Protokoły przygotowania, obrazowania i analizy próbek dla mikroskopii skaningowej

Summary

Opisany jest cały proces od przygotowania próbki mózgu, przez seryjne obrazowanie przekroju za pomocą mikroskopu skaningowego Knife-Edge, aż po wizualizację i analizę danych. Ta technika jest obecnie używana do pozyskiwania danych o mózgu myszy, ale ma zastosowanie do innych narządów, innych gatunków.

Abstract

Duże postępy w technikach mikroskopii 3D o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości umożliwiły pozyskiwanie dużych ilości danych neuroanatomicznych w rozdzielczości submikrometrowej. Jednym z pierwszych takich instrumentów generujących dane w skali całego mózgu jest mikroskop skaningowy Knife-Edge (KESM)^{7, 5, 9}, opracowany i przechowywany w laboratorium autorów. KESM został użyty do przekrojenia i zobrazowania całych mózgów myszy w rozdzielczości submikrometrowej, ujawniając skomplikowane szczegóły sieci neuronalnych (Golgi)^{1, 4, 8}, sieci naczyniowych (tusz indyjski)^{1, 4} i rozkładu ciała komórki (Nissl)³. Stosowanie KESM nie jest ograniczone do myszy ani mózgu. Udało nam się zobrazować mózg ośmiornicy⁶, płuco myszy i mózg szczura. Obecnie pracujemy nad całymi zarodkami danio pręgowanego. Dane takie jak te mogą w znacznym stopniu przyczynić się do badań nad konektomomiką¹⁰; do badań mikrokrążenia i hemodynamiki; oraz do badań stereologicznych poprzez dostarczenie dokładnej prawdy podstawowej.

W tym artykule opiszemy proces, w tym przygotowanie próbki (utrwalanie, barwienie i osadzanie), konfigurację i konfigurację KESM, sekcję i obrazowanie za pomocą KESM, przetwarzanie obrazu, przygotowanie danych oraz wizualizację i analizę danych. Nacisk zostanie położony na przygotowanie próbek i wizualizację/analizę uzyskanych danych KESM. Oczekujemy, że szczegółowy protokół przedstawiony w tym artykule pomoże poszerzyć dostęp do KESM i zwiększyć jego wykorzystanie.

Protocol

1. Przygotowanie próbki: Golgi-Cox

1. Protokół ten jest ściśle zgodny z protokołem Mayericha i ^wsp.7.
2. Mysz C57BL/6J jest głęboko znieczulana za pomocą znieczulenia wziewnego izofluranem, a następnie dekapitacjonowana.
3. Mózg jest usuwany i umieszczany w roztworze utrwalającym Golgiego-Coxa (1% chromianu potasu, 1% dwuchromianu potasu i 1% chlorku rtęci w wodzie dejonizowanej).
4. Mózg pozostawia się w roztworze Golgiego-Coxa w ciemności, w temperaturze pokojowej, przez 10 do 16 tygodni.
5. Mózgi są płukane w dejonizowanej wodzie przez noc w ciemności.
6. Wypłukany mózg zanurza się w 5% roztworze wodorotlenku amonu w dejonizowanej wodzie na 7 do 10 dni w ciemności w temperaturze pokojowej. Ten długi czas przygotowania miał zapewnić infiltrację całego mózgu, tak aby osad miał szansę całkowicie uformować się w tkance.
7. Mózg jest ponownie płukany w dejonizowanej wodzie o temperaturze pokojowej przez 4 godziny, a następnie odwadniany za pomocą stopniowanej serii alkoholi etylowych: 50% i 70% w lodówce (4 °C) oraz 85%, 95% (3 zmiany) i 100% (4 do 5 zmian) w temperaturze pokojowej. Mózg pozostawia się w każdym roztworze na 24 godziny.
8. Odwodniony mózg umieszcza się następnie w acetonie (3 do 4 zmian, każda przez jeden dzień), następnie mieszaninie araldit-aceton o stosunku araldytu do acetonu 1:2, 1:1, 2:1, a na końcu w 100% araldycie (3 zmiany, za każdym razem przez noc), do lodówki (4 °C).
9. Na koniec leczony mózg jest zanurzany w 100% aradycie i podgrzewany do 60 °C przez 3 dni (por. protokół osadzania w Abbott i Sotelo²).
   Jeśli próbki są osadzone w LR White, próbki są przenoszone z ostatniego 100% roztworu etanolu przez trzy zmiany roztworu LR White, z których każda jest przechowywana w lodówce przez noc, co jest standardową procedurą przed polimeryzacją. Wprowadzono trzy zmiany, aby zapewnić pełną infiltrację. Próbka jest następnie przenoszona do świeżego LR White, który jest polimeryzowany w zamkniętym pojemniku w temperaturze 60 °C przez 24 godziny, co jest wymaganą ilością czasu i temperatury dla prawidłowej polimeryzacji.
10. Ryc. 1 przedstawia mózg zabarwiony metodą Golgiego-Coxa osadzony w Araldycie.
11. Utwardzony blok próbki jest następnie montowany na metalowym pierścieniu próbki za pomocą żywicy epoksydowej, a boki bloku są przycinane w razie potrzeby (patrz rys. 2).

2. Przygotowanie próbki: Nissl

1. Protokół ten jest ściśle zgodny z protokołem Mayericha i ^wsp.7
2. Mysz jest głęboko znieczulana za pomocą ketaminy i ksylazyny wstrzykiwanych dootrzewnowo, a następnie perfuzji przezsercowej przy użyciu 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w temperaturze pokojowej (pH 7,4), a następnie 250 ml zimnego 4% buforowanego fosforanem paraformaldehydu (pH 7,4).
3. Mysz jest następnie perfundowana 100 ml roztworu 0,1% barwnika tioninowego w wodzie dejonizowanej, a ciało umieszcza się w lodówce (4 °C) na 24 godziny.
4. Po 24 godzinach mózg wyjmuje się z kalwarii i umieszcza w świeżym roztworze 0,1% tioniny i pozostawia w temperaturze 4 °C na 7 dni. Długotrwały czas trwania tej procedury miał na celu zapewnienie pełnej infiltracji tioniny do preparatu en bloc.
5. Mózg jest następnie odbarwiany i odwadniany za pomocą stopniowanej serii etanoli, zaczynając od 50% etanolu i wody i zwiększając do 100% etanolu w okresie 6 tygodni. Etanol zmieniający się od 50% do 70% jest przechowywany w lodówce (4 °C), a wszystkie zmiany etanolu powyżej 70% są przechowywane w temperaturze pokojowej.
6. Po trzech zmianach acetonu (2-4 dni w każdym roztworze w temperaturze pokojowej), mózg jest następnie zanurzany w plastiku aralditowym zgodnie z protokołem w 1.8-1.9 powyżej. Jeśli LR white jest medium do zatapiania, przestrzegany jest protokół z 1.10 powyżej.

3. Przygotowanie próbki: tusz indyjski

1. Mysz jest głęboko znieczulana przy użyciu ketaminy i ksylazyny (1,7 mg ketaminy / 0,26 mg ksylazyny na 20 gramów masy ciała) wstrzykiwanych dootrzewnowo, a następnie perfundowanych przezsercowo przy użyciu 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w temperaturze pokojowej (pH 7,4), a następnie 250 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny o temperaturze pokojowej (pH 7,4). i na koniec z 3,0 ml nierozcieńczonego atramentu indyjskiego.
2. Perfuzja całego ciała solą fizjologiczną i utrwalaczem jest niezbędna do usunięcia krwi z układu sercowo-naczyniowego i naprawienia tkanek. Perfuzja z atramentem indyjskim jest konieczna, aby całkowicie wypełnić naczynia krwionośne układu sercowo-naczyniowego.
3. Powstały mózg jest następnie odwadniany za pomocą serii stopniowanych alkoholi etylowych (25% -100%), a następnie zatapiany w plastiku aralditowym zgodnie z protokołem w 1,8-1,9 powyżej. Jeśli LR white jest medium do zatapiania, przestrzegany jest protokół z 1.10 powyżej.

4. Przygotowanie próbek: Gatunki rodzajowe, organy ogólne

1. W ogólnym przypadku utrwalanie można wykonać za pomocą 10% neutralnej buforowanej formaliny lub 4% paraformaldehydu.
2. W przypadku małych objętości tkanek do utrwalania i barwienia zaleca się dyfuzję zamiast perfuzji. W przypadku małych organizmów lub narządów barwienie można również wykonać podczas procesu odwadniania.
3. Protokół osadzania jest taki sam jak powyżej, chociaż czas infiltracji roztworu może być skrócony w przypadku narządów lub organizmów, które są znacznie mniejsze niż cały mózg myszy.

5. Konfiguracja i obrazowanie KESM

1. Wyłącz pompę, włącz scenę, włącz kamerę, włącz oświetlacz.
2. Podnieś nóż i cel.
3. Zamontuj pierścień próbki.
4. Zmierz wymiar próbki i utwórz plik konfiguracyjny dla aplikacji KESM Stage Controller2.
5. Uruchom KESM Stage Controller2 i zainicjuj stage.
6. Opuść nóż/obiektyw, włącz pompę.
7. Ustaw ostrość obiektywu i aparatu, obracając pokrętło ostrości na pociągu optycznym i regulując pole widzenia kamery względem krawędzi noża.
8. Naciśnij [Go], aby rozpocząć obrazowanie.
9. Patrz rys. 3-8. Szczegóły techniczne patrz ^{9, 7}.

6. Przetwarzanie obrazów i przygotowanie danych

1. Skopiuj plik wykonywalny KESM Stack Processor do folderu danych w folderze plików konfiguracyjnych (00000, 00001 itd.).
2. Uruchom procesor stosu KESM, aby usunąć artefakt oświetlenia i znormalizować intensywność tła na wszystkich obrazach. Powtórz te czynności dla wszystkich podfolderów danych.
3. Przygotuj kafelki wieloskalowe z zestawu danych i prześlij oraz skonfiguruj pliki na serwerze WWW KESM Brain Atlas.
4. Patrz rys. 9.

7. Wizualizacja i analiza danych

1. Wizualizacja z wykorzystaniem atlasu mózgu KESM. Przejdź do http://kesm.cs.tamu.edu i wybierz odpowiedni atlas.
   1. Nawiguj jak w mapach Google.
   2. Powiększaj i pomniejszaj jak w mapach Google.
   3. Aby przejść do innej głębokości, wybierz głębokość przejścia na każdym kroku z menu rozwijanego, a następnie kliknij [+] lub [-], aby zwiększyć lub zmniejszyć głębokość z.
   4. Dostosuj numer nakładki za pomocą menu rozwijanego.
   5. Dostosuj interwał nakładki za pomocą menu rozwijanego.
   6. Patrz rys. 11.
2. Wizualizacja za pomocą MeVisLab.
   1. Uruchom MeVisLab.
   2. Utwórz nowy projekt.
   3. Poniżej można tworzyć nowe moduły, wpisując nazwę modułu w polu polecenia.
   4. Utwórz moduł [Compose3Dfrom2DFiles] i przejdź do żądanego folderu. Wprowadź ciąg pliku i kliknij [GetFileList]. Upewnij się, że wybrane obrazy mieszczą się w pamięci. Kliknij [Create3D], aby utworzyć wolumin.
   5. Utwórz moduł [SetWorldMatrix] i ustaw "Skalę" w sekcji "Transformacje elementarne" x, y, z na odpowiedni rozmiar woksela (0,6, 0,7, 1,0 dla obiektywu 10X 0,45NA). Połącz [Compose3Dfrom2DFiles] z [SetWorldMatrix].
   6. Ustaw Matrix and Transforms w sekcji "Kompozycja matrycy" na "Ignoruj", "Ignoruj", "Dalej".
   7. Utwórz moduł [Arithmetic1] i ustaw "Function" na "Invert(Max-Img)".
      Połącz [SetWorldMatrix] z [Arytmetyka1].
   8. Utwórz moduł [View3D] i połącz [Arytmetyka1].
   9. W View3D, gdy wciśnięty jest prawy przycisk myszy, poruszaj myszą, aby dostosować próg. Możesz przycinać regiony, zmieniać orientację (poruszać myszą przy wciśniętym lewym przycisku myszy), zmieniać oświetlenie (renderowanie głośności lub MIP), włączać/wyłączać tło itp.
   10. Patrz rys. 10.

8. Reprezentatywne wyniki:

Tutaj prezentujemy dane i szczegóły dotyczące całego mózgu. Rys. 12-15 pokazują zestawy danych 1^{, 4, 3} i India Ink, Golgiego i Nissla dla całego mózgu.

Rysunek 1. Naprawiony, poplamiony i osadzony mózg myszy

Rysunek 2. Osadzona próbka mózgu myszy zamontowana na pierścieniu próbki.

Rysunek 3. Mikroskop skaningowy z ostrzem noża (KESM). Pokazano zdjęcie KESM z zaznaczonymi jego głównymi elementami: (1) szybką kamerą do skanowania liniowego, (2) obiektywem mikroskopu, (3) zespołem noża diamentowego i lekkim kolimatorem, (4) zbiornikiem próbki (do obrazowania zanurzeniowego w wodzie), (5) trzyosiowym precyzyjnym stopniem z łożyskiem powietrznym, (6) oświetlaczem mikroskopu światła białego, (7) pompą wodną (z tyłu) do usuwania wyciętej tkanki, (8) serwerem PC do kontroli etapu i akwizycji obrazu, (9) granitowa podstawa i (10) granitowy most.

Rysunek 4. Zasady obrazowania KESM. Zilustrowano zasadę działania KESM. Obiektyw i nóż są utrzymywane w miejscu, podczas gdy próbka przymocowana do stolika pozycjonującego porusza się (strzałka z linią ciągłą) z rozdzielczością 20 nm i prędkością przesuwu 1-5 i zostaje zeskrobana o nóż diamentowy (o szerokości 5 mm dla obiektywu 10X), generując cienki fragment przepływający po nożu (strzałka z ciągłą linią). Obrazowanie liniowe odbywa się w pobliżu samego czubka noża.

Rysunek 5. Sterowanie ostrością kamery KESM i obiektywu.

Rysunek 6. Montaż noża KESM i sterowanie.

Rysunek 7. Wstępne ustawianie ostrości przez port obserwacyjny.

Rysunek 8. Aplikacja KESM Stage Controller 2 (zrzut ekranu).

Rysunek 9. Aplikacja procesora stosu KESM (zrzut ekranu).

Rysunek 10. Aplikacja MeVisLab (zrzut ekranu).

Rysunek 11. KESM Brain Atlas: Interfejs sieciowy (zrzut ekranu).

Rysunek 12. Dane atramentu KESM z całego mózgu w Indiach. Wizualizacje objętości stosów danych KESM są wyświetlane dla zestawu danych naczyniowych. (a) Zbliżenie danych naczyniowych. Szerokość ~100 um. lit. b-d) Trzy standardowe widoki całego układu naczyniowego mózgu myszy (podpróbkowane z danych o wysokiej rozdzielczości). Szerokość ~10mm.

Rysunek 13. Dane Golgiego myszy KESM z całym mózgiem.

Rysunek 14. Szczegóły danych KESM Golgi.

Rysunek 15. Dane KESM dotyczące całego mózgu Nissl. a) Zbliżenie danych Nissla. ~300 um³. lit. b-d) Trzy standardowe widoki danych Nissl z całego mózgu myszy (podpróbkowane z danych o wysokiej rozdzielczości). Pokazany przekrój poprzeczny dla wyraźnego widoku struktur wewnętrznych.

Discussion

KESM pozwala na badanie na poziomie submikrometrowym dużych objętości próbek biologicznych (~1^cm3). Taka objętość wystarcza do utrzymania całych małych narządów zwierzęcych, takich jak mózgi, płuca, serca, nerki itp. Zeskanowane obrazy z takich narządów mogą dostarczyć bezprecedensowych informacji ilościowych na temat organizacji strukturalnej tych narządów i umożliwić modelowanie obliczeniowe różnych aspektów funkcjonalnych tych narządów, w tym dynamiki obwodów i sieci, właściwości elektrycznych, dynamiki przepływu płynów i powietrza oraz dynamiki mięśni.

Oczekuje się, że protokół przygotowania próbki i protokół po analizie szczegółowo opisany w tym artykule pomogą zewnętrznym grupom badawczym w łatwiejszym dostępie do KESM i uzyskanych danych. Protokół operacyjny KESM pomoże tym zewnętrznym badaczom docenić korzyści i ograniczenia tej unikalnej metody obrazowania.