Monitorowanie zmian równowagi w strukturze RNA przez "peroksydacyjne" i "oksydacyjne" śladowanie rodników hydroksylowych

Summary

Ten protokół opisuje, jak określić ilościowo zależne od Mg(II) tworzenie trzeciorzędowej struktury RNA za pomocą dwóch metod śladu rodnika hydroksylowego.

Abstract

Cząsteczki RNA odgrywają istotną rolę w biologii. Oprócz przekazywania informacji genetycznej, RNA może składać się w unikalne struktury trzeciorzędowe, pełniąc określoną rolę biologiczną jako regulator, spoiwo lub katalizator. Informacje na temat tworzenia trzeciorzędowych kontaktów są niezbędne do zrozumienia funkcji cząsteczek RNA. Rodniki hydroksylowe (•OH) są unikalnymi sondami struktury kwasów nukleinowych ze względu na ich wysoką reaktywność i niewielkie rozmiary. ¹ Gdy jest używana jako sonda do śledzenia śladów, rodniki hydroksylowe mapują dostępną dla rozpuszczalnika powierzchnię szkieletu fosfodiestrowego DNA¹ i RNA² z rozdzielczością tak dokładną, jak pojedynczy nukleotyd. Ślad rodnika hydroksylowego może być stosowany do identyfikacji nukleotydów na powierzchni kontaktu międzycząsteczkowego, np. w kompleksach DNA-białko¹ i RNA-białko. Przejścia równowagi³ i kinetyczne⁴ można wyznaczyć, przeprowadzając ślad rodnika hydroksylowego w funkcji odpowiednio zmiennej roztworu lub czasu. Kluczową cechą footprintingu jest to, że ograniczona ekspozycja na sondę (np. "kinetyka pojedynczego trafienia") skutkuje jednolitym próbkowaniem każdego nukleotydu polimeru. ⁵

W tym artykule wideo używamy domeny P4-P6 rybozymu Tetrahymena do zilustrowania przygotowania próbki RNA i wyznaczenia izoterm fałdowania za pośrednictwem Mg(II). Opisujemy zastosowanie dobrze znanego protokołu śladu rodnika hydroksylowego, który wymaga_H2O2(nazywamy to protokołem "peroksydacyjnym") oraz cennej, ale nie powszechnie znanej alternatywy, która wykorzystuje naturalnie rozpuszczony_O2 (nazywamy to protokołem "oksydacyjnym"). Przedstawiono przegląd procedur redukcji, przekształcania i analizy danych.

Protocol

1. Przygotowanie odczynników do odciskania śladów

1. Przygotować 10-krotny bufor reakcyjny zawierający 100 mM kakodylanu sodu, 1 mM EDTA i 1 M KCl. Dostosować pH do 7,4. Przefiltrować bufor za pomocą urządzenia filtrującego octan 0,2 μM (Nalgene). Uwaga: nie pipetować RNA bezpośrednio do buforu 10x.
2. Przygotować mieszaninę reakcyjną do miareczkowania dla każdej reakcji, jak wskazano w tabeli 1. Objętość mieszaniny miareczkowej (1x bufor i Mg(II) w pożądanym stężeniu) powinna wynosić 90 μl, przed dodaniem 10 μl RNA do 1x buforu.
3. Przygotuj bufor do trawienia RNAzy T1 zawierający 6,63 M mocznika, 20 mM cytrynianu sodu, 1 mM EDTA, 0,25 μg/μl tR....

Discussion

Ślad rodnika hydroksylowego jest cennym narzędziem do oceny dostępnej dla rozpuszczalnika powierzchni kwasów nukleinowych. Jakościowe i ilościowe tworzenie struktury trzeciorzędowej¹⁴ można śledzić w funkcji takich parametrów, jak rodzaj i stężenie jonów, pH, temperatura, białka wiążące lub kofaktory fałdowania. Przekonujące połączenie prostego i niedrogiego protokołu oraz wynikającej z niego dostępności rozpuszczalnika i informacji o fałdowaniu na poziomie pojedynczego nukleotydu sprawia, że metoda ta jest ba.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nazwa	firmy	Kot#
Kakodylan sodu(Uwaga! Toksyczny)	Sigma-Aldrich	C4945-25g
EDTA (0,5 M)	Woda
DEPC		Octan
(3 M)	Ambion	AM9740
MgCl2 (1 M)	Ambion	AM9530G
Mocznik	Ambion	AM9902
Sód Cytrynian	Sigma-Aldrich	W302600
tRNA	Sigma-Aldrich	R-7876
L-askorbinian sodu	Sigma-Aldrich	A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O	Sigma-Aldrich	F1543-500g
RNaza T1	Fermentas	EN0541
Nadtlenek wodoru (30%)	Sigma-Aldrich	349887