Jednodniowy schemat przepływu pracy do wykrywania patogenów bakteryjnych i testowania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe na podstawie posiewów krwi

Summary

Projekt prostego, jednodniowego schematu pracy do diagnostyki patogenów bakteryjnych umożliwia szybkie rozpoznawanie infekcji krwi. Uwzględnienie ośmiu klinicznie istotnych celów bakteryjnych i ich profili oporności na antybiotyki daje klinicyście wstępny wgląd w ten sam dzień, co może prowadzić do bardziej odpowiedniej terapii.

Abstract

Zakażenia krwi są związane z wysoką śmiertelnością z powodu prawdopodobnej manifestacji sepsy, ciężkiej sepsy i wstrząsu septycznego¹. Dlatego szybkie podanie odpowiedniej antybiotykoterapii ma pierwszorzędne znaczenie w leczeniu zakażeń krwi. Kluczowym elementem w tym procesie jest czas, który w dużym stopniu zależy od wyników identyfikacji bakterii i badania wrażliwości na antybiotyki. Oba te parametry są rutynowo uzyskiwane za pomocą testów opartych na kulturach, które są czasochłonne i trwają średnio 24-48 godzin^{2, 4}. Celem pracy było opracowanie testów opartych na DNA do szybkiej identyfikacji zakażeń krwi, a także szybkich testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Pierwszym testem jest eubakteryjny test PCR w czasie rzeczywistym oparty na rDNA 16S, uzupełniony sondami specyficznymi dla gatunku lub rodzaju⁵. Za pomocą tych sond można było wyróżnić bakterie Gram-ujemne, w tym Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli, a także bakterie Gram-dodatnie, w tym Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp. i Streptococcus pneumoniae. Korzystając z tego testu wielosondowego, pierwszą identyfikację mikroorganizmu sprawczego przeprowadzono po 2 godzinach.

Po drugie, opracowaliśmy półmolekularny test do badania wrażliwości na antybiotyki Gram-ujemnych pałeczek S. aureus, Enterococcus spp. i (fakultatywnych) tlenowych pałeczek Gram-ujemnych⁶. Test ten opierał się na badaniu, w którym do pomiaru wzrostu bakterii⁷ zastosowano PCR. Bakterie pobrane bezpośrednio z posiewów krwi są inkubowane przez 6 godzin z doborem antybiotyków, a po teście PCR w czasie rzeczywistym opartym na Sybr Green określa zahamowanie wzrostu. Połączenie tych dwóch metod może wpłynąć na wybór odpowiedniej antybiotykoterapii tego samego dnia (ryc. 1). Podsumowując, analiza molekularna zarówno identyfikacji, jak i wrażliwości na antybiotyki stanowi szybszą alternatywę dla wykrywania patogenów i może poprawić diagnostykę zakażeń krwi.

Protocol

CZĘŚĆ I: IDENTYFIKACJA PATOGENU

1. Przygotowanie próbki

Uwaga: Cały proces molekularny, jak opisano w poniższym protokole, powinien być wykonywany zgodnie z zaleceniami dotyczącymi zapewnienia jakości w diagnostyce molekularnej³.

1. Dodać 0,1 ml podwielokrotności posiewu krwi do 0,9 ml 0,9% NaCl do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać próbkę rozcieńczoną w stosunku 1:10. (Rozcieńczyć w celu zapobieżenia zahamowaniu qPCR).
2. Odwirować próbkę o masie 13400 x g przez 5 minut w celu osadzenia bakteryjnego DNA.
3. Zawiesić osad bakteryjny w 100 μl sterylnego demineralizowanego_H2O.
4. Przechowywać próbkę DNA w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

2. Test identyfikacyjny: 16-sekundowy PCR rDNA w czasie rzeczywistym

1. Przygotować mieszaniny reakcyjne w następujący sposób. Test składa się z czterech oddzielnych reakcji na próbkę. Każda mieszanina zawiera 12,50 μl mieszanki wzorcowej, 0,9 μM startera doprowadzającego (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3)⁷, 0,6 μM startera odwrotnego (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3)⁸ oraz panel sond. Ilość sond jest podana dla każdej z czterech oddzielnych reakcji poniżej.
2. Pierwsza reakcja obejmuje:
   • Sonda uniwersalna 0,2 μM (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)⁸
   • Sonda 0,2 μM P. aeruginosa (5-JOE-CCAAAACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
3. Druga reakcja obejmuje:
   • Sonda 0,2 μM E. coli (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
   • Sonda 0,2 μM Pseudomonas spp. (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
4. Trzecia reakcja obejmuje:
   • Sonda 0,2 μM Staphylococcus spp. (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
   • Sonda złocista 0,2 μM (5-FAM-AGATGTGCAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
   • 0,2 μM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
5. Czwarta reakcja obejmuje:
   • Sonda uniwersalna 0,2 μM (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
   • 0,3 μM sonda Streptococcus spp. (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
   • Sonda 0,2 μM S. pneumoniae (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
6. Dodać sterylny zdemineralizowany_H2O, aby osiągnąć całkowitą objętość 20 μl. Dodać 20 μl każdej mieszaniny reakcyjnej do dołków 96-dołkowej płytki PCR.
7. Dodać 5 μl próbki do każdego dołka.
8. Użyj folii samoprzylepnej, aby uszczelnić 96-dołkową płytkę PCR.
9. Uruchomić płytkę w systemie ABI PRISM 7900HT Real Time PCR, stosując następujące optymalne warunki cykli termicznych:
   • Podgrzewanie w temperaturze 50 °C przez 10 min
   • Wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 15 min
   • 42 cykle
     • Denaturacja w temperaturze 95 °C przez 15 s
     • Wyżarzanie w temperaturze 60 °C przez 1 min

3. Analiza wyników

1. 
   Dostosuj próg analizy Ct do 0,1 w zakładce Ustawienia analizy. Zawęź konfiguracje linii bazowej do Początek (cykl):6 i Koniec (cykl):15.
2. Zapisać wartość progową cyklu (Ct) dla wszystkich próbek. Wartość odcięcia, aby uznać wynik PCR za pozytywny, można ustawić na wartość Ct wynoszącą 35. Ilość bakterii obecnych w posiewach krwi wahała się od 10 7 do 10¹¹ CFU/ml, generując wartości Ct poniżej 35.

CZĘŚĆ II: TESTOWANIE WRAŻLIWOŚCI NA ANTYBIOTYKI

4. Izolacja bakterii z dodatnich posiewów krwi⁹

1. Odessać 5 ml bulionu z butelki z dodatnim wynikiem posiewu krwi i przenieść go do probówki separatora surowicy.
2. Odwirować probówkę separatora surowicy o sile 2000 x g przez 10 minut.
3. Odrzucić sklarowany osad z probówki separatora surowicy.
4. Przenieś bakterie z warstwy żelu w tubce za pomocą sterylnego bawełnianego wacika do 0,9% soli fizjologicznej, aż do uzyskania standardowej zawiesiny 0,5 McFarlanda.

5. Inokulacja mikropłytek miareczkowych

1. Rozcieńczyć 0,5 zawiesiny McFarlanda w podwójnie skoncentrowanym bulionie Mueller Hinton II, aby uzyskać zawiesinę 5 x 10⁵ jtk/ml.
2. Dodać tę zawiesinę do studzienek płytki z mikromianem zawierającej wybór antybiotyków (Tabela 1).
3. Inkubować mikropłytkę do miareczkowania w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.
4. Przechowywać podwielokrotność zawiesiny w temperaturze 4 °C (jako ujemną kontrolę wzrostu).
5. Po 6 godzinach inkubacji przenieść zawartość każdej studzienki do sterylnej probówki, jak również ujemną próbkę kontrolną wzrostu, która była przechowywana w temperaturze 4 °C.
6. Odwirować probówki o stężeniu 16000 x g przez 5 minut.
7. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu bakteryjnego.
8. Zawiesić osad w sterylnym demineralizowanym_H2O.
9. Rozcieńczyć próbki 10-krotnie w sterylnym demineralizowanym_H2O.

6. 16-sekundowy PCR¹⁰ z użyciem rDNA w czasie rzeczywistym

1. Przygotuj mieszaninę PCR w następujący sposób:
   • 12,50 μl iQ SYBR Green Supermix
   • Starter 0,5 μM 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)¹¹
   • Starter odwrotny 0,25 μM 16S-2 (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3)¹¹
   • sterylny demineralizowany_H2Odo całkowitej objętości 20 μl
2. Dodać 20 μl mieszaniny PCR do dołków 96-dołkowej płytki PCR.
3. Dodać 5 μl próbki do każdego dołka.
4. Użyj folii samoprzylepnej, aby uszczelnić 96-dołkową płytkę PCR.
5. Uruchom płytkę w systemie MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System, stosując następujące optymalne warunki cykli termicznych:
   • Wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 4 minuty
   • Wyżarzanie wstępne w temperaturze 65 °C przez 30 s
   • 35 cykli
     • Denaturacja w temperaturze 95 °C przez 15 s
     • Wyżarzanie w temperaturze 60 °C przez 1 min
   • Analiza krzywej topnienia (od 60 do 95 °C w 20 minut z przyrostem 0,57 °C)

7. Analiza wyników

1. Oblicz wartość odcięcia Ct, korzystając z jednego z poniższych wzorów (w zależności od rodzaju antybiotyku).
   • Ogólnie:
     Wartość graniczna Ct = wartość Ct dodatnia kontrola wzrostu + 0,5 x (wartość Ct ujemna kontrola wzrostu - wartość Ct dodatnia kontrola wzrostu)
   • piperacylina, piperacylina/tazobaktam i ceftazydym w pałeczkach Gram-ujemnych; Amoksycylina, oksacylina i trimetoprim/sulfametoksazol w S. aureus; Amoksycylina w Enterococcus spp.: Wartość graniczna Ct = wartość Ct dodatnia kontrola wzrostu + 0,25 x (wartość Ct ujemna kontrola wzrostu - wartość Ct dodatnia kontrola wzrostu)
2. Użyć próbki inkubowanej ze sterylnym zdemineralizowanym_H2Ojako dodatniej kontroli wzrostu.
3. W zależności od mikroorganizmu należy zastosować odpowiednią ujemną kontrolę wzrostu:
   • Pałeczki Gram-ujemne Próbka inkubowana z mieszaniną antybiotyków
   • Enterococcus spp. Próbka przechowywana w temperaturze 4 °C
   • S.aureus Próbka przechowywana w temperaturze 4 °C
4. Określ wrażliwość (S) lub oporność (R) szczepu na badany antybiotyk w następujący sposób:
   • Wartość Ct wyższa niż wartość odcięcia Ct wskazuje na podatność
   • Wartość Ct niższa niż wartość odcięcia Ct oznacza rezystancję

8. Reprezentatywne wyniki

Dwa organizmy modelowe, tj. Gram-ujemna E. coli i Gram-dodatnia S. aureus, są wybrane do wizualizacji połączonej procedury wykrywania i identyfikacji patogenów bakteryjnych oraz określania ich profilu przeciwdrobnoustrojowego. Pierwsza część protokołu obejmuje identyfikację patogenu. Specjalne sondy są przeznaczone do wykrywania ośmiu klinicznie istotnych mikroorganizmów. W obecności celu zawartego w panelu bakteryjnym generowane są krzywe amplifikacji i obliczane są wartości Ct (ryc. 2). Wartość odcięcia, aby uznać wynik PCR za pozytywny, jest ustawiona na wartość Ct równą 35. Na rycinie 2A przedstawiono profil identyfikacyjny posiewu krwi zakażonego E. coli. Sonda uniwersalna 16S wchodzi w skład dwóch oddzielnych mieszanin reakcyjnych i w związku z tym generuje dwie krzywe amplifikacji (Ct 25,20 i 25,95). Trzeci sygnał pochodzi z sondy specyficznej dla E. coli (Ct 27.04). Identyfikacja posiewu krwi zakażonego S. aureus pokazano na rycinie 2B. Sonda uniwersalna 16S posiada sygnały wzmacniające 33,35 i 33,71. Dwa pozostałe sygnały pochodzą z sond specyficznych dla Staphylococcus spp. i S. aureus (Ct 32,48 i 30,59).

Po pierwszej części protokołu, mikroorganizm sprawczy jest znany i można określić profil przeciwdrobnoustrojowy. Rysunek 3 jest przykładem wykresu amplifikacji testu wrażliwości na antybiotyki, reprezentującego szczep E. coli, który został również pokazany na rysunku 2A. Każda linia reprezentuje jeden antybiotyk, z którym inkubowano próbkę bakteryjną. Próbka o niskiej wartości Ct to próbka, w której nastąpił wzrost w obecności antybiotyku, wskazujący na oporność na badany antybiotyk. Wręcz przeciwnie, wysoka wartość Ct oznacza próbkę, w której nie nastąpił wzrost z powodu skutecznego działania antybiotyku, co wskazuje na podatność na badany antybiotyk. W tabeli 1 przedstawiono sposób określania profilu przeciwdrobnoustrojowego izolatów E. coli i S. aureus. Podaje się wszystkie wartości Ct, a przy użyciu wzorów podanych w tekście protokołu (7.1) oblicza się dwie wartości odcięcia Ct w celu rozróżnienia między odpornością a podatnością. Szczep jest oporny na antybiotyk, jeśli podana wartość Ct jest niższa niż obliczona wartość odcięcia Ct (i odwrotnie).

Rysunek 1. Schemat blokowy procedury identyfikacji patogenu i badania wrażliwości na antybiotyki z wykorzystaniem 16S rDNA PCR w czasie rzeczywistym.

Rysunek 2. Test identyfikacyjny: Wykresy amplifikacji i wartości progowe cyklu (wartości Ct). Dodatni posiew krwi jest wykrywany przez uniwersalną sondę 16S rDNA, podczas gdy specyficzne sondy są używane do identyfikacji patogenu sprawczego. A. wykres amplifikacyjny posiewu krwi zawierającego E. coli; B. wykres amplifikacyjny posiewu krwi zawierającego S. aureus; Pseu ae, Pseudomonas aeruginosa; uni, sonda uniwersalna 16S; Ecoli, sonda Escherichia coli; Pseu sp., sonda Pseudomonas spp.; S. pneu, sonda Streptococcus pneumoniae; Strep sp, Streptococcus spp. sonda; Entero, sonda Enterococcus spp.; S. aureus, sonda Staphylococcus aureus; Gronkowiec sp., Staphylococcus spp. sonda.

Rysunek 3. Wykres amplifikacji badania wrażliwości izolatu E. coli na antybiotyki (próbka 1). Każda krzywa reprezentuje jeden antybiotyk, z którym szczep był inkubowany. Wczesny sygnał jest spowodowany dużym obciążeniem bakteryjnym, co oznacza, że szczep wyrósł w obecności badanego antybiotyku i tym samym jest oporny na antybiotyk. Późne sygnały wskazują, że szczep nie rozrósł się w obecności antybiotyku, innymi słowy, jest podatny.

Próbka 1: E. coli     Próbka 2: S. aureus     Ast Ct R/S Ast Ct R/S Amoksycylina 8 mg/L 16,83 TGL R Amoksycylina 0,25 mg/L Pytanie 21,03 TGL R Amoksycylina-klawulanian 8/4 mg/L Rozdział 17,36 R Oksacylina 2 mg/l 25,80 zł S Piperacylina 16 mg/L 16,67 TGL R Wankomycyna 2 mg/L 25,20 S Piperacylina-tazobaktam 16/4 mg/L Pytanie 24,15 S Gentamycyna 4 mg/L Pytania z dnia 25,86 TGL S cyprofloksacyna 1 mg/l Pytania z dnia 29,72 TGL S trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg/L 24,62 TGL S Ceftazydym 1 mg/L Ul. 24,03 S       Ceftazydym 8 mg/l Pytania z dnia 26,58 TGL S       Gentamycyna 4 mg/L Pytanie 29,83 TGL S       trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg/L 27,60 TGLI S                   Negatywna kontrola wzrostu (mieszanina antybiotyków) Pytania z dnia 30,41   Ujemna kontrola wzrostu (próbka przechowywana w temperaturze 4 °C) Pytania z dnia 27,42 TGL   Pozytywna kontrola wzrostu 16,90 zł   Pozytywna kontrola wzrostu Pytania z dnia 20,22               Wartość graniczna Ct 1* 21,76 TGL   Wartość graniczna Ct 1*** Pytania z dnia 23,82 TGL   Wartość graniczna Ct 2** Pytanie 18,75 TGL   Wartość graniczna Ct 2**** Pytanie 22,02 TGL   * Dla amoksycyliny, klawulanianu amoksycyliny, cyprofloksacyny, gentamycyny, trimetoprimu-sulfametoksazolu
** Dla piperacyliny, piperacyliny-tazobaktamu, ceftazydymu     Dla wankomycyny i gentamycyny
Dla amoksycyliny, oksacyliny i trimetoprimu-sulfametoksazolu    

Tabela 1. Oznaczanie badania wrażliwości na antybiotyki dwóch próbek (E. coli i S. aureus). Wartości Ct testu PCR zostały skopiowane do tego pliku Excel, ponieważ może on automatycznie obliczać dwie wartości odcięcia Ct z dodatniej i ujemnej kontroli wzrostu, korzystając ze wzorów pokazanych w tekście protokołu. Jeśli antybiotyk wykazuje wartość Ct niższą niż wartość odcięcia Ct, szczep jest odporny na antybiotyk, jeśli wartość Ct była wyższa niż wartość odcięcia, szczep jest podatny.

Discussion

Opisany tutaj protokół umożliwia szybką identyfikację patogenów i zapewnia funkcjonalny profil przeciwdrobnoustrojowy, który może prowadzić do wczesnego podania odpowiednich antybiotyków, poprawiając w ten sposób rokowanie pacjentów z infekcjami krwi. W zależności od wymaganych warunków testu, tj. niskiego kosztu, wysokiej przepustowości, minimalnego czasu realizacji, warunki testowania można dostosować. Cała procedura może być wykonana w ciągu jednego dnia roboczego. Co więcej, obie części protokołu mogą być wykonywane jednocześnie, co znacznie skraca czas realizacji. Jak przedstawiono tutaj, panel identyfikacyjny jest wyborem najbardziej istotnych klinicznie bakterii w naszym szpitalu. Ponieważ główną zasadą jest celowanie w region genu 16S, można zaprojektować i dodać do testu specjalne sondy dla innych mikroorganizmów. Kompletny test był pierwotnie przeznaczony do szybkiej analizy posiewów krwi, ale może być również używany do przetwarzania innych materiałów próbek. Dotyczy to również antybiotyków, które były używane do badania wrażliwości na antybiotyki: można dodać więcej lub inne antybiotyki, w oparciu o lokalne wzorce oporności i wytyczne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorek sodu (NaCl)	Merck Chemicals	106404	0,9% w wodzie
Vacutainer SST Probówka separatora surowicy 5 ml	BD Systemy diagnostyczne	367986
Mueller Hinton II	bulion BD Dystemy diagnostyczne 212322		44 g/L w wodzie
Wirówka Rotixa 50 rs	Andreas Hettich GmbH Co. KG	4910
Wirówka 5415 D	Eppendorf	Wycofane z produkcji
Startery	Sigma-Aldrich	n.a.Sondy
	Sigma-Aldrich/Applied Biosystems	n.a.TaqManEnvironmental
master mix 2.0	Applied Biosystems	4396838
iQ SYBRGreen Supermix	Bio-Rad Laboratories BV	170-8880
MicroAmp Zastosowano 96-dołkową płytkę reakcyjną	Biosystems	N8010560
MicroAmp Optyczna folia samoprzylepna	Applied Biosystems	4311971
iQ 96-dołkowe płytki PCR	Bio-Rad Laboratories BV	223-9441
Uszczelki samoprzylepne Microseal B	Bio-Rad Laboratories BV	MSB-1001
System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym	Applied Biosystems	ABI PRISM 7900HT
System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad Laboratories BV	MyiQ Single-Color