Opisano pełny proces, od przygotowania preparatu mózgu, przez obrazowanie seryjnych przekrojów z wykorzystaniem mikroskopu skanującego o ostrzu noża (Knife-Edge Scanning Microscope), aż po wizualizację i analizę danych. Technika ta jest obecnie wykorzystywana do pozyskiwania danych z mózgów myszy, jednak znajduje zastosowanie również w przypadku innych organów i gatunków.
Artykuł metodologiczny
Protokoły przygotowania próbek, obrazowania i analizy dla mikroskopii skanującej krawędzią noża
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Znaczące postępy w wysokoprzepustowych technikach mikroskopii 3D o wysokiej rozdzielczości umożliwiły pozyskiwanie dużych objętości danych neuroanatomicznych z rozdzielczością submikrometryczną. Jednym z pierwszych takich instrumentów generujących dane w skali całego mózgu jest skanujący mikroskop z ostrzem noża (Knife-Edge Scanning Microscope, KESM)7, 5, 9, opracowany i znajdujący się w laboratorium autorów. KESM był wykorzystywany do sekcjonowania i obrazowania całych mózgów myszy z rozdzielczością submikrometryczną, co pozwoliło ujawnić złożone szczegóły sieci neuronowych (metoda Golgiego)1, 4, 8, sieci naczyniowych (tusz indyjski)1, 4 oraz rozmieszczenia ciał komórkowych (metoda Nissla)3. Zastosowanie KESM nie ogranicza się tylko do myszy ani wyłącznie do mózgu. Z sukcesem obrazowano za jego pomocą mózg ośmiornicy6, płuca myszy oraz mózg szczura. Obecnie prowadzimy prace nad całymi embrionami danio pręgowanego. Dane tego typu mogą w znacznym stopniu przyczynić się do badań z zakresu konektomiki10, badań nad mikrokrążeniem i hemodynamicą oraz badań stereologicznych poprzez dostarczenie dokładnych danych referencyjnych.
W niniejszym artykule opisano cały proces, obejmujący przygotowanie preparatów (utrwalanie, barwienie i zatapianie), konfigurację i ustawienie KESM, wykonywanie przekrojów oraz obrazowanie za pomocą KESM, przetwarzanie obrazów, przygotowanie danych a także wizualizację i analizę danych. Szczególny nacisk położono na przygotowanie preparatów oraz wizualizację i analizę uzyskanych danych KESM. Przewidujemy, że szczegółowy protokół przedstawiony w tym artykule pomoże w zwiększeniu dostępności do KESM oraz częstszym wykorzystywaniu tej metody.
Protokół
1. Przygotowanie preparatu: metoda Golgiego-Coxa
- Niniejszy protokół ściśle naśladuje protokół opracowany przez Mayericha i wsp.7.
- Myszy szczepu C57BL/6J poddaje się głębokiej anestezji z użyciem izofluranu w formie wziewnej, a następnie wykonuje dekapitację.
- Mózg zostaje wyjęty i umieszczony w roztworze utrwalającym Golgi-Cox (1% chromianu potasu, 1% dichromianu potasu i 1% chlorku rtęci w wodzie dejonizowanej).
- Mózg pozostawia się w roztworze Golgi-Cox w ciemności, w temperaturze pokojowej, od 10 do 16 tygodni.
- Wypłukuje się mózgi w wodzie dejonizowanej przez noc w ciemności.
- Wypłukany mózg zanurza się w 5% roztworze wodorotlenku amonu w wodzie dejonizowanej na 7 do 10 dni w ciemności w temperaturze pokojowej. Tak długi czas przygotowania miał zapewnić infiltrację całego mózgu, aby czarny osad mógł w pełni uformować się w tkance.
- Mózg płucze się ponownie w wodzie dejonizowanej w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, a następnie odwadnia poprzez stopniowe zwiększanie stężenia alkoholi etylowych: 50% i 70% w lodówce (4 °C) oraz 85%, 95% (3 wymiany) i 10% (4 do 5 wymian) w temperaturze pokojowej. Mózg pozostawia się w każdym roztworze na 24 godziny.
- Odwodniony mózg umieszcza się następnie w acetonie (3 do 4 wymian, każda przez jeden dzień), a następnie w mieszaninie aralditu z acetonem w stosunkach araldit do acetonu odpowiednio 1:2, 1:1, 2:1 i na koniec w 10% araldicie (3 wymiany, każdorazowo przez noc) w lodówce (4 °C).
- Na koniec przetworzony mózg zatapia się w 10% araldicie i podgrzewa do 60 °C przez 3 dni (por. protokół zatapiania u Abbotta i Sotelo2).
W przypadku zatapiania próbek w LR White, przenosi się je z ostatniego 10% roztworu etanolu poprzez trzy wymiany roztworu LR White, z których każda jest przechowywana w lodówce przez noc, co stanowi standardową procedurę przed polimeryzacją. Wykonuje się trzy wymiany, aby zapewnić pełną infiltrację. Próbkę przenosi się następnie do świeżego LR White, który polimeryzuje w zamkniętym pojemniku w temperaturze 60 °C przez 24 godziny, co jest wymaganym czasem i temperaturą dla prawidłowej polimeryzacji. - Rys. 1 przedstawia mózg barwiony metodą Golgi-Cox zatopiony w araldicie.
- Utwardzony blok z próbką montuje się następnie na metalowym pierścieniu do próbek za pomocą żywicy epoksydowej, a boki bloku przycina się w razie potrzeby (patrz rys. 2).
2. Przygotowanie preparatów: metoda Nissla
- Niniejszy protokół ściśle naśladuje protokół opracowany przez Mayerich i wsp.7
- Myszy podaje się głęboką narkozę przy użyciu ketaminy i ksylazyny wstrzykniętej dostronikally, a następnie przeprowadza perfuzję transkardiakalną przy użyciu 50 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (pH 7.4) w temperaturze pokojowej, a następnie 250 mL zimnej 4% paraformaldehidu w buforze fosforanowym (pH 7.4).
- Następnie przeprowadza się perfuzję myszy 10 mL roztworu 0,1% barwnika tioniny w wodzie dejonizowanej, a ciało umieszcza się w lodówce (4 °C) na 24 godziny.
- Po 24 godzinach mózg zostaje wyjęty z czaszki i umieszczony w świeżym roztworze 0,1% tioniny, a następnie pozostawiony w temperaturze 4 °C przez 7 dni. Tak długi czas trwania tej procedury miał zapewnić pełną infiltrację tioniny do preparatu en bloc.
- Następnie mózg poddaje się odbarwianiu i odwodnieniu poprzez stopniowanie stężenia etanolu, zaczynając od 50% etanolu w wodzie i zwiększając stężenie do 10% etanolu w okresie 6 tygodni. Próbki w stężeniach od 50% do 70% etanolu przechowuje się w lodówce (4 °C), a wszystkie kolejne zmiany etanolu powyżej 70% przechowuje się w temperaturze pokojowej.
- Po trzech zmianach acetonu (po 2-4 dniach w każdym roztworze w temperaturze pokojowej), mózg zostaje zatopiony w plastiku araldite zgodnie z protokołem opisanym w punktach 1.8-1.9 powyżej. W przypadku zastosowania LR white jako medium do zatapiania, stosuje się protokół opisany w punkcie 1.10 powyżej.
3. Przygotowanie preparatu: tusz indyjski
- Myszy podaje się głęboką anestezję za pomocą ketaminy i ksylazyny (1,7 mg ketaminy / 0,26 mg ksylazyny na 20 gramów masy ciała) wstrzykiwanych dostrojnie, a następnie przeprowadza perfuzję transkardialną przy użyciu 50 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (pH 7,4) o temperaturze pokojowej, po czym podaje się 250 mL 10% neutralnej formaliny buforowanej (pH 7,4) o temperaturze pokojowej, a na koniec 3,0 cc nierozcieńczonego tuszu indyjskiego.
- Perfuzja całego ciała solą fizjologiczną i utrwalaczem jest niezbędna do usunięcia krwi z układu sercowo-naczyniowego oraz utrwalenia tkanek. Perfuzja tuszem indyjskim jest konieczna, aby całkowicie wypełnić naczynia układu sercowo-naczyniowego.
- Otrzymany mózg jest następnie odwadniany w serii roztworów alkoholu etylowego o rosnącym stężeniu (25%-10%), a następnie zatapiany w plastiku araldite zgodnie z protokołem opisanym w punktach 1.8-1.9 powyżej. W przypadku zastosowania LR white jako medium do zatapiania, należy postępować zgodnie z protokołem w punkcie 1.10 powyżej.
4. Przygotowanie preparatów: gatunki generyczne, organy generyczne
- W przypadku ogólnym utrwalanie można przeprowadzić przy użyciu 10% neutralnego buforowanego formaliny lub 4% paraformaldehydu.
- Dla niewielkich objętości tkanek do utrwalania i barwienia zaleca się dyfuzję zamiast perfuzji. W przypadku małych organizmów lub organów barwienie można przeprowadzić również podczas procesu odwadniania.
- Protokół zatapiania w parafinie jest taki sam jak opisany powyżej, choć czasy infiltracji roztworami mogą zostać skrócone w przypadku organów lub organizmów znacznie mniejszych niż cały mózg myszy.
5. Konfiguracja i obrazowanie KESM
- Wyłączyć pompę, włączyć stół, włączyć kamerę, włączyć oświetlacz.
- Podnieść nóż i obiektyw.
- Zainstalować pierścień na próbkę.
- Zmierzyć wymiary próbki i utworzyć plik konfiguracyjny dla aplikacji KESM Stage Controller2.
- Uruchomić program KESM Stage Controller2 i zainicjować stół.
- Opuścić nóż/obiektyw, włączyć pompę.
- Ustawić ostrość obiektywu i kamery, obracając pokrętłem ostrości w układzie optycznym i dostosowując pole widzenia kamery względem krawędzi noża.
- Nacisnąć przycisk [Go], aby rozpocząć obrazowanie.
- Patrz Rys. 3-8. Szczegóły techniczne znajdują się w 9, 7.
6. Przetwarzanie obrazów i przygotowanie danych
- Skopiuj plik wykonywalny KESM Stack Processor do folderu z danymi, wewnątrz folderu z plikami konfiguracyjnymi (0, 01 itd.).
- Uruchom KESM Stack Processor, aby usunąć artefakty oświetlenia i znormalizować intensywność tła we wszystkich obrazach. Powtórz tę czynność dla wszystkich podfolderów z danymi.
- Przygotuj wielkoskalowe kafelki z zestawu danych, a następnie prześlij i skonfiguruj pliki na serwerze WWW KESM Brain Atlas.
- Patrz Rys. 9.
7. Wizualizacja i analiza danych
- Wizualizacja przy użyciu atlasu mózgu KESM. Przejdź pod adres http://kesm.cs.tamu.edu i wybierz odpowiedni atlas.
- Nawiguj w sposób analogiczny do map Google.
- Przybliżaj i oddalaj widok w sposób analogiczny do map Google.
- Aby przejść na inną głębokość, wybierz z menu rozwijanego wartość głębokości dla każdego kroku, a następnie kliknij [+] lub [-], aby zwiększyć lub zmniejszyć głębokość osi z.
- Dostosuj numer nakładki, korzystając z menu rozwijanego.
- Dostosuj interwał nakładki, korzystając z menu rozwijanego.
- Patrz Rys. 1.
- Wizualizacja przy użyciu MeVisLab.
- Uruchom program MeVisLab.
- Utwórz nowy projekt.
- W dalszej części nowe moduły można tworzyć, wpisując nazwę modułu w polu poleceń.
- Utwórz moduł [Compose3Dfrom2DFiles] i przejdź do wybranego folderu. Wprowadź ciąg znaków pliku i kliknij [GetFileList]. Upewnij się, że wybrane obrazy mieszczą się w pamięci. Kliknij [Create3D], aby utworzyć wolumen.
- Utwórz moduł [SetWorldMatrix] i ustaw wartości „Scale” w sekcji „Elementary Transforms” dla x, y, z na odpowiedni rozmiar woksela (0,6, 0,7, 1,0 dla obiektywu 10X 0,45NA). Połącz [Compose3Dfrom2DFiles] z [SetWorldMatrix].
- W sekcji „Matrix Composition” ustaw Matrix oraz Transforms na „Ignore”, „Ignore”, „Forward”.
- Utwórz moduł [Arithmetic1] i ustaw „Function” na „Invert(Max-Img)”.
Połącz [SetWorldMatrix] z [Arithmetic1]. - Utwórz moduł [View3D] i podłącz [Arithmetic1].
- W module View3D, trzymając prawy przycisk myszy, przesuwaj kursor, aby dostosować próg. Możesz przycinać regiony, zmieniać orientację (przesuwając mysz przy wciśniętym lewym przycisku), zmieniać oświetlenie (renderowanie wolumetryczne lub MIP), włączać/wyłączać tło itp.
- Patrz Rys. 10.
8. Reprezentatywne wyniki:
W niniejszej części prezentujemy dane oraz szczegóły dotyczące całego mózgu. Ryc. 12-15 przedstawiają zestawy danych z całego mózgu uzyskane za pomocą tuszu indyjskiego, metody Golgiego oraz barwienia Nissla 1, 4, 3.
Rycina 1. Utrwalony, barwiony i zatopiony mózg myszy
Rysunek 2. Zatopiona próbka mózgu myszy zamocowana na pierścieniu do próbek.
Rycina 3. Mikroskop skanujący z ostrzem noża (KESM). Przedstawiono zdjęcie KESM z zaznaczonymi głównymi komponentami: (1) szybka kamera skanująca liniowo, (2) obiektyw mikroskopu, (3) zespół noża diamentowego i kolimator światła, (4) zbiornik na próbkę (do obrazowania w imersji wodnej), (5) precyzyjny trójosiowy stół z łożyskami powietrznymi, (6) iluminator mikroskopu światła białego, (7) pompa wodna (z tyłu) do usuwania wycinków tkanki, (8) serwer PC do sterowania stołem i akwizycji obrazu, (9) granitowa podstawa oraz (10) granitowy most.
Rysunek 4. Zasady obrazowania KESM. Przedstawiono zasadę działania KESM. Obiektyw oraz nóż są unieruchomione, podczas gdy próbka przymocowana do stołu pozycjonującego porusza się (strzałka z linią ciągłą) z rozdzielczością 20 nm i prędkością przemieszczania 1–5, zostając zeskrobana o nóż diamentowy (o szerokości 5 mm dla obiektywu 10X), co generuje cienki przekrój przesuwający się nad nożem (strzałka z linią ciągłą). Obrazowanie liniowe (line-scan) jest wykonywane w bezpośrednim sąsiedztwie samego wierzchołka noża.
Rysunek 5. Pokrętła ustawiania ostrości kamery i obiektywu KESM.
Rysunek 6. Montaż i elementy sterujące noża KESM.
Rysunek 7. Wstępne ustawianie ostrości przez okno obserwacyjne.
Rysunek 8. Aplikacja KESM Stage Controller 2 (zrzut ekranu).
Rycina 9. aplikacja procesora stosu KESM (zrzut ekranu).
Rysunek 10. Aplikacja MeVisLab (zrzut ekranu).
Rysunek 1. Atlas mózgu KESM: interfejs internetowy (zrzut ekranu).
Rycina 12. Dane z obrazowania całego mózgu metodą KESM z użyciem tuszu indyjskiego. Przedstawiono wizualizacje wolumetryczne stosów danych KESM dla zbioru danych naczyniowych. (a(a) Zbliżenie danych naczyniowych. Szerokość ~10 μm. (b-d) Trzy standardowe widoki całej sieci naczyniowej mózgu myszy (próbkowane z danych o wysokiej rozdzielczości). Szerokość ~10 mm.
Rycina 13. Dane Golgi całego mózgu myszy KESM.
Rysunek 14. Szczegóły danych Golgi KESM.
Rycina 15. Dane z barwienia Nissla całego mózgu KESM. (aZbliżenie danych barwienia Nisslem. ~30 µm3(b-d) Trzy standardowe rzuty danych Nissla dla całego mózgu myszy (wyselekcjonowane z danych o wysokiej rozdzielczości). Przedstawiono przekrój poprzeczny w celu uzyskania wyraźnego obrazu struktur wewnętrznych.
Dyskusja
KESM umożliwia badanie dużych objętości próbek biologicznych (~1 cm3) z rozdzielczością submikrometryczną. Taka objętość jest wystarczająca do pomieszczenia całych organów małych zwierząt, takich jak mózgi, płuca, serca, nerki itp. Obrazy skanowania takich organów mogą dostarczyć bezprecedensowych ilościowych informacji o organizacji strukturalnej tych narządów oraz umożliwić modelowanie komputerowe różnych aspektów ich funkcjonowania, w tym dynamiki obwodów i sieci, właściwości elektrycznych, dynamiki przepływu cieczy i powietrza oraz dynamiki mięśniowej.
Przedstawiony w niniejszym artykule protokół przygotowania preparatu oraz protokół poanalityczny mają na celu ułatwienie zewnętrznym grupom badawczym dostępu do KESM oraz wynikowych danych. Protokół obsługi KESM pomoże tym zewnętrznym badaczom zrozumieć zalety i ograniczenia tej unikalnej metody obrazowania.
Oświadczenia
Todd Huffman jest związany z 3Scan, firmą komercyjną, która produkuje i wprowadza na rynek technologię KESM (patent USA nr 6,744,572).
Podziękowania
Projekt ten był finansowany przez NIH/NINDS (#1R01-NS54252), NSF (#0905041,#0079874), Texas Advanced Technology Program (#ATP-000512-0146-2001, #ATP-000512-0261-2001), Texas A&M Research Foundation, Departament Informatyki i Inżynierii na Texas A&M University oraz 3Scan. Chcielibyśmy podziękować Bernardowi Mesie (Micro Star Technologies) za konsultacje techniczne i wsparcie w zakresie aparatury KESM. Główne prace nad projektowaniem i wdrażaniem KESM zostały wykonane przez Bruce'a H. McCormicka, który zmarł w 2007 roku.
Bibliografia
- Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).
- Abbott, L. C., Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).
- Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).
- Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).
- Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).
- Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).
- Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).
- McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).
- Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 4/07/2013. Citeable Link.
A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.
