Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z mikromacierzami mikroRNA

Summary

Opisana jest prosta procedura przeprowadzania niestandardowych eksperymentów z mikromacierzami mikroRNA. Etapy obejmują izolację RNA, znakowanie RNA i referencyjnego DNA, hybrydyzację próbek do mikromacierzy, skanowanie mikromacierzy, ilościowe określanie i analizę sygnałów hybrydyzacji.

Abstract

mikroRNA (miRNA) to duża rodzina ̃ 22 nukleotydów (nt) długich cząsteczek RNA, które są szeroko wyrażane u eukariontów ¹. Złożone genomy kodują co najmniej setki miRNA, które przede wszystkim hamują ekspresję ogromnej liczby docelowych genów po transkrypcji ^{2, 3}. miRNA kontrolują szeroki zakres procesów biologicznych ¹. Ponadto zmieniona ekspresja miRNA jest związana z chorobami ludzkimi, takimi jak nowotwory, a miRNA mogą służyć jako biomarkery chorób i rokowania ^{4, 5}. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć ekspresję i funkcje miRNA w wielu różnych warunkach.

Do profilowania ekspresji miRNA zastosowano trzy główne podejścia: PCR w czasie rzeczywistym, mikromacierze i głębokie sekwencjonowanie. Technika mikromacierzy miRNA ma tę zaletę, że jest wysokoprzepustowa, na ogół tańsza, a większość etapów eksperymentalnych i analitycznych można przeprowadzić w laboratorium biologii molekularnej na większości uniwersytetów, szkół medycznych i powiązanych szpitali. W tym miejscu opisujemy metodę wykonywania niestandardowych eksperymentów z mikromacierzą miRNA. Zestaw sond miRNA zostanie wydrukowany na szklanych szkiełkach w celu wytworzenia mikromacierzy miRNA. RNA izoluje się przy użyciu metody lub odczynnika, który zachowuje małe gatunki RNA, a następnie znakuje barwnikiem fluorescencyjnym. Jako kontrola, referencyjne oligonukleotydy DNA odpowiadające podzbiorowi miRNA są również znakowane innym barwnikiem fluorescencyjnym. Referencyjne DNA posłuży do zademonstrowania jakości szkiełka i hybrydyzacji, a także zostanie wykorzystane do normalizacji danych. RNA i DNA są mieszane i hybrydyzowane do szkiełka mikromacierzy zawierającego sondy dla większości miRNA w bazie danych. Po umyciu szkiełko jest skanowane w celu uzyskania obrazów i ilościowego określenia intensywności poszczególnych miejsc. Te surowe sygnały będą dalej przetwarzane i analizowane jako dane ekspresji odpowiednich miRNA. Szkiełka mikromacierzy mogą być demontowane i regenerowane w celu obniżenia kosztów mikromacierzy i zwiększenia spójności eksperymentów z mikromacierzami. Te same zasady i procedury mają zastosowanie do innych typów niestandardowych eksperymentów z mikromacierzami.

Protocol

1. Drukowanie niestandardowych mikromacierzy miRNA

1. Wydrukuj slajdy z mikromacierzą, korzystając z podstawowych usług wyposażenia mikromacierzy na uniwersytecie lub w firmie. Jakość wykonania mikromacierzy jest jednym z najważniejszych czynników decydujących o powodzeniu eksperymentu z mikromacierzami. Jeśli to możliwe, wypróbuj kilka usług. Idealnie byłoby, gdyby drukowało się 50-100 slajdów na raz, a wszystkie slajdy wyglądałyby identycznie, z dobrze oddzielonymi, pojedynczymi punktami.
2. Do obsługi mikromacierzy używamy szkiełek z powłoką GAPS II.
3. W przypadku sond miRNA używamy NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2.

Discussion

Pomimo ostatnich postępów w technologiach głębokiego sekwencjonowania, mikromacierze pozostają realnym wyborem do wysokoprzepustowej analizy DNA i RNA. W porównaniu z głębokim sekwencjonowaniem, eksperymenty z mikromacierzami są tańsze, a typowe laboratorium biologii molekularnej może wykonać większość eksperymentów i analiz danych we własnym zakresie, co pozwala na elastyczność i oszczędność czasu. W przyszłości mikromacierze prawdopodobnie dobrze nadają się do intensywnego badania zestawów genów, np. wszystkich lub p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Zaprojektowany w oparciu o miRBase Release 9.0 (październik 2006). Zawiera ˜ 1,140 niezmodyfikowanych, 34-44 nt długich oligonukleotydów jako sondy dla robaków, much, danio pręgowanego, myszy, szczurów i ludzi oraz szereg sond kontroli wewnętrznej, takich jak snoRNA. Sondy miRNA są dubletami sekwencji komplementarnych do dojrzałych miRNA, stąd rozmiar ˜ 44 nt. Do analizy można skupić się na miRNA z określonego genomu (genomów) będącego przedmiotem zainteresowania.
Trizol	Invitrogen	15596018	Do znakowania użyliśmy również wzbogaconej, małej frakcji RNA, chociaż próbki całkowitego RNA są szybsze i łatwiejsze do przygotowania i ilościowego określenia oraz nadają się do dalszych zastosowań, takich jak analiza mRNA.
Ligaza RNA T4 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Zestaw do znakowania kwasów nukleinowych	Invitrogen	U21660	Ten zestaw lub podobne produkty mogą być używane do oznaczania eksperymentalnych próbek RNA lub kontrolnego RNA (zamiast kontrolnego DNA).
5'-pCU-DY547-3'	Dharmacon	Wykonana na zamówienie	mała frakcja RNA może być podobnie oznaczona przez ligację.
Kolumny CentriSep	Princeton Separacje	CS-901
Prowadnica z powłoką GAPSII	Corning	40004	Można również stosować inne typy prowadnic.
Komory hybrydyzacyjne do mikromacierzy	Corning	2551 lub 40080	Inne rodzaje komór hybrydyzacyjnych i szkiełek nakrywkowych również powinny działać. Korzystanie z dostępnych na rynku maszyn do hybrydyzacji może znacznie skrócić czas hybrydyzacji, np. do ˜ 2 godziny.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies