukleotydy. Każdy stopień zacienienia jest powiązany z wartością liczbową, którą można wykreślić jako krzywą ochrony (rysunek 3C) i przeanalizować za pomocą modelu wiązania, takiego jak równanie Hilla (1). Stała dysocjacji równowagi związana z Ochroną 153-155 jest w przybliżeniu dwukrotnie większa od odpowiadającej jej wartości Ochrony 163-164.

Rysunek 1. Produkcja rodników hydroksylowych i fałdowanie RNA P4-P6. A) Fe(II) katalizuje wytwarzanie rodników hydroksylowych z nadtlenku wodoru. Askorbinian redukuje Fe(III) z powrotem do żelaza żelazawego. B) Przy braku Mg(II) nie tworzy się trzeciorzędowa struktura P4-P6, która umożliwia rodnikom hydroksylowym penetrację i rozszczepianie wszystkich dostępnych pozycji szkieletu. Dodanie Mg(II) inicjuje fałdowanie P4-P6, umożliwiając rozszczepienie przez rodniki hydroksylowe tylko szkieletu dostępnego w rozpuszczalniku.

Rysunek 2. Zarys eksperymentu z śladem rodnika hydroksylowego. A) Defoforylacja i znakowanie ^{końca 32}P 5' RNA. B) Oczyszczanie ³²RNA znakowanego P na denaturującym żelu poliakrylamidowym. C) Wycięcie pasma RNA, późniejsza ekstrakcja RNA i wytrącanie etanolu. D) Wstępne fałdowanie i fałdowanie RNA. E) Dodanie świeżo przygotowanej mieszaniny reakcyjnej Fentona w celu wytworzenia rodników hydroksylowych. F) Separacja fragmentów RNA metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. G) Kwantyfikacja fragmentów RNA za pomocą oprogramowania SAFA.

Rysunek 3. Analiza fragmentów RNA po peroksydacyjnej reakcji śladu Fentona. (A) RNA wystawiono na działanie rodników hydroksylowych, a produkty rozszczepienia rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym denaturującym (PAGE). Na zdjęciu produkty rozszczepienia peroksydacyjnego o rosnącym stężeniu Mg(II). Pasy odniesienia i sterujące są oznaczone etykietami. Ten plik obrazu jest danymi wejściowymi dla programu SAFA, który określa ilościowo objętość każdego pasma. (B) Wykres "termiczny" wygenerowany przez SAFA. (C) Arkusz kalkulacyjny z wartościami odnoszącymi się do zintegrowanej gęstości pasma do liczby nukleotydów wyjściowych z SAFA jest analizowany za pomocą modelu wiązania, takiego jak równanie Hilla (1). Obszary ochrony zostały wybrane zgodnie ze wzrostem gęstości całkowej pasma w funkcji stężenia Mg(II). K_d to stężenie Mg(II), przy którym połowa RNA jest fałdowana w monitorowanym miejscu. Współczynnik Hilla, n_H, jest miarą nachylenia krzywej, która dostarcza informacji o kooperatywności wiązania i zapewnia niższe oszacowanie liczby jonów magnezu zaangażowanych w fałdowanie tego konkretnego miejsca.

Tabela 1. Reprezentatywne objętości do wytwarzania próbek RNA zawierających różne stężenia Mg(II).

Discussion

Ślad rodnika hydroksylowego jest cennym narzędziem do oceny dostępnej dla rozpuszczalnika powierzchni kwasów nukleinowych. Jakościowe i ilościowe tworzenie struktury trzeciorzędowej¹⁴ można śledzić w funkcji takich parametrów, jak rodzaj i stężenie jonów, pH, temperatura, białka wiążące lub kofaktory fałdowania. Przekonujące połączenie prostego i niedrogiego protokołu oraz wynikającej z niego dostępności rozpuszczalnika i informacji o fałdowaniu na poziomie pojedynczego nukleotydu sprawia, że metoda ta jest ba...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nazwa	firmy	Kot#
Kakodylan sodu(Uwaga! Toksyczny)	Sigma-Aldrich	C4945-25g
EDTA (0,5 M)	Woda
DEPC		Octan
(3 M)	Ambion	AM9740
MgCl2 (1 M)	Ambion	AM9530G
Mocznik	Ambion	AM9902
Sód Cytrynian	Sigma-Aldrich	W302600
tRNA	Sigma-Aldrich	R-7876
L-askorbinian sodu	Sigma-Aldrich	A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O	Sigma-Aldrich	F1543-500g
RNaza T1	Fermentas	EN0541
Nadtlenek wodoru (30%)	Sigma-Aldrich	349887