Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA

Podsumowanie

Opisano prostą procedurę przeprowadzania niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA. Kroki obejmują izolację RNA, znakowanie RNA i DNA referencyjnego, hybrydyzację próbek z mikromacierzami, skanowanie mikromacierzy oraz kwantyfikację i analizę sygnałów hybrydyzacji.

Streszczenie

mikroRNA (miRNA) to liczna rodzina ˜ cząsteczki RNA o długości 22 nukleotydów (nt), które są szeroko ekspresjonowane u eukariotów ¹Złożone genomy kodują co najmniej setki miRNA, które hamują głównie ekspresję ogromnej liczby genów docelowych na poziomie potranskrypcyjnym. ^{2, 3}miRNA kontrolują szeroki zakres procesów biologicznych ¹Ponadto zmieniona ekspresja miRNA była wiązana z chorobami ludzi, takimi jak nowotwory, a miRNA mogą służyć jako biomarkery chorób oraz rokowań. ^{4, 5}W związku z tym istotne jest zrozumienie ekspresji i funkcji miRNA w wielu różnych warunkach.

Do profilowania ekspresji miRNA zastosowano trzy główne podejścia: PCR w czasie rzeczywistym, mikromacierze oraz sekwencjonowanie głębokie. Technika mikromacierzy miRNA ma tę zaletę, że jest wysokoprzepustowa, zazwyczaj tańsza, a większość etapów eksperymentalnych i analitycznych można przeprowadzić w laboratorium biologii molekularnej w większości uniwersytetów, szkół medycznych i powiązanych z nimi szpitali. W niniejszej pracy opisujemy metodę przeprowadzania niestandardowych eksperymentów z użyciem mikromacierzy miRNA. Zestaw sond miRNA zostanie naniesiony na szklane slajdy w celu wytworzenia mikromacierzy miRNA. RNA izoluje się przy użyciu metody lub odczynnika, który zachowuje małe frakcje RNA, a następnie znakuje barwnikiem fluorescencyjnym. W ramach kontroli referencyjne oligonukleotydy DNA odpowiadające podzbiorowi miRNA są również znakowane innym barwnikiem fluorescencyjnym. Referencyjne DNA posłuży do wykazania jakości slajdu i hybrydyzacji, a także zostanie wykorzystane do normalizacji danych. RNA i DNA są mieszane i hybrydyzowane ze slajdem mikromacierzy zawierającym sondy dla większości miRNA znajdujących się w bazie danych. Po przemyciu slajd jest skanowany w celu uzyskania obrazów, a następnie kwantyfikuje się intensywność poszczególnych plamek. Surowe sygnały te zostaną następnie przetworzone i przeanalizowane jako dane dotyczące ekspresji odpowiadających im miRNA. Slajdy mikromacierzy można poddać procesowi usuwania sond i regeneracji w celu obniżenia kosztów oraz zwiększenia spójności eksperymentów. Te same zasady i procedury mają zastosowanie do innych rodzajów niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy.

Protokół

1. Drukowanie niestandardowych mikromacierzy miRNA

1. Wydrukuj szkiełka do mikromacierzy, korzystając z usług centralnego laboratorium mikromacierzy na uniwersytecie lub w firmie komercyjnej. Jakość wykonania mikromacierzy jest jednym z krytycznych czynników wpływających na powodzenie eksperymentu. Jeśli to możliwe, przetestuj kilka różnych usług. Idealnie byłoby wydrukować od 50 do 100 szkiełek jednocześnie, tak aby wszystkie wyglądały identycznie, z dobrze oddzielonymi, pojedynczymi plamkami.
2. Jako podłoże do mikromacierzy stosujemy szkiełka powlekane GAPS II.
3. Do sond miRNA wykorzystujemy zestaw sond NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2.
4. Rozpuść wszystkie oligonukleotydy w 3 x SSC do stężenia 10 μM i wydrukuj je na szkiełkach w czterech kopiach. Utrwal szkiełka poprzez naświetlanie promieniami ultrafioletowymi zgodnie z instrukcją dla szkiełek GAAPS II. Oznacz szkiełko za pomocą rysika diamentowego, aby wskazać obszar i stronę z wydrukowanymi sondami. Przechowuj w temperaturze 22°C.

2. Przygotowanie próbek

1. Do izolacji RNA można użyć dowolnej metody lub odczynnika, o ile zapewnia ona zachowanie małych RNA. Zazwyczaj do ekstrakcji całkowitego RNA stosujemy Trizol (Invitrogen), co pozwala uzyskać satysfakcjonującą ilość i jakość preparatów RNA, ocenianą na podstawie pomiarów A_260nm i A_280nm.
2. W celu znakowania RNA należy zmieszać ˜ 25 μg całkowitego RNA z 0,5 μg 5'-pCU-DY547-3' ⁶ w 1 x buforze (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 mM MgCl₂, 10 μg/ml BSA, 10% DMSO) zawierającym ˜ 20 jednostek ligazy RNA T4 1, uzupełnionym o ˜ 10 mM DTT oraz ˜ 0,02-0,03 objętości końcowej 10 x buforu ligazy RNA T4 1 w celu dostarczenia ATP.
3. Znakowanie powinno przebiegać na lodzie wewnątrz lodówki przez 2-24 godziny. RNA należy wytrącić za pomocą 0,3 M octanu sodu i 3 objętości etanolu. Aby zapewnić efektywną ligację i wytrącanie, całkowite RNA należy rozpuścić w stężeniu powyżej 2 mg/ml, a całkowitą objętość reakcji ligacji utrzymać na poziomie ˜ 20 μl.
   1. W przypadku dostępności mniejszej ilości RNA, ilość RNA wejściowego oraz 5'-pCU-DY547-3' można proporcjonalnie zmniejszyć.
   2. Jeśli RNA jest bardzo rozcieńczone, należy dodać nośnik, taki jak tRNA drożdżowe, aby wspomóc wytrącanie.
4. W celu stworzenia kontroli procesu hybrydyzacji należy połączyć i oznakować łącznie 1 μg oligonukleotydów referencyjnego DNA odpowiadających podzbiorowi ssaczych miRNA, używając zestawu Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit ⁶. Oznakowane DNA należy oczyścić za pomocą kolumny CentriSep i przechowywać w ciemności w temperaturze -20°C.

3. Hybrydyzacja mikromacierzy

1. Aby użyć szkiełek po raz pierwszy, należy przeprowadzić wstępną hybrydyzację szkiełek w przefiltrowanym roztworze 3 x SSC, 0,1% SDS, 0,2% BSA przez 30-60 min w temperaturze 37 °C. Zanurz je kilka razy w wodzie, a następnie w izopropanolu. Wysusz szkiełka w wirówce z adapterem do szkiełek przy 100 g przez 5 min w temperaturze 22°C.

Uwaga: Do przeprowadzania hybrydyzacji mikromacierzy wykorzystujemy komory hybrydyzacyjne do mikromacierzy firmy Corning oraz Lifterslipy z serii mSeries firmy Erie Scientific.

2. Przepłucz paski podnoszące w wodzie, a następnie w etanolu, po czym wysusz je na powietrzu. Umieść szkiełko w podstawie komory do hybrydyzacji mikromacierzy, a na szkiełku połóż pasek podnoszący. Pasek podnoszący powinien zakrywać obszar sond, tak aby jego białe paski stykały się ze szkiełkiem.
3. W ciemności odwiruj osadzone, znakowane RNA. Przepłucz je raz 70% etanolem, a następnie wysusz osad na powietrzu. Osad powinien mieć czerwonkawy kolor.
4. Przygotuj roztwór do hybrydyzacji zawierający 400 mM Na₂HPO₄ pH 7.0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% formamidu ⁶ z dodatkiem 1/15-1/100 μl oczyszczonego, znakowanego referencyjnego DNA (2.4) na każdą próbkę RNA. Ilość dodanego referencyjnego DNA zależy od liczby znakowanych różnych oligonukleotydów (2.4). Jeśli jest ich ponad 100, wymagane jest mniejsze rozcieńczenie.
5. Dokładnie rozpuść osad RNA w ˜ 60 μl roztworu do hybrydyzacji.
6. Dodaj 20 μl wody do każdego z dołków nawilżających w podstawie komory do hybrydyzacji mikromacierzy firmy Corning.
7. Nanieś mieszaninę znakowanego RNA i referencyjnego DNA na szkiełko. Używając cienkiego końcówki do pipety, delikatnie dotknij krawędzi paska podnoszącego, pozwalając roztworowi wniknąć w przestrzeń między paskiem a szkiełkiem poprzez siły kapilarne.
8. Nałóż pokrywę komory hybrydyzacyjnej na podstawę, a następnie uszczelnij komorę metalowymi klipsami.
9. Włóż całą komorę do plastikowej torebki dołączonej do kasety komory firmy Corning.
10. Umieść kasetę(y) do komory w pojemniku z wilgotnym ręcznikiem papierowym; przykryj pojemnik folią spożywczą i umieść go w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C i wysokiej wilgotności przez ˜ 24 godziny. Środki ostrożności te (3.6, 3.9, 3.10) zapewniają, że roztwór do hybrydyzacji nie wyschnie podczas inkubacji.

4. Przetwarzanie po hybrydyzacji

1. Rozmontuj kasety z komór jedna po drugiej. Zanurz szkiełko i dołączoną do niego listewkę (lifterslip) w 2 x SSC w temperaturze 22°C. Listewka naturalnie oddzieli się od szkiełka. Umieść ją w 0.8 x SSC. Przemyj szkiełka w 0.8 x SSC dwukrotnie, a następnie trzykrotnie w 0.4 x SSC, łącznie przez 1-2 min. Osusz szkiełka za pomocą wirówki z adapterem do szkiełek. Przemyj listewki wodą i zachowaj do ponownego użycia.
2. Zeskanuj szkiełka za pomocą dowolnego odpowiedniego skanera, np. Perkin Elmer ScanArray 5000 lub skanera mikromacierzy Molecular Devices Axon GenePix 4000B. Skanowanie przeprowadź przy długościach fal bliskich 547 nm i 647 nm, aby uzyskać odpowiednie pliki obrazów.
3. Użyj programów takich jak BlueFuse do kwantyfikacji intensywności pikseli w plikach obrazów wejściowych (z punktu 4.2). Przejrzyj poszczególne plamki za pomocą programu, aby wykluczyć z dalszej analizy plamki nieprawidłowe na mikromacierzach. Plamki te powstają zazwyczaj w wyniku wadliwego nadruku na szkiełku lub niewłaściwego obchodzenia się ze szkiełkiem po hybrydyzacji.
4. Do analizy i prezentacji danych wykorzystaj programy takie jak GeneSpring oraz Excel. Stosuje się ogólne zasady normalizacji danych z mikromacierzy, co wykracza poza zakres niniejszego opracowania.
5. Po uzyskaniu satysfakcjonujących sygnałów w punkcie 4.3), oczyść szkiełka mikromacierzy w celu ich ponownego wykorzystania ⁷. Przepłucz szkiełka wodą, a następnie zanurz w uprzednio podgrzanym roztworze 1 mM NaOH i 0.1 x SSC w kuwecie do barwienia w temperaturze 62°C przez 10-20 minut. Powtórz inkubację raz. Przemyj szkiełka kilka razy wodą przez maksymalnie 60 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze 22°C. Osusz szkiełka za pomocą wirówki i przechowuj w temperaturze 22°C.
6. W przypadku korzystania z regenerowanych szkiełek ponowna prehybrydyzacja nie jest konieczna. Wystarczy przemyć je wodą, a następnie izopropanolem i osuszyć bezpośrednio przed hybrydyzacją.

5. Reprezentatywne wyniki:

W dużej mierze zastosowaliśmy opisane procedury w celu profilowania globalnej ekspresji miRNA w tysiącach próbek, tj. w RNA wyizolowanym z okazów od rybek danio po ludzi w wielu różnych warunkach. Rysunek 1 przedstawia zeskanowany obraz mikromacierzy, demonstrujący bardzo precyzyjne i silne sygnały hybrydyzacji na szkiełku. Współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy powtórzeniami technicznymi hybrydyzacji mikromacierzy wynoszą ˜ 0,99 ⁷, co wskazuje na doskonałą powtarzalność.

Rycina 1 Obraz kompozytowy zeskanowanej płytki mikromacierzy miRNA po hybrydyzacji. Czerwone plamki powstały w wyniku hybrydyzacji referencyjnego DNA, zielone plamki z próbki RNA znakowanej DY547, natomiast żółte plamki powstały w wyniku hybrydyzacji zarówno DNA, jak i RNA do tych samych sond.

Dyskusja

Pomimo niedawnego postępu w technologiach głębokiego sekwencjonowania, mikromacierze pozostają opłacalnym wyborem do wysokoprzepustowej analizy DNA i RNA. W porównaniu z głębokim sekwencjonowaniem, eksperymenty z wykorzystaniem mikromacierzy są tańsze, a typowe laboratorium biologii molekularnej może przeprowadzić większość badań i analizę danych we własnym zakresie, co zapewnia elastyczność i oszczędność czasu. W przyszłości mikromacierze prawdopodobnie będą dobrze dostosowane do intensywnego badania zestawów genów, np....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Zaprojektowany na podstawie miRBase Release 9.0 (październik 2006). Zawiera ˜ 1 140 niemodyfikowanych oligonukleotydów o długości 34-44 nt służących jako sondy dla miRNA nicieni, muchy, danio pręgowanego, myszy, szczura i człowieka oraz szereg sond kontrolnych wewnętrznych, takich jak snoRNA. Sondy miRNA są dubletami sekwencji komplementarnych do dojrzałych miRNA, stąd ich rozmiar wynoszący ˜ 44 nt. Do analizy można wybrać miRNA z konkretnego genomu lub genomów, które są przedmiotem zainteresowania.
Trizol	Invitrogen	15596018	Do znakowania wykorzystano również wzbogaconą frakcję małych RNA, choć próbki całkowitego RNA są szybsze i łatwiejsze w przygotowaniu oraz kwantyfikacji i nadają się do dalszych zastosowań, takich jak analiza mRNA.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	Ten zestaw lub podobne produkty mogą być również użyte do znakowania eksperymentalnych próbek RNA lub kontrolnego RNA (zamiast kontrolnego DNA).
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Frakcję małych RNA można w podobny sposób oznakować poprzez ligację.
Kolumny CentriSep	Princeton Separations	CS-901
Przeszkło GAPSII coated slide	Corning	40004	Można stosować również inne rodzaje szkiełek.
Komory do hybrydyzacji mikromacierzy	Corning	2551 lub 40080	Inne rodzaje komór do hybrydyzacji i lamelle również powinny być skuteczne. Stosowanie komercyjnie dostępnych urządzeń do hybrydyzacji może znacząco skrócić czas hybrydyzacji, np. do ˜ 2 godzin.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies