Opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego na potrzeby inżynierii tkankowej. Przedstawiamy metody analizy zmodyfikowanego w sposób tkankowo-inżynieryjny mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym pomiar aktywnej siły generowanej podczas stymulacji elektrycznej, ocenę żywotności komórek oraz barwienie immunohistologiczne.
Artykuł metodologiczny
Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hodowla komórek w trójwymiarowym środowisku hydrożelowym jest istotną techniką opracowywania konstruktów do inżynierii tkankowej, a także badania odpowiedzi komórkowych w różnych warunkach hodowli in vitro. Środowisko trójwymiarowe dokładniej naśladuje warunki, z jakimi komórki spotykają się in vivo, dzięki zastosowaniu bodźców mechanicznych i chemicznych we wszystkich wymiarach 1. Trójwymiarowe hydrożele mogą być wykonane z polimerów syntetycznych, takich jak PEG-DA 2 i PLGA 3, lub z wielu białek naturalnie występujących, takich jak kolagen 4, kwas hialuronowy 5 czy fibryna 6,7. Hydrożele stworzone z fibryny, naturalnie występującego białka krzepnięcia krwi, mogą polimeryzować, tworząc siatkę będącą częścią naturalnych procesów gojenia ran w organizmie 8. Fibryna jest degradowalna przez komórki i potencjalnie autologiczna 9, co czyni ją idealnym tymczasowym rusztowaniem w inżynierii tkankowej.
W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych z trzydniowych szczurząt oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego do inżynierii tkankowej. Miocyty noworodkowe są powszechnie stosowanym źródłem komórek w badaniach in vitro nad formowaniem i inżynierią tkanki serca 4. Żel fibrynowy powstaje poprzez zmieszanie fibrynogenu z enzymem trombiną. Trombina odcina fibrynopeptydy FpA i FpB z fibrynogenu, odsłaniając miejsca wiązania, które oddziałują z innymi monomerami 10. Oddziaływania te powodują samozłożenie monomerów w włókna, które tworzą sieć hydrożelu. Ponieważ czas trwania tej reakcji enzymatycznej można regulować poprzez zmianę stosunku trombiny do fibrynogenu lub stosunku wapnia do trombiny, możliwe jest formowanie wtryskowe konstrukcji o wielu różnych geometriach 11,12. Ponadto możemy uzyskać wyrównanie powstałej tkanki poprzez odpowiednie ograniczenie żelu podczas hodowli 13.
Po dwutygodniowej hodowli zmodyfikowanych konstruktów tkanki serca w warunkach statycznych, komórki serca zaczynają przebudowywać konstrukt i mogą generować siłę skurczu w warunkach stymulacji elektrycznej 6. W ramach niniejszego protokołu opisujemy również metody analizy wytworzonego w procesie inżynierii tkankowej mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym analizę funkcjonalną siły aktywnej generowanej przez konstrukt mięśnia serca pod wpływem stymulacji elektrycznej, a także metody określania końcowej żywotności komórek (test Live-Dead) oraz barwienia immunohistochemiczne w celu zbadania ekspresji i morfologii typowych białek istotnych dla skurczu (ciężki łańcuch miozyny lub MHC) oraz sprzężenia komórkowego (koneksyna 43 lub Cx43) między miocytami.
Protokół
1. Izolacja kardiomiocytów noworodkowych - przygotowanie (dzień wcześniej)
Roztwory przygotowane w tej sekcji: roztwór PBS-glukozy, medium zatrzymujące.
- Przygotuj roztwór PBS-glukozy, dodając 5 mL penicyliny-streptomycyny (odpowiednio 100 jednostek/ml i 100 μg/ml) oraz 1,98 g glukozy do 250 ml sterylnego 1x roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), a następnie dopełnij objętość roztworu do 500 ml dodatkowym sterylnym 1x PBS.
- Przygotuj medium zatrzymujące, dodając 25 ml FBS i 5 ml penicyliny-streptomycyny (w tym samym stężeniu co powyżej) do 250 ml sterylnej pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), a następnie dopełnij objętość do 500 ml sterylnym DMEM przed sterylną filtracją przez filtr 0,2 mikrona.
- Zsterylizuj w autoklawie narzędzia chirurgiczne niezbędne do izolacji: kleszczyk hemostatyczny, pincetę nr 5, duże nożyczki, mikronożyczki oraz rękojeść skalpela (nr 4).
2. Izolacja kardiomiocytów noworodkowych - przygotowanie (dzień zbioru
Należy dbać o zachowanie sterylności
Roztwory użyte w tej sekcji: roztwór PBS z glukozą, Betadine
- Dla każdego miotu przygotuj dwie sterylne szalki Petriego o średnicy 100 mm, umieść je w komorze z laminarnym przepływem powietrza i napełnij ˜10 mL lodowatego PBS-glucose. Następnie należy umieścić je w pojemniku z lodem wewnątrz sterylnej komory.
- Umieść w komorze zlewkę o pojemności 250 mL zawierającą 30-40 mL Betadine.
- Wlej do butelki 50 mL/miotu PBS-glucose, szczelnie zamknij i umieść w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
- Dla każdej osoby rozłóż chłonny podkład na powierzchni roboczej komory, a na nim połóż sterylną draperię, uważając, aby nie dotknąć centralnego obszaru roboczego draperii. Wysyp narzędzia chirurgiczne oraz gazik 4 x 4 na sterylną draperię, nie dotykając narzędzi. Otwórz sterylną głowicę skalpela nr 20 i wysyp ją na draperię, ponownie uważając, aby nie dotknąć jej niesterylnymi rękawiczkami.
- Zabierz szczenięta od matki, umieść je w nieprzezroczystym pojemniku, a następnie przenieś do komory.
- Załóż sterylne rękawiczki.
- Złóż gazik na cztery części, zaciśnij kleszczykami hemostatycznymi i umieść w zlewce z Betadine.
- Załóż ostrze skalpela na rękojeść i odłóż na bok.
3. Izolacja kardiomiocytów noworodkowych - disekcja serca
Roztwory użyte w tej sekcji: Betadine, roztwór PBS-glukoza
- Chwyć szczenię niedominującą ręką, ściskając skórę między łopatkami kciukiem i palcem wskazującym. Używając dużych nożyczek, oddziel głowę szczenięcia jednym cięciem. Należy przeciąć od tyłu szczenięcia do przodu, aby upewnić się, że kręgosłup został całkowicie przecięty.
- Przetrzyj klatkę piersiową szczenięcia gazą nasączoną betadyną. Unieruchom szczenię, ściskając łopatki. Wykonaj częściową torakotomię, aby odsłonić serce. Zwiększ nacisk, wypychając serce poza żebra w celu przeprowadzenia sekcji skalpelem.
- Przesuń ostrze skalpela za sercem, aby przeciąć główne naczynia i wyciąć serce. Umieść serce w szalce Petriego zawierającej PBS-glucose znajdującej się w lodzie.
- Powtórz kroki 1-3 dla każdego szczenięcia w miocie.
4. Izolacja kardiomiocytów noworodkowych - izolacja miocytów
Roztwory przygotowane/użyte w tej sekcji: roztwór PBS-glukoza, roztwór kolagenazy, roztwór zatrzymujący
- Po wyizolowaniu serc należy usunąć resztki krwi i tkanki łącznej poprzez płukanie w lodowatym roztworze PBS-glukozy, odciąć górną 1/3 serca, aby wyizolować jedynie tkankę komór, a następnie umieścić ją w nowej płytce Petriego z wcześniej przygotowanym lodowatym roztworem PBS-glukozy.
- Serca należy ostrożnie posiekać na kawałki o wielkości ˜1 mm³ za pomocą mikronożyczek i pęsety.
- Za pomocą sterylnej pipety transferowej, po uprzednim odcięciu końcówki nożyczkami tak, aby otwór pipety miał średnicę ˜3 mm, przenieść fragmenty tkanki wraz z całym roztworem do probówki stożkowej 50 ml i umieścić na lodzie.
- Odważyć 15 000 jednostek kolagenazy typu II na miot szczeniąt (liczba jednostek/mg zależy od serii) i dodać do butelki z wcześniej przygotowanym, podgrzanym do 37°C roztworem PBS-glukozy w celu przygotowania roztworu kolagenazy. Dobrze wymieszać i przefiltrować przez filtr sterylny do oddzielnej butelki. Umieścić ponownie w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Do kąpieli wodnej 37°C należy włożyć również roztwór stopujący.
- Pozostawić posiekaną tkankę do czasu opadnięcia na dno probówki wirnikowej. Usunąć nadsącz, aż całkowita objętość wyniesie ˜10 mL. Do probówki wirnikowej dodać 7 ml roztworu kolagenazy.
- Probówkę stożkową z fragmentami tkanki i kolagenazą umieścić w statywie na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora lub pieca o temperaturze 37°C. Włączyć wytrząsarkę orbitalną z prędkością około 60 rpm i zamknąć drzwi. Ustawić timer na 7 minut. Należy pamiętać o ponownym umieszczeniu kolagenazy w kąpieli wodnej, aby utrzymać jej temperaturę.
- Po sygnale timera przenieść probówkę stożkową z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Do komory przenieść również podgrzaną kolagenazę i roztwór stopujący. Delikatnie potraktować fragmenty tkanki pipetą (titracja) 5-7 razy, aby je rozbić. Po titracji pozwolić fragmentom opaść na dno (2-3 minuty). Odessać jak największą ilość nadsączu, uważając, aby nie wciągnąć fragmentów tkanki. Następnie dodać do fragmentów tkanki 7 ml roztworu kolagenazy i ponownie umieścić w inkubatorze na wytrząsarce na 7 minut.
- W każdym kolejnym kroku delikatnie przeprowadzić titrację 10 razy, aby rozbić fragmenty tkanki. Po opadnięciu tkanek odessać nadsącz i zebrać go w oddzielnej probówce stożkowej 50 ml. Do fragmentów tkanki dodać 7 ml kolagenazy i ponownie trawić przez 7 minut. Do probówki z nadsączem, po każdym dodaniu nadsączu z procesu trawienia, dodać 10 mL roztworu stopującego za pomocą innej pipety serologicznej.
- Powtarzać czynność do momentu zużycia całej kolagenazy (łącznie 7 kroków).
- Po ostatnim etapie trawienia przenieść probówkę z zawiesiną komórkową i przefiltrować ją przez sito komórkowe 70μm do nowej probówki stożkowej.
- Odwirować komórki przy 100g przez 5 minut i resuspender w 20 mL DMEM w celu policzenia za pomocą komory licznikowej (hemocytometru), a następnie umieścić komórki na lodzie.
- Nanieść 50 μl komórek do roztworu błękitu Trypanu (75 μl błękitu Trypanu, 125 μl PBS), dobrze wymieszać, a następnie nanieść 10 μl do komory licznikowej w celu policzenia. Żywe komórki są przezroczyste, natomiast martwe zabarwiają się na niebiesko. Należy spodziewać się około 3 milionów komórek z jednego szczenięcia szczura, przy żywotności około 80-90%.
5. Odlewanie konstruktów z żelu fibrynowego - przygotowanie do tworzenia żeli fibrynowych (wykonane z dużym wyprzedzeniem)
Roztwory przygotowane w tej sekcji: roztwór zapasowy fibrynogenu, roztwór zapasowy trombiny, roztwór Pluroniców, pożywka do konstruktów mięśnia sercowego.
- Przygotować roztwór zapasowy fibrynogenu o stężeniu 33 mg/mL w 20 mM buforze HEPES w 0,9% soli fizjologicznej, powoli mieszając fibrynogen w buforowanym HEPES roztworze soli fizjologicznej przez kilka godzin w temperaturze 37°C. Pozostawić roztwór do ustabilizowania się przez noc w temperaturze 2-8°C. Podgrzać roztwór do 37°C. Roztwór poddać sterylnej filtracji za pomocą serii kolejnych filtrów: sitka komórkowe 40 μm, filtry nakręcane na butelkę 0,45 μm z wstępnymi filtrami szklanymi oraz filtry nakręcane na butelkę 0,2 μm z wstępnymi filtrami szklanymi. Roztwór rozdzielić na aliquoty po 1 mL i 3 mL i przechowywać w temperaturze -20°C.
- Przygotować roztwór zapasowy trombiny o stężeniu 25 U/mL, dodając 500 U trombiny do 18 mL 0,9% soli fizjologicznej i 2 mL sterylnej wody dejonizowanej, przefiltrować sterylnie przez filtr 0,2 μm, rozdzielić na aliquoty po 500 μl i 250 μl i zamrozić w temperaturze -80°C.
- Przygotować 5% (m/v) roztwór Pluronic F-127, rozpuszczając 50 g Pluronic F-127 w 700 mL wody dejonizowanej. Dopełnić objętość roztworu do 1L dodatkową wodą dejonizowaną. Przefiltrować sterylnie filtrem 0,2 μm. Roztwór Pluronic można wykorzystać do trzech razy przed wymianą, pod warunkiem sterylnej filtracji po każdym użyciu.
- Przygotować pożywkę do konstruktów mięśnia sercowego, dodając do DMEM 10% surowicy konia, 2% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 6 mg/mL kwasu -aminokapronowego. Bezpośrednio przed podaniem pożywki należy dodać 50 μg/ml kwasu askorbinowego i 2 μg/ml insuliny w 25 μM HEPES.
- Złożyć trzpień, łącząc pręt teflonowy, tulejkę teflonową, dwie podkładki teflonowe z wycięciem w celu wstrzyknięcia oraz dwie gumowe uszczelki O-ring (patrz Rys. 2a). Autoklawować przed użyciem.
- Wykorzystać obudowy strzykawek 6cc jako zewnętrzną część formy oraz obudowy strzykawek 3cc jako tłoki; przygotować je, odcinając końcówki luer-lock i poddając autoklawowaniu (patrz Rys. 2a).
6. Odlewanie konstruktów z żelu fibrynowego - przygotowanie do tworzenia żeli fibrynowych (bezpośrednio przed wykonaniem konstruktów z żelu fibrynowego)
Roztwory użyte w tej sekcji: roztwór Pluroników
- Przed użyciem przefiltruj sterylnie 5% roztwór Pluronics F-127 za pomocą filtra 0,2 μm. Umieść trzpienie i obudowy strzykawek w 5% roztworze Pluronics w zlewce o pojemności 1 L w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Pozostaw części w roztworze Pluronics na 2-3 godziny w komorze, aby zapewnić pełne pokrycie. Roztwór Pluronics pokrywa trzpienie i zapobiega przyleganiu żelu fibrynowego do ich powierzchni.
- Po 2-3 godzinnej inkubacji wlej 5% roztwór Pluronics z powrotem do butelki, rozłóż sterylne obrusy na powierzchni komory i załóż sterylne rękawiczki w celu przygotowania form.
- Włóż przygotowane trzpienie do obudów strzykawek o pojemności 6 cc, używając strzykawki 3 cc jako tłoka, aby zapewnić szczelne dopasowanie między pierścieniami uszczelniającymi (o-ringami) a podkładkami teflonowymi.
7. Odlewanie konstrukcji z żelu fibrynowego metodą wtrysku
Roztwory przygotowane w tej sekcji: roztwór F, roztwór T, roztwór komórkowy.
- Aby przygotować 1 mL żelu fibrynowego (końcowe stężenie fibrinogenu 3,3 mg/mL, końcowe stężenie trombiny 25 U/mL), należy przygotować roztwór F w probówce stożkowej, dodając 112 μl roztworu zapasu fibrinogenu do 558 μl buforu HEPES 20 mM w 0,9% roztworze soli fizjologicznej. W osobnej probówce stożkowej należy przygotować roztwór T, dodając 17 μl roztworu zapasu trombiny oraz 1,3 μl 2 N roztworu Ca++ do 135 μl DMEM. Patrz Tabela 1.
- W trzeciej probówce stożkowej należy przygotować zawiesinę komórkową poprzez odwirowanie komórek i resuspensję w objętości takiej, aby stężenie komórek wynosiło 29,4 miliona komórek/mL, czyli 6-krotność pożądanej końcowej koncentracji komórek w konstrukcie.
- Przed przystąpieniem do odlewania konstrukcji z żelu fibrynowego należy przygotować strzykawkę 1 mL z igłą 18G o długości 1 ½ cala. Należy mieć przygotowaną również igłę 21G o długości 1 cala.
- Roztwór fibrynowy przygotowuje się w stosunku 4:1:1 (roztwór F : roztwór T : zawiesina komórkowa). Aby uzyskać jeden mL żelu, należy dodać 667 μL roztworu F do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 mL, następnie 167 μL zawiesiny komórkowej, a na koniec 167 μl roztworu T. Roztwory należy wymieszać za pomocą pipety, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Po zmieszaniu roztworów reakcja rozpoczyna się i należy niezwłocznie przystąpić do wstrzykiwania konstrukcji.
- Należy użyć wcześniej przygotowanej strzykawki z igłą 18G i pobrać roztwór fibrynowy. Należy uważać, aby nie odwracać strzykawki do góry dnem, by zapobiec przedostaniu się pęcherzyków powietrza do igły. Następnie należy wymienić igłę 18G na igłę 21G. Strzykawkę należy delikatnie opukać, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
- Strzykawkę należy włożyć do formy pomiędzy zatyczką a obudową, prowadząc wzdłuż rowka w teflonowym pierścieniu O-ring, i wstrzyknąć roztwór do formy. Formę należy przechylić tak, aby rowek znajdował się na górze, co zapewni całkowite wypełnienie. Po wyjęciu strzykawki należy kontynuować wypełnianie pozostałych form. Można przygotować wystarczającą ilość roztworu żelu, aby wypełnić kilka form jednocześnie. Jednak ze względu na szybkie żelowanie roztworu, zasadniczo zaleca się ograniczenie liczby wstrzykiwanych konstrukcji w jednym czasie do 6.
- Formy należy owinąć Parafilmem w grupach po trzy i umieścić w inkubatorze lub piecu w temperaturze 37° C. Żele powinny inkubować się w formach przez 20 minut, aby zapewnić czas na polimeryzację.
- Każdy słoik hodowlany (słoik Nalgene o prostych ściankach) należy wypełnić 21 mL pożywki do konstruktów mięśnia sercowego na jeden konstrukt. Należy użyć sterylnej obudowy strzykawki 3 cc jako tłoka, aby wypchnąć trzpień z konstruktem do dużej szalki Petriego z DMEM. Następnie konstrukt należy umieścić w słoiku z próbką. Każdy słoik 16 oz może pomieścić do 6 konstruktów, natomiast słoik 4 oz może pomieścić 2.
- Słoiki należy zakręcić i przenieść do inkubatora. Wewnątrz inkubatora należy poluzować nakrętki słoików, aby umożliwić wymianę gazową.
- Po 24 godzinach należy użyć sterylnego zgłębnika stomatologicznego i odsunąć konstrukt od białych teflonowych pierścieni O-ring na końcach formy pierścieniowej, aby zapewnić równomierne wyrównanie konstrukcji (patrz Rycina 2 w reprezentatywnych wynikach).
8. Techniki analizy (po 2 tygodniach hodowli) - badanie siły skurczu
Roztwory użyte w tej sekcji: DMEM, pożywka do konstruktów mięśnia sercowego.
- Przypnij zaciski krokodylkowe z przewodu prowadzącego od stymulatora do przewodów elektrod w kąpieli. Włącz płytkę akwizycji danych, generator impulsów i przetwornik siły. Przetwornik siły powinien zostać przełączony na ustawienie 5g i wytarowany. Otwórz dedykowany program LabView, który wyświetla i zapisuje dane z przetwornika siły. Dla każdej próbki utwórz nowy, pusty plik tekstowy w folderze danych.
- Umieść DMEM w kąpieli wodnej o temperaturze 37° C i odczekaj, aż się ogrzeje przed testowaniem konstruktów. Po ogrzaniu przelej 37°C DMEM do kąpieli z medium w systemie pomiaru siły (patrz Rys. 3A).
- Wyjmij konstrukt z słoika z próbką, delikatnie zsuwając pierścień konstruktu z podparcia teflonowego za pomocą pęsety, i umieść konstrukt na stałym metalowym słupku w kąpieli z medium w systemie pomiaru siły. Nie chwytaj konstruktu pęsetą! Zamiast tego użyj pęsety, aby popchnąć i unieść konstrukt z podparcia trzpienia.
- Umieść drugi koniec konstruktu na ramieniu przetwornika i dociśnij, aż przetwornik wskaże 0.50V (w przybliżeniu 1.0 g siły lub 10 mN napięcia).
- Wybierz plik tekstowy, w którym mają zostać zapisane dane dotyczące siły skurczu.
- Na stymulatorze serca (Model # S88X, Grass Technologies) ustaw napięcie impulsu na 20V (8 V/cm), czas trwania 6ms oraz częstotliwość 1 Hz.
- Rozpocznij stymulację elektryczną, naciskając przycisk „output on/off”.
- Rozpocznij rejestrację, aż kształt fali stanie się regularny.
- Ostrożnie wyjmij konstrukt z kąpieli z medium w systemie pomiaru siły i umieść go z powrotem w medium hodowlanym. Następnie usuń DMEM z kąpieli z medium w systemie pomiaru siły i zastąp go świeżym, ciepłym DMEM w celu analizy kolejnych próbek.
- Przetnij konstrukt i rozwiń go, aby móc zmierzyć jego długość i szerokość.
- Podziel konstrukt na sekcje, które zostaną wykorzystane do dodatkowych pomiarów analitycznych, w tym oceny żywotności, badań histologicznych lub analizy western blot.
9. Techniki analizy (po 2 tygodniach hodowli) - Test Live-Dead w celu oceny żywotności (przy użyciu zestawu Invitrogen Live/Dead Assay)14:
Roztwory użyte w tej sekcji: roztwór zapasowy EthD-1, roztwór zapasowy kalceiny AM, PBS
- Przepłucz próbki trzykrotnie, wykonując płukanie przez 5 minut w PBS.
- Dodaj 20 μl roztworu stokowego EthD-1 o stężeniu 2 mM do 10 mL sterylnego PBS i wymieszaj na wstrząsarze wirowym (vortex), aby zapewnić dokładne wymieszanie.
- Dodaj 5 μl roztworu stokowego kalceiny AM o stężeniu 4 mM do roztworu EthD-1. Ponownie wymieszaj na wstrząsarze wirowym, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
- Dodaj odpowiednią objętość powyższego roztworu, aby pokryć konstrukt.
- Inkubuj pod przykryciem (aby zapobiec fotobleachingowi barwników) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Usuń barwniki i zastąp je ciepłym PBS. Obserwuj i rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Kalceina jest wzbudzana światłem o długości 494 nm i emituje światło o długości 517 nm, natomiast etydium homodimer-1 jest wzbudzany światłem o długości 528 nm i emituje światło o długości 617 nm. Przykładowe wyniki przedstawiono na Rysunku 4.
10. Techniki analizy (po 2 tygodniach hodowli) - immunohistochemia dla kluczowych białek miocytów:
Roztwory użyte w tej sekcji: PBS, 4% paraformaldehyd w PBS, 5% surowica osła w PBS, przeciwciała w PBS, 0,1 ng/mL Hoechst 33258 w PBS.
- Przemyć próbki, wykonując 3 razy 5-minutowe płukania w PBS.
- Utrwalić w 4% roztworze paraformaldehydu w PBS przez 2-3 godziny w temperaturze 4°C
- Przemyć próbki, wykonując 3 razy 5-minutowe płukania w PBS.
- Próbkę można teraz zablokować w materiale, pociąć na skrawki i zabarwić zgodnie z wybranym protokołem. Pozostała część niniejszego protokołu dotyczy barwienia całego konstruktu do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Należy pamiętać, że czasy inkubacji są dłuższe niż w przypadku tkanek pociętych na skrawki, ponieważ przeciwciała potrzebują więcej czasu na dyfuzję do wnętrza konstruktu. Ponadto wszystkie pozostałe etapy przeprowadza się w temperaturze pokojowej.
- Dodać do próbek 0,1% Triton-X w PBS na 30 minut w celu permeabilizacji błon komórkowych.
- Przemyć próbki, wykonując 3 razy 10-minutowe płukania w PBS.
- Dodać do próbek 5% surowicy osiołowej w PBS na 1,5 godziny, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał wtórnych do próbek.
- Dodać do próbek przeciwciała pierwotne przeciwko Connexin 43 (rozcieńczenie 1:50) oraz Myosin Heavy Chain (rozcieńczenie 1:100) w PBS na 3 godziny. Aby kolejno oznakować oba białka, należy upewnić się, że przeciwciała pierwotne pochodzą od różnych gatunków zwierząt gospodarzy (np. królika i myszy).
- Przemyć próbki, wykonując 3 razy 10-minutowe płukania w PBS.
- Dodać odpowiednie przeciwciała wtórne znakowane fluorescencyjnie w PBS na 3 godziny.
- Przemyć próbki, wykonując 3 razy 10-minutowe płukania w PBS
- Bezpośrednio przed obrazowaniem próbek pod mikroskopem konfokalnym dodać 0,1 ng/ml Hoechst 33258 w PBS na 15 minut.
- Przemyć próbki, wykonując 3 razy 10-minutowe płukania w PBS.
- Przeanalizować ekspresję MHC i Cx43 w próbkach, obrazując komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego (przykładowy wynik przedstawiono na rysunku 4).
11. Reprezentatywne wyniki / Efekty:
Konstrukt fibrynowy z kardiomiocytami początkowo pokrywa całą szerokość formy (Rysunek 2B). W konstrukcie nie powinno być pęcherzyków powietrza, a jego struktura powinna być jednolita na całej długości. Po dwóch tygodniach hodowli konstrukt kurczy się do około 1/4 początkowej szerokości (Rysunek 2C).
Kiedy konstrukcja jest stymulowana elektrycznie w naszym autorskim urządzeniu do pomiaru siły skurczu (Rysunek 3A), można uzyskać dane dotyczące siły skurczu pojedynczego, jak pokazano na Rysunku 3B. Kształt fali może być analizowany oddzielnie w programie MATLAB (MathWorks) w celu określenia siły, szybkości skurczu oraz szybkości rozkurczu. Oczekiwane siły skurczu pojedynczego wynoszą około 1,3 mN 6.
Żywotność komórek w konstrukcie zależy od jego głębokości, co wynika z ograniczeń dyfuzji tlenu do wnętrza struktury. Na powierzchni konstruktu, Ryc. 4A, obserwuje się wysoką żywotność komórek. W badaniu z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej, Ryc. 4B, widoczna jest uporządkowana struktura konstruktu dzięki obecności ciężkiego łańcucha miozyny (MHC), który jest kluczowy dla skurczu i został zaznaczony kolorem czerwonym. Konneksyna 43, zaznaczona kolorem zielonym, jest niezbędna do sprzężenia komórkowego między miocytami.
Rysunek 1: Przegląd procesu enkapsulacji
Rysunek 2: A) Oddzielne i połączone elementy formy do tworzenia żeli fibrynowych. Od lewej do prawej: dwie podkładki teflonowe, dwa silikonowe o-ringi, pręt teflonowy, rurka teflonowa, gotowy trzpień, obudowa zewnętrzna trzpienia oraz tłok). B) Konstrukt na formie bezpośrednio po wyrzuceniu z obudowy zewnętrznej (dzień 0). C) Skonsolidowany konstrukt na formie (czerwona strzałka) po 13 dniach hodowli.
Rysunek 3: A) Autorski system pomiaru siły skurczu do rejestrowania siły drżenia. Przetwornik siły z trzpieniem mierzy siłę skurczu i przesyła wyniki do komputera. Kąpiel zawierająca dwie elektrody węglowe z przewodami jest połączona ze stymulatorem elektrycznym, który stymuluje konstrukt. Dwa trzpienie utrzymują konstrukt w miejscu. B) Przykładowe dane przebiegu siły drżenia wygenerowane przy stymulacji elektrycznej z częstotliwością 0.5 Hz.
Rysunek 4: A) Analiza Live/Dead konstruktu, dzień 13 (pasek skali = 400 μm). Kolor zielony oznacza żywe komórki, a czerwony martwe komórki. B) Obraz konfokalny ciężkiego łańcucha miozyny (czerwony), koneksyny 43 (zielony) i barwienia jąder Hoescht (niebieski) (pasek skali = 10 μm).
| roztwór F | roztwór T | Roztwór do hodowli komórek | |||
| Fibrynogen | 112 μl | Trombina | 17 μl | Komórki w DMEM | 170 μl |
| HEPES | 558μl | Ca++ | 1.3 μl | ||
| DMEM | 152 μl | ||||
| Suma | 670 μl | Całkowity | 170 μl | Suma | 170 μl |
Tabela 1. Roztwory żelu fibrynowego, ilości na 1 mL żelu.
Uwaga: Fibrynogen = 33 mg/mL fibrynogenu w 20 mM soli buforowanej HEPES
HEPES = 20 mM soli buforowanej HEPES
Trombina = roztwór 25 U/mL w 0,81% roztworze NaCl
Ca++ = 2 N roztwór chlorku wapnia
Dyskusja
Enkapsulacja kardiomiocytów noworodków szczura w żelach fibrynowych pozwala na uzyskanie spójnego i żywotnego trójwymiarowego modelu in vitro systemu mięśnia sercowego. Fibryna jest preferowanym biomateriałem, ponieważ uwięzione w niej komórki pozostają metabolicznie aktywne i są zdolne do kompakcji, przebudowy oraz odtworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej zgodnej z natywną tkanką serca 12. Dzięki temu, że kardiomiocyty mogą układać się w tym środowisku w sposób uporządkowany, ich funkcjonalność jest bardziej charakterystyczna dla mięśnia sercowego, co skutkuje większą siłą skurczu w porównaniu z tkankami izotropowymi 6. W przypadku potencjalnych zastosowań terapeutycznych niezbędne jest enkapsulowanie komórek w materiale, który sprzyja zarówno ich żywotności, jak i funkcjonalności. Przedstawione tutaj protokoły demonstrują wydajny i precyzyjny sposób tworzenia sieci fibrynowej w celu kontrolowania zachowania komórek serca w trójwymiarowym mikrośrodowisku.
Podczas tworzenia i hodowli tych konstruktów mogą wystąpić pewne potencjalne problemy. Jednym z nich jest utrzymanie żywotności komórek przed enkapsulacją, co znacząco wpływa na funkcjonalność konstruktu. Należy dążyć do ograniczenia śmierci komórek po izolacji poprzez skrócenie czasu między izolacją a enkapsulacją komórek w żelu fibrynowym. Konstrukty powinny otrzymywać świeżą pożywkę co drugi dzień zgodnie ze ścisłym harmonogramem. Ponadto ważne jest zapewnienie homogeniczności wszystkich używanych roztworów. Jeśli mieszanina fibrynogenu, trombiny i komórek utworzy niejednorodne środowisko, zdolność komórek do przebudowy ECM, sprzężenia mechanicznego i kontrakcji może zostać ograniczona. Istotne jest również zapobieganie powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas wstrzykiwania konstruktów, aby uniknąć przerw w ciągłości inżynieryjnej tkanki. Jednym ze sposobów na rozwiązanie tego problemu jest nabranie do strzykawki większej ilości żelu, niż jest wymagane do wykonania konstruktu, i powolne wstrzykiwanie. Na koniec, gdy matryca fibrynowa stężeje i pozostanie w pożywce przez 24 godziny, niezbędne jest oddzielenie konstruktu od ścianek formy pierścieniowej, aby wspomóc komórkową kompakcję żelu fibrynowego. Utrzymanie konstruktu w środku formy ułatwia wymianę gazową i dostarczanie składników odżywczych. Przyleganie do ścianek formy pierścieniowej może również zakłócić pożądane ustawienie komórek.
Należy zauważyć, że w niniejszym protokole jako metoda eutanazji stosowana jest dekapitacja w stanie świadomości, co jest metodą dopuszczalną zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health oraz American Veterinary Medical Association. Niemniej jednak niektóre instytucje zalecają stosowanie znieczulenia przed dekapitacją u noworodków szczurów. Wybraliśmy dekapitację w stanie świadomości, ponieważ zapewnia ona minimalny czas przebywania w warunkach hipoksji dla wyciętej tkanki/komórek serca. Relatywnie niewielki stopień hipoksji może prowadzić do niedokrwienia miocytów i potencjalnie do ich śmierci, co mogłoby znacząco wpłynąć na wyniki niniejszego protokołu.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez National Institutes of Health - National Heart, Lung and Blood Institute (grant nr R00HL093358 dla L.D.B.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S7653 | PBS |
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9333 | PBS |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Sigma-Aldrich | S7907 | PBS |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma-Aldrich | P5655 | PBS |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G5400 | Izolacja |
| hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | Izolacja |
| pinceta precyzyjna | Fine Science Tools | 11251-20 | Izolacja |
| nożyczki duże | Fine Science Tools | 91401-14 | Izolacja |
| mikronożyczki | Fine Science Tools | 91501-09 | Izolacja |
| uchwyt do skalpela | Fine Science Tools | 10008-13 | Izolacja |
| ostrze skalpela | Fisher Scientific | 08-918-5A | Izolacja |
| Chłonna podkładka laboratoryjna | VWR international | 56617-014 | Izolacja |
| sterylna sterylnym obłożeniem | Fisher Scientific | GM42526 | Izolacja |
| worek do autoklawowania | Fisher Scientific | 01-812-54 | Izolacja |
| gazik | Fisher Scientific | 13-761-52 | Izolacja |
| betadyna | Purdue Products L.P. | 67618-150-01 | Izolacja |
| rękawiczki sterylne | Fisher Scientific | 19-020 | Izolacja |
| sterylna pipeta transferowa | Fisher Scientific | 9962 | Izolacja |
| kolagenaza | Worthington Biochemical | CLS2 | Izolacja |
| pręt teflonowy o średnicy 1/4 cala | McMaster-Carr | 8546K11 | Część formy |
| rurka teflonowa ID 1/4 cala, OD 1/2 cala | McMaster-Carr | 8547K31 | Część formy |
| silikonowy pierścień O-Ring ID 1/4 cala, OD 1/2 cala | McMaster-Carr | 9396K204 | Część formy |
| rurka teflonowa ID 1/4 cala, OD 5/16 cala | McMaster-Carr | 52355K14 | Część formy |
| strzykawki Kendall monoject 6cc | Fisher Scientific | 05-561-41 | Część formy |
| strzykawka BD 3cc | Fisher Scientific | 309585 | Część formy |
| Fibrynogen wołowy | Sigma-Aldrich | F8630 | Konstrukt |
| Trombina wołowa | Sigma-Aldrich | T7513 | Konstrukt |
| 1 M HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Konstrukt |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S7653 | Konstrukt |
| DMEM | Invitrogen | 10569 | Konstrukt |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Konstrukt |
| Chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | 383147 | Konstrukt |
| filtr 0,2 mikrona | Fisher Scientific | SCGVT05RE | Konstrukt |
| sitka do komórek 40 mikronów | Fisher Scientific | 22-363-547 | Konstrukt |
| filtr nakrętkowy 0,45 mikrona | Corning | 430627 | Konstrukt |
| szklany przefiltrowywacz | EMD Millipore | AP2007500 | Konstrukt |
| igła 18G o długości 1 1/2 cala | Fisher Scientific | 14-826-5D | Konstrukt |
| igła 21G o długości 1 cala | Fisher Scientific | 14-826C | Konstrukt |
| słoiki do konstruktów | Fisher Scientific | 2116 | Konstrukt |
| Penicylina-streptomycyna | Invitrogen | 15140 | Pożywka |
| surowica konia | Sigma-Aldrich | H1138 | Pożywka |
| płodowa surowica wołowa | Invitrogen | 16000 | Pożywka |
| kwas aminokapronowy | Acros Organics | 103305000 | Pożywka |
| kwas askorbinowy | Sigma-Aldrich | A5960 | Pożywka |
| insulina | Sigma-Aldrich | I9278 | Pożywka |
| Paraformaldehyd, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Histologia |
| Optimal cutting temperature (OCT) | Ted Pella, Inc. | 27050 | Histologia |
| 2-metylobutan | Fisher Scientific | 03551-4 | Histologia |
| Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko mysiemu MYH1/2/4/6 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32732 | Histologia |
| Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko króliczej Koneksynie 43 | Cell Signaling Technology | 3512 | Histologia |
| Przeciwciało wtórne anty-mysie od osła sprzężone z Dylight 549 | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | Histologia |
| Przeciwciało wtórne anty-królicze od osła sprzężone z Dylight 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-485-152 | Histologia |
| Test Live/dead | Invitrogen | L-3224 | Analiza |
Bibliografia
- Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype. Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).
- Guarnieri, D. Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters. Acta. 6, 2532-2539 (2010).
- Krebs, Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering. Acta. 5, 2847-2859 (2009).
- Zimmermann, W. -H. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature. 12, 452-458 (2006).
- Chung, C., Burdick, J. A. Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis. Tissue engineering. 15, (2009).
- Black, L. D. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).
- Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).
- Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).
- Jockenhoevel, S. Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).
- Ryan, E. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
- Williams, C. Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs. Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).
- Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. A fibrin-based arterial media equivalent. Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 Forthcoming.
- Invitrogen. >LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells. , Invitrogen. (2005).
Przedruki i uprawnienia
