Opracowanie prostego, jednodniowego schematu przepływu pracy w diagnostyce patogenów bakteryjnych umożliwia szybkie rozpoznanie zakażeń krwi. Uwzględnienie ośmiu istotnych klinicznie celów bakteryjnych oraz ich profili oporności na antybiotyki dostarcza lekarzowi wstępnych informacji tego samego dnia, co może prowadzić do zastosowania bardziej odpowiedniej terapii.
Artykuł metodologiczny
Jednodniowy schemat przepływu pracy dla wykrywania patogenów bakteryjnych i badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe z posiewów krwi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zakażenia krwi wiążą się z wysokim wskaźnikiem śmiertelności ze względu na prawdopodobne wystąpienie sepsy, sepsy ciężkiej oraz wstrząsu septycznego1. Dlatego też szybkie wdrożenie odpowiedniej antybiotykoterapii ma kluczowe znaczenie w leczeniu zakażeń krwi. Krytycznym elementem tego procesu jest czas, który w dużym stopniu zależy od wyników identyfikacji bakteryjnej oraz testów wrażliwości na antybiotyki. Oba te parametry są rutynowo ustalane za pomocą metod hodowlanych, które są czasochłonne i zajmują średnio 24-48 godzin2, 4. Celem badania była opracowanie testów opartych na DNA do szybkiej identyfikacji zakażeń krwi, a także szybkich testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Pierwszy test to analiza real-time PCR oparta na eubakteryjnym 16S rDNA, uzupełniona o sondy specyficzne dla gatunków lub rodzajów5. Dzięki zastosowaniu tych sond można było rozróżnić bakterie Gram-ujemne, w tym Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa oraz Escherichia coli, a także bakterie Gram-dodatnie, w tym Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp. oraz Streptococcus pneumoniae. Dzięki zastosowaniu tego testu wielosondowego wstępna identyfikacja drobnoustroju sprawczego była możliwa już po 2 h.
Po drugie, opracowaliśmy półmolekularny test wrażliwości na antybiotyki dla S. aureus, Enterococcus spp. oraz (facultatywnych)tlenowych pałeczek Gram-ujemnych6. Test ten oparto na badaniu, w którym do pomiaru wzrostu bakterii wykorzystano PCR7. Bakterie pobrane bezpośrednio z posiewów krwi inkubowano przez 6 h z wybranymi antybiotykami, a następnie przeprowadzono analizę real-time PCR z użyciem Sybr Green w celu określenia zahamowania wzrostu. Połączenie tych dwóch metod mogłoby pozwolić na wybór odpowiedniej antybiotykoterapii jeszcze tego samego dnia (Rysunek 1). Podsumowując, analiza molekularna zarówno w zakresie identyfikacji, jak i wrażliwości na antybiotyki stanowi szybszą alternatywę dla wykrywania patogenów i może usprawnić diagnostykę zakażeń krwi.
Protokół
CZĘŚĆ I: IDENTYFIKACJA PATOGENU
1. Przygotowanie próbek
Uwaga: Cały proces molekularny opisany w poniższym protokole powinien być przeprowadzony zgodnie z zaleceniami dotyczącymi zapewnienia jakości w diagnostyce molekularnej3.
- Do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml należy dodać 0,1 ml posiewu krwi do 0,9 ml 0,9% NaCl, aby uzyskać próbkę rozcieńczoną 1:10. (Rozcieńczyć, aby zapobiec inhibicji qPCR).
- Wirować próbkę z prędkością 13 40 x g przez 5 min w celuywyciężenia bakteryjnego DNA.
- Resuspender osad bakteryjny w 100 μl sterylna woda demineralizowana2O.
- Przechowywać próbkę DNA w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
2. Analiza identyfikacyjna: PCR 16s rDNA w czasie rzeczywistym
- Przygotować mieszaniny reakcyjne w następujący sposób. Analiza składa się z czterech oddzielnych reakcji dla każdej próbki. Każda mieszanina zawiera 12,50 μl master mixu, 0,9 μM prawego primera (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3)7, 0,6 μM lewego primera (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3)8 oraz panel sond. Ilość sond dla każdej z czterech oddzielnych reakcji podano poniżej.
- Pierwsza reakcja zawiera:
- 0,2 μM sondę uniwersalną (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGGCAC-3-BHQ1)8
- 0,2 μM sondę P. aeruginosa (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
- Druga reakcja zawiera:
- 0,2 μM sondę E. coli (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
- 0,2 μM sondę Pseudomonas spp. (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
- Trzecia reakcja zawiera:
- 0,2 μM sondę Staphylococcus spp. (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
- 0,2 μM sondę S. aureus (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACAT-3-BHQ1)
- 0,2 μM sondę Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
- Czwarta reakcja zawiera:
- 0,2 μM sondę uniwersalną (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
- 0,3 μM sondę Streptococcus spp. (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
- 0,2 μM sondę S. pneumoniae (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
- Dodać sterylną wodę demineralizowaną H2O do osiągnięcia całkowitej objętości 20 μl. Przenieść po 20 μl każdej mieszaniny reakcyjnej dołków płyty PCR 96-dołkowej.
- Dodać 5 μl próbki do każdego dołka.
- Uszczelnić płytę PCR 96-dołkową za pomocą folii samoprzylepnej.
- Przeprowadzić reakcję na systemie ABI PRISM 790HT Real Time PCR, stosując następujące optymalne warunki cyklicznego termocyklowania:
- Podgrzewanie wstępne w 50 °C przez 10 min
- Denaturacja początkowa w 95 °C przez 15 min
- 42 cykle:
- Denaturacja w 95 °C przez 15 s
- Prisprzymilanie w 60 °C przez 1 min
3. Analiza wyników
W zakładce Analysis Settings dostosuj próg analizy Ct do wartości 0,1. Ustaw zakres linii bazowej (baseline) na Start (Cycle): 6 oraz End (Cycle): 15.- Zapisz wartość progu cyklu (Ct) dla wszystkich próbek. Wartość odcięcia, przy której wynik PCR uznaje się za dodatni, można ustawić na Ct równy 35. Ilość bakterii obecnych w posiewach krwi wynosiła od 107 do 101 CFU/ml, co generowało wartości Ct poniżej 35.
CZĘŚĆ II: BADANIE PODATNOŚCI NA ANTYBIOTYKI
4. Izolacja bakterii z dodatnich posiewów krwi9
- Odssać 5 ml pożywki z butelki z dodatnim wynikiem posiewu krwi i przenieść ją do probówki z separatorem serum.
- Wirować probówkę z separatorem serum przy 20 x g przez 10 min.
- Odlać nadosad z probówki z separatorem serum.
- Przenieść bakterie z warstwy żelu w probówce za pomocą sterylnego temu kota do 0,9% soli fizjologicznej, aż do uzyskania zawiesiny o mętności 0,5 według standardu McFarland.
5. Inokulacja płytek mikrotitracyjnych
- Rozcieńczyć zawiesinę 0,5 McFarland w podwójnie skoncentrowanym bulionie Mueller Hinton II, aby otrzymać zawiesinę o stężeniu 5 x 105 CFU/ml.
- Przenieść tę zawiesinę do dołków płytki mikrotytracyjnej zawierającej zestaw wybranych antybiotyków (Tabela 1).
- Inkubować płytkę mikrotytracyjną w temperaturze 37 °C przez 6 h.
- Przechowywać alikwot zawiesiny w temperaturze 4 °C (jako ujemną kontrolę wzrostu).
- Po 6 h inkubacji przenieść zawartość każdego dołka do sterylnej probówki, a także próbkę ujemnej kontroli wzrostu przechowywaną w 4 °C.
- Odwirować probówki przy 160 x g przez 5 min.
- Ostrożnie usunąć nadfiltr, nie naruszając osadu bakteryjnego.
- Resuspendować osad w sterylnej wodzie demineralizowanej H2O.
- Rozcieńczyć próbki 10-krotnie w sterylnej wodzie demineralizowanej H2O.
6. PCR 16s rDNA w czasie rzeczywistym10
- Przygotować mieszaninę PCR w następujący sposób:
- 12,50 μl iQ SYBR Green Supermix
- 0,5 μM starter forward 16S-1 (5-TGGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)1
- 0,25 μM starter reverse 16S-2 (5-TACCGCGGCTGGCAC-3)1
- sterylna zdemineralizowana H2O do uzyskania całkowitej objętości 20 μl
- Nanieść 20 μl mieszaniny PCR do dołków 96-dołkowej płyty PCR.
- Dodać 5 μl próbki do każdego dołka.
- Zapieczętować 96-dołkową płytę PCR za pomocą folii samoprzylepnej.
- Przeprowadzić reakcję na systemie do detekcji PCR w czasie rzeczywistym MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System, stosując następujące optymalne warunki cyklizacji termicznej:
- Denaturacja wstępna przy 95 °C przez 4 min
- Przyłączanie starterów wstępne przy 65 °C przez 30 s
- 35 cykli:
- Denaturacja przy 95 °C przez 15 s
- Przyłączanie starterów przy 60 °C przez 1 min
- Analiza krzywej topnienia (od 60-95 °C w ciągu 20 min ze wzrostem o 0,57 °C)
7. Analiza wyników
- Oblicz wartość progową Ct, korzystając z jednego z poniższych wzorów (w zależności od rodzaju antybiotyku).
- Ogólnie:
Wartość progowa Ct = wartość Ct kontroli wzrostu dodatniej + 0,5 x (wartość Ct kontroli wzrostu ujemnej - wartość Ct kontroli wzrostu dodatniej) - Piperacylina, piperacylina/tazobaktam i ceftazydym w przypadku pałeczek Gram-ujemnych; amoksycylina, oksacylina i trimetoprim/sulfametoksazol w przypadku S.aureus; amoksycylina w przypadku Enterococcus spp.: Wartość progowa Ct = wartość Ct kontroli wzrostu dodatniej + 0,25 x (wartość Ct kontroli wzrostu ujemnej - wartość Ct kontroli wzrostu dodatniej)
- Ogólnie:
- Jako kontrolę wzrostu dodatnią zastosuj próbkę inkubowaną w sterylnej zdemineralizowanej H2O.
- W zależności od mikroorganizmu zastosuj odpowiednią kontrolę wzrostu ujemną:
- Pałeczki Gram-ujemne: próbka inkubowana z mieszaniną antybiotyków
- Enterococcus spp.: próbka przechowywana w temperaturze 4 °C
- S.aureus: próbka przechowywana w temperaturze 4 °C
- Określ wrażliwość (S) lub oporność (R) szczepu na badany antybiotyk w następujący sposób:
- Wartość Ct wyższa od wartości progowej Ct wskazuje na wrażliwość
- Wartość Ct niższa od wartości progowej Ct wskazuje na oporność
8. Reprezentatywne wyniki
Wybrano dwa organizmy modelowe, tj. Gram-ujemną bakterię E. coli oraz Gram-dodatną S. aureus, aby zobrazować połączoną procedurę wykrywania i identyfikacji patogenów bakteryjnych oraz określania ich profilu przeciwdrobnoustrojowego. Pierwsza część protokołu obejmuje identyfikację patogenu. Zaprojektowano specyficzne sondy do wykrywania ośmiu istotnych klinicznie mikroorganizmów. W obecności celu zawartego w panelu bakteryjnym generowane są krzywe amplifikacji i obliczane wartości Ct (Rysunek 2). Wartość odcięcia (cut-off), powyżej której wynik PCR uznaje się za dodatni, ustalono na wartość Ct równą 35. Na Rysunku 2A przedstawiono profil identyfikacji posiewu krwi zakażonej E. coli. Uniwersalna sonda 16S została zawarta w dwóch oddzielnych mieszaninach reakcyjnych i w konsekwencji wygenerowała dwie krzywe amplifikacji (Ct wynoszące 25,20 i 25,95). Trzeci sygnał pochodzi z sondy specyficznej dla E. coli (Ct wynoszące 27,04). Identyfikację posiewu krwi zakażonej S. aureus przedstawiono na Rysunku 2B. Uniwersalna sonda 16S wykazuje sygnały amplifikacji o wartościach 3,35 i 33,71. Dwa pozostałe sygnały pochodzą z sond specyficznych dla Staphylococcus spp. oraz S. aureus (Ct wynoszące 32,48 i 30,59).
Po pierwszej części protokołu znany jest mikroorganizm sprawczy i można określić profil przeciwdrobnoustrojowy. Rysunek 3 przedstawia przykład wykresu amplifikacji z testu wrażliwości na antybiotyki dla szczepu E.coli, który pokazano również na Rysunku 2A. Każda linia reprezentuje jeden antybiotyk, z którym inkubowano próbkę bakterii. Próbka z niską wartością Ct oznacza próbkę, w której nastąpił wzrost w obecności antybiotyku, co wskazuje na oporność na testowany antybiotyk. Przeciwnie, wysoka wartość Ct reprezentuje próbkę, w której nie nastąpił wzrost ze względu na skuteczne działanie antybiotyku, co wskazuje na wrażliwość na testowany antybiotyk. Tabela 1 ilustruje określanie profilu przeciwdrobnoustrojowego izolatów E. coli oraz S. aureus. Przedstawiono wszystkie wartości Ct, a przy użyciu wzorów wymienionych w tekście protokołu (7.1) obliczono dwie wartości progowe Ct (cut-off), aby odróżnić oporność od wrażliwości. Szczep jest oporny na antybiotyk, jeśli zgłoszona wartość Ct jest niższa niż obliczona wartość progowa Ct (i odwrotnie).
Rycina 1. Schemat procedury identyfikacji patogenów i badania wrażliwości na antybiotyki z wykorzystaniem techniki real-time 16S rDNA PCR.
Rysunek 2. Test identyfikacyjny: Wykresy amplifikacji i wartości progowe cyklu (wartości Ct). Pozytywną posiew krwi wykrywa uniwersalna sonda 16S rDNA, natomiast sondy specyficzne służą do identyfikacji patogenu sprawczego. A. wykres amplifikacji posiewu krwi zawierającego E. coli; B. wykres amplifikacji posiewu krwi zawierającego S. aureus; Pseu ae, *Pseudomonas aeruginosa*; uni, uniwersalna sonda 16S; Ecoli, Escherichia coli sonda; Pseu sp, Pseudomonas sonda spp.; S. pneu, Streptococcus pneumoniae sonda; Strep sp., Streptococcus sonda spp.; Entero, Enterococcus sonda spp.; S. aureus, Staphylococcus aureus sonda; Staph sp, Gronkowiec sonda spp.
Rysunek 3. Wykres amplifikacji badania wrażliwości na antybiotyki w przypadku an E. coli izolować (próbka 1). Każda krzywa reprezentuje jeden antybiotyk, z którym inkubowano szczep. Wczesny sygnał jest spowodowany wysoką mianowitością bakterii, co oznacza, że szczep wyrósł w obecności badanego antybiotyku, a zatem jest na niego oporny. Późne sygnały wskazują, że szczep nie wyrósł w obecności antybiotyku, innymi słowy, jest on dla niego wrażliwy.
| Próbka 1: E. coli | Próbka 2: S. aureus | ||||
| AST | Ct | R/S | AST | Ct | R/S |
| Amoksycylina 8 mg/L | 16,83 | R | Amoksycylina 0,25 mg/L | 21,03 | R |
| Amoksycylina-klawulanian 8/4 mg/L | 17,36 | R | Oksacylina 2 mg/L | 25,80 | S |
| Piperacylina 16 mg/L | 16,67 | R | Wankomycyna 2 mg/L | 25,20 | S |
| Piperacylina-tazobaktam 16/4 mg/L | 24,15 | S | Gentamycyna 4 mg/L | 25,86 | S |
| Cyprofloksacyna 1 mg/L | 29,72 | S | Trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg/L | 24,62 | S |
| Ceftazydym 1 mg/L | 24,03 | S | |||
| Ceftazydym 8 mg/L | 26,58 | S | |||
| Gentamycyna 4 mg/L | 29,83 | S | |||
| Trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg/L | 27,60 | S | |||
| Negatywna kontrola wzrostu (mieszanina antybiotyków) | 30,41 | Negatywna kontrola wzrostu (próbka przechowywana w 4 °C) | 27,42 | ||
| Pozytywna kontrola wzrostu | 16,90 | Pozytywna kontrola wzrostu | 20,2 | ||
| Wartość Ct odcięcia 1* | 21,76 | Wartość Ct odcięcia 1*** | 23,82 | ||
| Wartość Ct odcięcia 2** | 18,75 | Wartość Ct odcięcia 2**** | 2,02 | ||
| * Dla amoksycyliny, amoksycyliny-klawulanianu, cyprofloksacyny, gentamycyny, trimetoprim-sulfametoksazolu ** Dla piperacyliny, piperacyliny-tazobaktamu, ceftazydymu | *** Dla wankomycyny i gentamycyny **** Dla amoksycyliny, oksacyliny i trimetoprim-sulfametoksazolu |
Tabela 1. Wyznaczanie wrażliwości na antybiotyki dla dwóch próbek (E.coli i S.aureus). Wartości Ct z testu PCR zostały skopiowane do tego pliku Excel, który automatycznie oblicza dwie wartości progowe Ct dla dodatniej i ujemnej kontroli wzrostu, korzystając ze wzorów przedstawionych w tekście protokołu. Jeśli dla danego antybiotyku wartość Ct jest niższa od wartości progowej Ct, szczep jest oporny na ten antybiotyk; jeśli wartość Ct była wyższa od wartości progowej, szczep jest wrażliwy.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół umożliwia szybką identyfikację patogenów i zapewnia funkcjonalny profil przeciwdrobnoustrojowy, co może prowadzić do wczesnego podania odpowiednich antybiotyków, poprawiając tym samym rokowania pacjentów z zakażeniami krwi. Warunki testowania mogą być dostosowane w zależności od wymaganych parametrów, takich jak niski koszt, wysoka przepustowość czy minimalny czas oczekiwania na wynik. Cała procedura może zostać przeprowadzona w ciągu jednego dnia roboczego. Co więcej, dwie części protokołu mogą być wykonywane równolegle, co znacząco skraca czas oczekiwania na wynik. Przedstawiony tutaj panel identyfikacyjny stanowi zestaw najistotniejszych klinicznie bakterii występujących w naszym szpitalu. Ponieważ główną zasadą jest celowanie w region genu 16S, można zaprojektować i dodać do testu specyficzne sondy dla innych mikroorganizmów. Kompletny test był pierwotnie przeznaczony do szybkiej analizy posiewów krwi, ale może być również wykorzystywany do przetwarzania innych materiałów próbkowych. Dotyczy to również antybiotyków wykorzystywanych do badania wrażliwości na antybiotyki: w zależności od lokalnych wzorców oporności i wytycznych można dodać więcej lub inne antybiotyki.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Profileringsfonds azM (PF245).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorek sodu (NaCl) | Merck Chemicals | 106404 | 0.9% w wodzie |
| Probówka Vacutainer SST z separatorem serum 5 ml | BD Diagnostic Systems | 367986 | |
| Pożywka płynna Mueller Hinton II | BD Diagnostic Dystems | 212322 | 44 g/L w wodzie |
| Wirówka Rotixa 50 rs | Andreas Hettich GmbH Co. KG | 4910 | |
| Wirówka 5415 D | Eppendorf | Wycofana z produkcji | |
| Startery | Sigma-Aldrich | n.d. | |
| Sondy | Sigma-Aldrich/Applied Biosystems | n.d. | |
| TaqManEnvironmental master mix 2.0 | Applied Biosystems | 4396838 | |
| iQ SYBRGreen Supermix | Bio-Rad Laboratories BV | 170-8880 | |
| Optyczna płytka reakcyjna MicroAmp 96-dołkowa | Applied Biosystems | N8010560 | |
| Optyczna folia klejąca MicroAmp | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Płytki PCR iQ 96-dołkowe | Bio-Rad Laboratories BV | 223-9441 | |
| Uszczelki klejące Microseal B | Bio-Rad Laboratories BV | MSB-1001 | |
| System detekcji PCR w czasie rzeczywistym | Applied Biosystems | ABI PRISM 7900HT | |
| System detekcji PCR w czasie rzeczywistym | Bio-Rad Laboratories BV | MyiQ Single-Color |
Bibliografia
- Wallet, F. Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood. Clin. Microbiol. Infect. 16, 774(2010).
- Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges. J. Clin. Microbiol. 41, 3119(2003).
- Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l, Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics. Acta. Clin. Belg. 66, 33(2011).
- Peters, R. P. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect. Dis. 4, 751(2004).
- Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures. J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).
- Beuving, J. Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective. PLoS ONE. 6, (2011).
- Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing. J. Antimicrob. Chemother. 54, 538(2004).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257(2002).
- Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels. J. Clin. Microbiol. 36, 2052( ).
- Vliegen, I. Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene. J. Microbiol. Meth. 66, 156(2006).
- Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 41, 1447(2003).
Przedruki i uprawnienia
