Behawioralna ocena sprawności manualnej u naczelnych innych niż człowiek

Podsumowanie

Ponieważ sprawność manualna jest domeną głównie naczelnych, w badaniach nad małpami makakami opracowano zadania behawioralne. Cztery zadania dotyczące sięgania i chwytania, mierzące siłę oraz zdolność manipulacji dłonią, pozwalają na ustalenie stopnia regeneracji funkcjonalnej po uszkodzeniu ośrodkowego układu nerwowego oraz na przetestowanie efektów zastosowanego leczenia.

Streszczenie

Droga korowo-rdzeniowa (CS) stanowi anatomiczne podłoże wyjątkowej zdolności motorycznej do sprawnego manipulowania małymi przedmiotami, co jest prerogatywą głównie naczelnych¹. W przypadku uszkodzenia wpływającego na układ projekcyjny CS w miejscu jego początku (uszkodzenie korowych obszarów motorycznych) lub wzdłuż jego przebiegu (uszkodzenie rdzenia szyjnego), dochodzi do drastycznej utraty sprawności manualnej (paraliżu dłoni), co obserwuje się u niektórych pacjentów z tetraplegią lub hemiplegią. Chociaż po takim uszkodzeniu następuje pewna spontaniczna regeneracja funkcjonalna, u dorosłych pozostaje ona bardzo ograniczona. Obecnie proponuje się różne strategie terapeutyczne (np. terapię komórkową, neutralizację inhibitorowych cząsteczek wzrostu aksonów, aplikację czynników wzrostu itp.), które są rozwijane głównie na gryzoniach. Jednak przed zastosowaniem klinicznym często zaleca się przetestowanie wykonalności, skuteczności i bezpieczeństwa leczenia na naczelnych innych niż człowiek. Jest to szczególnie istotne, gdy celem jest przywrócenie sprawności manualnej po uszkodzeniu ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ organizacja układu motorycznego gryzoni różni się od organizacji u naczelnych^1,2. Małpy makaki są tutaj przedstawione jako odpowiedni model behawioralny do ilościowej oceny sprawności manualnej u naczelnych, aby odzwierciedlić deficyty wynikające np. z uszkodzenia kory motorycznej lub rdzenia szyjnego, zmierzyć zakres spontanicznej regeneracji funkcjonalnej oraz, w przypadku zastosowania leczenia, ocenić, w jakim stopniu może ono wzmocnić tę regenerację.

Behawioralna ocena sprawności manualnej opiera się na czterech odrębnych, komplementarnych zadaniach polegających na sięganiu i chwytaniu (wykorzystanie chwytu precyzyjnego do chwytania peletu), co wymaga wstępnego przeszkolenia dorosłych małp z rodzaju makak. Zaprezentowano przygotowanie zwierząt, a także ich pozycjonowanie względem zestawu behawioralnego. Dla każdego zadania zilustrowano wyniki typowej małpy. Wyjaśniono i zademonstrowano na reprezentatywnych wynikach gromadzenie i analizę odpowiednich parametrów odzwierciedlających precyzyjną manipulację ręką oraz kontrolę siły. Dane te osadzono następnie w szerszym kontekście, pokazując, w jaki sposób dane behawioralne mogą być wykorzystane do zbadania wpływu uszkodzenia rdzenia kręgowego lub uszkodzenia kory ruchowej oraz w jakim stopniu leczenie może usprawnić spontaniczną regenerację funkcjonalną poprzez porównanie różnych grup małp (na przykład leczonych w stosunku do grupy kontrolnej poddanej zabiegowi pozorowanemu). Omówiono zalety i ograniczenia testów behawioralnych. Przedstawione podejście behawioralne jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami podkreślającymi zasadność stosowania modelu naczelnych niebędących ludźmi w kontekście chorób układu nerwowego^2,3.

Protokół

Ogólny schemat eksperymentu przedstawiono na Rysunku 1.

1. Przygotowanie zwierząt i przeniesienie do laboratorium behawioralnego

1. W laboratorium przygotuj stanowisko do badań behawioralnych: wypełnij otwory w poszczególnych płytkach testowych (testy 1–3 poniżej) peletem, który służy jako nagroda podczas testów behawioralnych.
2. Przenieś małpę z pomieszczenia zbiorowego do klatki transportowej. Małpa jest przeszkolona wchodzeniu do tunelu zapewniającego dostęp do krzesła dla naczelnych, z następującym unieruchomieniem głowy. Przed przeniesieniem zwierzęcia krzesłem do laboratorium należy zmierzyć jego masę ciała.

2. Test 1: Modyfikowana płytka Brinkmana

1. Niniejszy test, zmodyfikowany i zaadaptowany z poprzednich raportów^4,5, stanowi podstawowe behawioralne zadanie referencyjne, które należy przeprowadzać podczas każdej sesji behawioralnej. Rozpocznij nagrywanie wideo za pomocą kamery cyfrowej umieszczonej nad zestawem (istnieje możliwość rozmieszczenia 2 dodatkowych kamer, po jednej z każdej strony tablicy) i umieść małpę przed tablicą Brinkmana.
2. Otwórz na przykład prawe okno w krześle dla naczelnych, aby umożliwić dostęp do prawej ręki. Korzystając z prawej ręki, małpa wyjmuje pellety z pokarmu z 50 szczelin (25 pionowych i 25 poziomych).
3. Po zakończeniu testu zamknij prawe okno i ponownie wypełnij tablicę pelletami.
4. Otwórz lewe okno i powtórz test dla lewej ręki.
5. Po zakończeniu testu nagrodź zwierzę kilkoma suszonymi rodzynkami lub migdałem; procedurę tę należy powtarzać po każdym teście, aby utrzymać motywację podczas całej codziennej sesji.

Informacje dodatkowe: Do rejestracji sekwencji w celu późniejszego przetwarzania offline użyto trzech cyfrowych kamer wideo, rozmieszczonych jedną nad płytą i po jednej z każdej strony płyty (aby precyzyjnie ocenić pozycję palców podczas chwytania). W ramach jednej sesji dziennej małpa może wykonywać kolejne zadania (zadanie 2 i/lub zadanie 3 i/lub zadanie 4; rozłożone na poszczególne dni tygodnia). W przypadku testu 1, jeśli małpa rozpoczęła od prawej ręki w dniu 1., w dniu 2. należy zacząć od lewej ręki i tak dalej.

6. Opcjonalnie: Chociaż test przeprowadzony powyżej z każdą ręką osobno pozwala porównać sprawność ręki lewej z prawą (w celu zidentyfikowania „ręki dominującej”), na wczesnym etapie treningu można również pozwolić małpie na wykonywanie zadania obiema rękami jednocześnie. Jeśli jedna ręka jest używana częściej niż druga do chwytania peletu, można ją uznać za „rękę preferowaną”.

3. Test 2: Pułapka Brinkmana (z kontrolą wizualną i bez niej)

1. Pudełko Brinkmana składa się z 20 otworów (10 pionowych i 10 poziomych). W porównaniu z testem 1, małpa musi kontrolować rękę w ograniczonej przestrzeni, z mniejszą liczbą stopni swobody podczas wykonywania ruchu chwytu precyzyjnego. Wypełnij płytkę pelletami i zamknij górną ściankę pudełka, aby w pierwszej kolejności przeprowadzić test bez kontroli wzrokowej (polegając na eksploracji dotykowej).
2. Umieść małpę przed pudełkiem Brinkmana. Otwórz lewe okno krzesła dla naczelnych, aby przetestować lewą rękę bez kontroli wzrokowej. Małpa próbuje wyłowić 20 pelletów, podczas gdy sekwencja jest rejestrowana przez kamerę cyfrową umieszczoną pod pudełkiem.
3. Zamknij lewe okno krzesła dla naczelnych. Ponownie wypełnij płytkę pelletami. Otwórz prawe okno krzesła dla naczelnych. Małpa powtarza test prawą ręką bez kontroli wzrokowej. Zamknij prawe okno krzesła dla naczelnych.
4. Aby przetestować zdolność chwytania pelletów w pudełku Brinkmana pod kontrolą wzrokową, otwórz górną ściankę pudełka.
5. Ponownie wypełnij pudełko pelletami; małpa wykonuje test prawą ręką.
6. Zamknij prawe okno krzesła dla naczelnych. Ponownie wypełnij pudełko pelletami.
7. Otwórz lewe okno krzesła dla naczelnych. Małpa wykonuje test lewą ręką. Powtórz krok 2.5.

4. Test 3: Obracająca się płyta Brinkmana

1. Ten test jest porównywalny z zadaniem z tablicą Brinkmana (test 1), z tą różnicą, że tablica obraca się, co zmusza małpę do antycypowania przesunięcia tablicy w jednym (zgodnie z ruchem wskazówek zegara) lub drugim (przeciwnie do ruchu wskazówek zegara) kierunku. Napełnić tablicę pelletami. Sekwencja jest rejestrowana za pomocą kamery cyfrowej umieszczonej nad zestawem (istnieje możliwość umieszczenia 2 dodatkowych kamer, po jednej z każdej strony).
2. Otworzyć prawe okno krzesła dla naczelnych. Małpa wyjmuje pellety z 32 otworów, rozmieszczonych w czterech koncentrycznych rzędach, podczas gdy tablica obraca się zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
3. Zamknąć prawe okno. Ponownie napełnić tablicę pelletami.
4. Otworzyć lewe okno krzesła dla naczelnych. Małpa wykonuje test w sposób opisany w punkcie 4.2, używając lewej ręki.
5. Powtórzyć punkty 4.2 do 4.4, podczas gdy tablica obraca się przeciwnie do ruchu wskazówek zegara (po kolei dla każdej ręki). Powtórzyć krok 2.5.

5. Test 4: Zadanie sięgania i chwytania szuflady

1. Aby połączyć zdolność chwytania z możliwością generowania siły, test ten (opracowany na podstawie wcześniejszych wersji^6-1) został zaprojektowany tak, aby małpa musiała otworzyć szufladę, wywierając najpierw siłę chwytu na uchwycie szuflady, a następnie siłę obciążenia w celu jej otwarcia, co daje dostęp do umieszczonej wewnątrz peletu. Pelet jest wyjmowany tą samą ręką przy otwartej szufladzie, ponownie z wykorzystaniem chwytu precyzyjnego. Na górze szuflady umieszczono kamerę cyfrową w celu rejestracji prób do późniejszej kontroli danych (np. wykrywania prób błędnych).
2. Otwórz prawe okno krzesła dla naczelnych. Małpa wykonuje 10 prób na każdym z 5 różnych poziomów oporu, używając prawej ręki (aby uzyskać co najmniej 5 poprawnych prób dla każdego poziomu oporu).
3. Powtórz test (50 prób) lewą ręką. Powtórz krok 2.5.

Informacje dodatkowe: Podczas następnej codziennej sesji behawioralnej należy zmienić rękę, którą zwierzę rozpoczęło test w poprzedniej sesji.

6. Zakończenie sesji behawioralnej

1. Po zakończeniu testów przewidzianych na dany dzień, nakarm i nagród małpę pożywieniem dodatkowym do granulatu otrzymanego podczas testów. Zazwyczaj małpie podaje się zboża i owoce.
2. Małpę przenosi się z powrotem do pomieszczenia z klatkami grupowymi do pozostałych osobników.

Dokładna sekwencja czasowa poszczególnych przeprowadzonych testów została zapisana w formularzu protokołu.

7. Reprezentatywne wyniki

Cztery testy behawioralne przedstawione powyżej (Rysunek 1) były szeroko stosowane w naszym laboratorium w ramach badań mających na celu analizę funkcjonalnego powrotu do sprawności po uszkodzeniu szyjnego odcinka rdzenia kręgowego (Rysunek 2A) lub kory ruchowej (Rysunek 2B), w obecności lub przy braku zastosowania leczenia mającego na celu wzmocnienie spontanicznej regeneracji^12-19.

W przypadku testu 1 (zmodyfikowana tablica Brinkmana) analiza koncentruje się na dwóch parametrach (Rysunki 3 i 4A): i) wyniku, określonym liczbą pelletów odzyskanych przez małpę w ciągu pierwszych 30 sekund, liczonych oddzielnie dla szczelin pionowych i poziomych (poprzez offline'owe odtworzenie nagranej sekwencji wideo); ii) czasie kontaktu (CT), zdefiniowanym jako czas (czas trwania) kontaktu między palcami a pelletem (zobacz również Rysunek 6, dolna seria zdjęć). Jest to odstęp czasu pomiędzy włożeniem pierwszego palca (zazwyczaj palca wskazującego) do szczeliny w celu dotknięcia pelletu a początkiem wyciągania pelletu z otworu. Odstęp czasu jest mierzony poprzez odtwarzanie sekwencji wideo klatka po klatce. CT jest mierzone dla pierwszych pięciu szczelin pionowych i pierwszych pięciu szczelin poziomych, do których dążyła małpa^16-18. Wykresy wyniku ilustrują wstępną fazę treningu, plateau przed uszkodzeniem, gwałtowny spadek wyniku (zazwyczaj do zera) bezpośrednio po uszkodzeniu oraz postępującą (spontaniczną) regenerację funkcjonalną prowadzącą do plateau po uszkodzeniu. Regeneracja funkcjonalna jest wyrażona w % jako stosunek mediany wyniku po uszkodzeniu na poziomie plateau podzielonej przez medianę wyniku przed uszkodzeniem (plateau) ^*10 (Rysunki 3 i 4A). W przypadku CT, ponieważ wzrost odzwierciedla deficyt, regeneracja funkcjonalna wyrażona w % jest stosunkiem mediany CT przed uszkodzeniem (plateau) podzielonej przez medianę CT po uszkodzeniu na poziomie plateau ^*10. Efekty leczenia po uszkodzeniu, wykazane na podstawie testu 1, zostały szczegółowo opisane w poprzednich raportach z tego laboratorium^14,15,17. Dalsza analiza może dotyczyć kwestii strategii, a konkretnie czasowej sekwencji szczelin odwiedzanych przez małpę (Rysunek 4B).

W przypadku testu 2 (Brinkman box), choć wynik można ustalić w taki sam sposób jak w teście 1, bardziej znaczącym parametrem jest „całkowity czas”, zdefiniowany jako odstęp czasu między podniesieniem granulki z pierwszego otworu a podniesieniem granulki z ostatniego (20.^th) otworu (Rycina 5). Można obliczyć i wyrazić w % stopień powrotu do sprawności funkcjonalnej. Oblicza się go, dzieląc medianę całkowitego czasu przed uszkodzeniem (plateau po fazie treningowej) przez medianę całkowitego czasu po uszkodzeniu w fazie plateau ^*10.

W przypadku testu 3 (obrotowej tablicy Brinkmana), choć wynik można ustalić w sposób opisany powyżej (test 1), parametrem o wysokiej czułości jest czas kontaktu (CT, zdefiniowany powyżej w teście 1), mierzony dla pierwszych dziesięciu szczelin (Rysunek 6).

W przypadku testu 4 (zadania polegającego na sięganiu i chwytaniu szuflady), zestaw obejmuje kilka detektorów rejestrujących dyskretne zdarzenia, takie jak rozpoczęcie próby (ręka przerywa wiązkę światła umieszczoną przed panelem), dotknięcie gałki ręką, początek wysuwania szuflady, zakończenie otwierania szuflady, wprowadzenie ręki do otworu (czas pobrania) oraz wycofanie ręki z otworu (czas wyjęcia). Przetworniki siły zamontowane na gałce umożliwiają pomiar siły chwytu (wywieranej przez kciuk i palec wskazujący naciskające na gałkę) oraz siły obciążenia (wywieranej w celu wysunięcia szuflady, aby przeciwstawić się różnym poziomom oporu nałożonym na otwieranie szuflady). Różne poziomy oporu przeciwdziałające otwieraniu szuflady uzyskano poprzez zmianę natężenia prądu przyłożonego do obrotowego silnika elektromagnetycznego przymocowanego do tyłu szuflady. Zestaw został zaprojektowany tak, aby przykładać siłę oporu równolegle do kierunku otwierania szuflady. Szczegółowy schemat zestawu z szufladą jest dostępny na prośbę do autora korespondencyjnego. Wszystkie te dane są zbierane za pomocą interfejsu i oprogramowania Spike 2 i wyświetlane zgodnie z ilustracją na Ryc. 7.

Jak raportowano wcześniej1^4,15, zadania te stanowią podstawę behawioralną do zbadania, czy spontaniczny powrót do sprawności po uszkodzeniu rdzenia szyjnego może zostać wspomagany specyficznym leczeniem mającym na celu promowanie regeneracji aksonów (Rysunek 8).

Parametry wyniku odzyskania i czasu kontaktu odzwierciedlają różne komponenty sprawności manualnej: pierwszy obejmuje cały ciąg ruchowy (sięganie, chwytanie, wycofywanie ręki, transport peletu do pyszczka), natomiast drugi skupia się wyłącznie na fazie chwytania. Te dwa parametry są szczególnie precyzyjne i uzupełniające w przypadku zadań z wykorzystaniem zmodyfikowanej i obracającej się tablicy Brinkmana. Podczas gdy wynik dostarcza w tych dwóch zadaniach w dużej mierze redundantnych informacji, czas kontaktu dostarcza w przeciwieństwie do niego informacji bardziej specyficznych dla danego zadania, co wynika ze zmienności pozycji otworów w zadaniu z obracającą się tablicą Brinkmana w porównaniu do ich statycznej pozycji w zadaniu ze zmodyfikowaną tablicą Brinkmana. Zadanie z pudełkiem Brinkmana różni się od dwóch wyżej wymienionych zadań tym, że stopnie swobody ruchów ręką są ograniczone przez zamkniętą przestrzeń. W konsekwencji pozycje poszczególnych otworów na tablicy wewnątrz pudełka Brinkmana odgrywają istotną rolę pod kątem trudności wykonania chwytu manualnego ze względu na niewielki rozmiar pudełka. Na przykład chwytanie ręką z otworów znajdujących się po prawej stronie pudełka koliduje z prawą ścianą boczną.

W konsekwencji ocena wyniku wyszukiwania ograniczona do 30 sekund, jak w zmodyfikowanej tablicy Brinkmana, byłaby obciążona zależnie od pozycji szczelin, które małpa faktycznie odwiedziła w tym ograniczonym czasie, co generowałoby znaczną zmienność między poszczególnymi sesjami. Z tego powodu bardziej odpowiednie jest uwzględnienie wszystkich szczelin (n=20), dlatego wybrano parametr czasu całkowitego. W zmodyfikowanej tablicy Brinkmana nie uwzględniano czasu całkowitego, ponieważ małpa w niektórych przypadkach może stracić motywację (na przykład po uszkodzeniu) ze względu na dużą liczbę szczelin do sprawdzenia (n=50). W podobnym duchu analiza czasu kontaktu wymagałaby uwzględnienia wszystkich szczelin pudełka Brinkmana (podczas gdy w zmodyfikowanej tablicy Brinkmana brano pod uwagę tylko pięć pierwszych szczelin, ponieważ pozycja wybranych szczelin ma niewielki lub żaden wpływ na ten parametr). Dlatego w przypadku pudełka Brinkmana w pierwszej kolejności zalecamy wyznaczenie czasu całkowitego, gdyż zaobserwowano, że jest on parametrem wysoce trafnym i informacyjnym, przynajmniej w naszych badaniach z małpami poddanymi uszkodzeniu kory ruchowej (brak danych dla małp z uszkodzeniem rdzenia kręgowego). Niemniej jednak w przypadku pudełka Brinkmana można rozważyć czas kontaktu, ale w drugim kroku, obejmując wszystkie dwadzieścia szczelin, oddzielnie jednak dla szczelin poziomych i pionowych (nie pokazano).

Rysunek 1. Ogólny schemat eksperymentu. Zwierzę zostaje przeniesione z domu dla zwierząt do krzesła dla naczelnych, a następnie przetransportowane do laboratorium behawioralnego. Podczas każdej codziennej sesji małpa wykonuje test 1. W dni co drugi małpa wykonuje następnie test 2 i/lub test 3 i/lub test 4. Niektóre małpy (szczególnie zmotywowane) mogą wykonać wszystkie testy podczas jednej codziennej sesji. Granulki pokarmu (używane jako nagroda) zostały przygotowane z suszonego banana lub proszku glukozowego, sprasowanego w okrągły kształt o średnicy około 4 mm. we wszystkich naszych testach behawioralnych stosujemy bezpyłowe granulki precyzyjne (45 mg) dostarczone przez BioServ, One 8th street, Suite One, Frenchtown, NJ 0825, USA.

Wymiary zmodyfikowanej płytki Brinkmana wynoszą 240 mm długości i 140 mm szerokości, natomiast wymiary szczelin to 15 mm długości, 8 mm szerokości i 6 mm głębokości. Średnica płytki w obrotowej płytce Brinkmana wynosi 14 mm.

Rysunek 2. Reprezentatywna zmiana (chirurgiczna) rdzenia szyjnego (panel A; zmodyfikowano z¹⁵) i (chemiczna) lekcja kory ruchowej (panel B; zmodyfikowano z¹⁶), uzyskane z odpowiadających im przekrojów histologicznych, poddanych barwieniu SMI-32. Maksymalny zasięg uszkodzenia rdzenia szyjnego zrekonstruowano na podstawie następujących po sobie przekrojów strzałkowych rdzenia kręgowego (panel A), natomiast zasięg i położenie uszkodzenia kory ruchowej zrekonstruowano na podstawie następujących po sobie przekrojów czołowych mózgu i naniesiono na widok boczny odpowiadającej im półkuli mózgu (czerwony punkt w panelu B). Uszkodzenie rdzenia szyjnego było wynikiem przerwania ciągłości skalpelem chirurgicznym na poziomie C7-C8, co doprowadziło do pod-półprzecięcia, przerywającego jednostronnie główny komponent drogi CS w sznurze grzbietowo-bocznym, powyżej motoneuronów kontrolujących mięśnie dłoni^14,15,20Trwałe uszkodzenie kory wywołano poprzez infuzję kwasu ibotenowego.^13,16,17w miejscach obejmujących reprezentację dłoni, ustaloną wcześniej za pomocą wewnątrzkorowej mikrostymulacji (ICMS, patrz^16,21,22Obszar uszkodzenia kory przejawia się jako nagłe przerwanie barwienia SMI-32 neuronów w warstwach III i V w przedniej ścianie bruzdy środkowej (obszar wyznaczony przerywaną linią na panelu B).

Rysunek 3. Reprezentatywne dane uzyskane z modyfikowanego zadania z tablicą Brinkmana (test 1), wykonanego przez małpę z uszkodzeniem rdzenia kręgowego (jak zilustrowano na rysunku 2A). Wykres przedstawia wynik (oś rzędnych) oddzielnie dla szczelin pionowych (symbole niebieskie) i szczelin poziomych (symbole czerwone). Symbole żółte oznaczają sumę wyników dla szczelin pionowych i poziomych w danej sesji dziennej. Na osi odciętych czas odpowiada kolejnym dniom sesji behawioralnych. Pionowa czerwona przerywana linia (dzień 0) oznacza dzień wykonania uszkodzenia. Wyróżniono trzy różne okresy: pierwszy (czarna przerywana linia) odpowiada okresowi treningowemu, drugi (niebieska przerywana linia) plateau wyników przed uszkodzeniem, a trzeci (zielona przerywana linia) plateau odzyskanego poziomu sprawności. Dane zmodyfikowane z¹⁵.

Rycina 4A. Tak jak na rysunku 3 (test 1), lecz u małpy poddanej uszkodzeniu kory ruchowej (jak zilustrowano na rysunku 2B). Wykresy przedstawiają dane dotyczące wyniku (panel A; te same konwencje co na rysunku 3) oraz czasu kontaktu (CT; panel B). Na osi odciętych czas odpowiada kolejnym dniom sesji behawioralnych. Pionowa czerwona przerywana linia (dzień 0) oznacza dzień, w którym wykonano uszkodzenie. W panelu B każda kropka odpowiada czasowi kontaktu między palcem a peletem w jednym slocie (5 prób na orientację w każdej sesji; szary słupek reprezentuje wartość mediany). Należy zauważyć, że dla prób, w których zwierzę nie było w stanie wykonać zadania (bezpośrednio po uszkodzeniu), CT pojawia się jako wartość nasycona wynosząca 5 sekund. Dane zmodyfikowano z^16,17.

Rysunek 4B. Analiza strategii przyjętej w zmodyfikowanym zadaniu z tablicą Brinkmana, wykonanym ręką przeciwstronną do uszkodzenia, przed uszkodzeniem kory ruchowej (Pre), w fazie powrotu do zdrowia (Recovery) oraz po uszkodzeniu w fazie plateau (Post). Kolor każdego otworu wskazuje kolejność odwiedzania otworów przez małpę w ciągu jednej sesji (pierwszy odwiedzony otwór jest przedstawiony w najciemniejszym kolorze niebieskim, a ostatni w najciemniejszym czerwonym). Zauważmy, że przed uszkodzeniem małpa zaczynała od lewej strony tablicy i systematycznie skanowała ją w stronę prawą. Podczas rekonwalescencji kolejność sekwencyjna uległa zmianie. W fazie plateau po uszkodzeniu ponownie pojawiła się strategia przyjęta przed uszkodzeniem (systematyczne skanowanie od lewej do prawej strony).

Rysunek 5. Reprezentatywne dane uzyskane z pudła Brinkmana (test 2) dla małpy wykonującej zadanie pod kontrolą wzrokową. Osią rzędną jest całkowity czas potrzebny na opróżnienie 20 otworów w trakcie codziennych sesji (oś odciętych), przeprowadzonych przed i po uszkodzeniu kory ruchowej (pionowa przerywana linia). Wymiary dostępnej objętości wewnątrz pudła wynoszą 1360 cm³ (120 mm^*10 mm^*103 mm). Zauważalna jest początkowa faza treningu, charakteryzująca się większą zmiennością całkowitego czasu z jednej sesji do drugiej. Bezpośrednio po uszkodzeniu kory małpa nie była w stanie wykonać zadania (punkty danych nasycone na poziomie 20 sekund). Wartość p jest statystycznie istotna dla różnicy między medianą całkowitego czasu przed uszkodzeniem (środek poziomego szarego prostokąta po lewej stronie) a medianą całkowitego czasu po uszkodzeniu w ostatnich sesjach (środek poziomego szarego prostokąta po prawej stronie). Procent funkcjonalnego powrotu do zdrowia wynosi 89,6%, podczas gdy objętość uszkodzenia kory ruchowej wyniosła 41,8 mm³³Dane zmodyfikowane na podstawie¹⁹.

Rycina 6. Reprezentatywne wyniki (dwie górne wykresy) uzyskane w zadaniu z obrotową tablicą Brinkmana (test 3), wraz z ilustracją czasu kontaktu mierzonego przed i po uszkodzeniu, zgodnie z tymi samymi konwencjami co na rysunku 4A (panel B), dla małpy poddanej uszkodzeniu kory ruchowej (dane zmodyfikowano z¹⁷). Górny wykres przedstawia obrót płytki zgodnie z ruchem wskazówek zegara („Cl”), natomiast dolny wykres przedstawia obrót przeciwnie do ruchu wskazówek zegara („C-Cl”). Dwie pionowe szare strzałki wskazują, że czas kontaktu był nieskończenie długi w kilku sesjach bezpośrednio po uszkodzeniu, ponieważ małpa nie była w stanie wykonać zadania ręką kontralateralną do miejsca uszkodzenia. Seria zdjęć na dole rysunku ilustruje metodę pomiaru czasu kontaktu (obowiązującą zarówno dla zmodyfikowanej płytki Brinkmana, jak i obrotowej płytki Brinkmana). Zdjęcie po lewej stronie pokazuje dłoń zbliżającą się do otworu zawierającego pelet (10 ms przed kontaktem palca wskazującego z peletem). Kolejna klatka po prawej odpowiada momentowi kontaktu (0 ms). Następnie czas kontaktu definiuje się jako przedział czasowy (w ms) trwający do momentu osiągnięcia klatki (najdalej po prawej), która odpowiada momentowi wyjęcia peletu z otworu. Czas kontaktu w tym przypadku wynosi 240 ms.

Rysunek 7. Reprezentatywne dane uzyskane z sesji przeprowadzonej przez jedną małpę w zadaniu sięgania i chwytania z szuflady (test 4).

Panel A: Surowe dane odpowiadające trzem parametrom zarejestrowanym online podczas jednej próby: siła obciążenia na czerwono, siła chwytu na niebiesko oraz przemieszczenie szuflady na zielono. Podczas zadania zarejestrowano również kilka znaczników: czas pobrania (picking time) odpowiada momentowi chwycenia nagrody, pełne otwarcie (full open) oznacza pełne otwarcie szuflady, a dotknięcie gałki (tch) to moment, w którym zwierzę po raz pierwszy dotyka gałki. Do analizy w kluczowych punktach czasowych przebiegu zadania umieszczono siedem kursorów (np. 3 szare kursory na trzech dolnych liniach poziomych): 1) czas powiązany z dotknięciem gałki przez zwierzę; 2) początek siły chwytu; 3) maksymalna siła chwytu; 4) początek siły obciążenia; 5) maksymalna siła obciążenia; 6) czas powiązany z pełnym otwarciem szuflady; 7) czas powiązany z czasem pobrania.

Panel B: Przedstawienie wyników ilościowych dla dwóch parametrów zarejestrowanych podczas zadania: siły chwytu (siły użytej do uchwycenia gałki między palcem wskazującym a kciukiem) oraz siły obciążenia (siły użytej do otwarcia szuflady) w dwóch schematach: wartości maksymalnej (wykres po lewej) i wartości nachylenia (od początku do wartości maksymalnej; wykres po prawej).

Przedstawiono tutaj cztery z pięciu różnych względnych poziomów oporu: R0 (0 Newton), R3 (1,4 N), R5 (2,75 N) oraz R7 (5 N). Gałka szuflady ma trójkątny i płaski kształt. Podstawa trójkąta przymocowanego do szuflady mierzy 20 mm, a wierzchołek (znajdujący się 15 mm od podstawy) stanowi okrągły kontur o średnicy 7 mm. Sama szuflada ma następujące wymiary: długość=50 mm, szerokość=27 mm i wysokość=45 mm.

Rysunek 8. Przypomnienie (zmodyfikowane na podst. ¹⁵) zastosowania behawioralnego testu 1 w celu zbadania możliwego wpływu leczenia (przeciwciał anty-Nogo-A) na funkcjonalną regenerację po uszkodzeniu rdzenia szyjnego. Zarówno w przypadku punktacji, jak i czasu kontaktu, a także dla obu orientacji szczeliny, grupa małp leczonych przeciwciałem kontrolnym (niebieskie symbole; n=6) odzyskuje sprawność manualną w mniejszym stopniu niż grupa leczona przeciwciałami anty-Nogo-A (czerwone symbole; n=7), szczególnie przy dużych objętościach uszkodzenia. Dwie grupy różnią się istotnie przy p=0,035 (panel A), p=0,022 (panel B), p=0,035 (panel C) oraz p=0,08 (panel D).

Dyskusja

Choć dotychczas w naszym laboratorium opisane zadania behawioralne były rozważane w kontekście badań związanych z uszkodzeniem rdzenia szyjnego lub uszkodzeniem kory ruchowej w celu przetestowania różnych metod leczenia (patrz^14,15,17 oraz http://www.unifr.ch/neuro/rouiller >wybierz „research” w górnym menu, następnie > „motor system” > „recovery after lesion”), mogą one mieć również szersze zastosowanie, ponieważ sprawność manualna jest aspektem istotnym w innych patologiach, takich jak choroba Parkinsona (małpy z modelem MPTP) lub w przypadku deafferentacji sensorycznej wpływającej na propriocepcję i/lub zmysł dotyku (szczególnie test 2 w warunkach braku kontroli wzrokowej).

Zaproponowane tutaj testy behawioralne są odpowiednie do badania kontroli motorycznej ruchów dystalnych kończyny przedniej, zaangażowanych w zręczność manualną. Specyficzność testów jest wykazana przez brak deficytów (z wyjątkiem kilku pierwszych dni) w przypadku uszkodzenia, które nie upośledza istotnych komponentów systemu kontroli: rzeczywiście, w przypadku uszkodzenia zlokalizowanego bardziej kudalnie niż motoneurony kontrolujące mięśnie dłoni, nie stwierdzono deficytu. Trafność testu 1 można ocenić, porównując sekwencje wideo zarejestrowane w dwóch punktach czasowych krzywej regeneracji po uszkodzeniu, które różnią się zwiększeniem regeneracji funkcjonalnej o 25%, co może być związane z zastosowaniem terapii komórkowej¹⁷.

Pomimo początkowej, stosunkowo krótkiej fazy treningowej na początku (trwającej zazwyczaj 2-3 miesiące), proponowane tutaj testy behawioralne są względnie „naturalne” i proste w porównaniu do złożonych zadań (np. warunkowych), w przypadku których trening małpy może trwać prawie rok lub dłużej. Wzmocnienie pozytywne opiera się na stałym pokarmie, co jest mniej kontrowersyjne z punktu widzenia etycznego niż deprywacja wody, zazwyczaj stosowana w bardziej złożonych zadaniach²³. Nie ma potrzeby pozbawiania małp pożywienia w celu uzyskania stabilnych i spójnych wyników. Pelet otrzymywany podczas zadań stanowi pierwszy dostęp do pokarmu w dniu sesji behawioralnej (zakładając, że małpa nie je w ciągu poprzedniej nocy; jednak dodatkowy pokarm może być podawany do końca popołudnia dnia poprzedniego). Kluczowe jest, aby każda małpa przechodziła sesję behawioralną o tej samej porze dnia, z zachowaniem tej samej kolejności sekwencyjnej pomiędzy poszczególnymi małpami tworzącymi grupę w pomieszczeniu mieszkalnym. Ponieważ małpy są wrażliwe na zewnętrzne zdarzenia rozpraszające, zadania behawioralne powinny być przeprowadzane przy muzyce w tle, która maskuje potencjalny hałas dobiegający z sąsiednich pomieszczeń lub laboratoriów. Niezwykle ważne jest, aby przez cały czas trwania eksperymentu (od początkowego treningu aż do ostatniej codziennej sesji eksperymentalnej, co może trwać kilka miesięcy, a nawet lat), dana małpa znajdowała się każdego dnia pod nadzorem tego samego eksperymentatora.

Przedstawione testy behawioralne, stosowane od kilku lat w naszym laboratorium do ilościowej oceny sprawności manualnej, są w pewnym stopniu porównywalne z innymi testami sprawności manualnej opisanymi niedawno w literaturze^24-28. Istnieje jednak kluczowa potrzeba standaryzacji testów pomiędzy różnymi laboratoriami (w celu lepszego porównania wyników), co stanowi wstępny cel niniejszego raportu. Na żądanie autor korespondencyjny może udostępnić szczegółowe specyfikacje zestawów ilustrujących testy 1-4, aby umożliwić ich replikację. Poza zagadnieniami medycyny regeneracyjnej (powrót do sprawności po uszkodzeniu rdzenia kręgowego lub kory mózgowej), obecny zestaw testów może być odpowiedni do badania kwestii rozwojowych u normalnych naczelnych innych niż ludzie (np. przebieg czasowy rozwoju motorycznego precyzyjnych ruchów), badania aspektów lateralizacji (preferencja/dominacja ręki) oraz rozstrzygania kwestii ewolucyjnych poprzez porównywanie zdolności motorycznych różnych gatunków naczelnych, w tym ludzi. Należy jednak pamiętać, że wymiary aparatury powinny zostać dostosowane do rozmiaru palców (grubości i długości) danego gatunku naczelnych, ponieważ może to wpływać na wyniki wykonywanych zadań. W niniejszym badaniu testy przeprowadzono na małpach macaca fascicularis w wieku od 2,5 do 8 lat i o masie od 2,5 do 8 kg. Długość palca wskazującego (wykorzystywanego w pierwszej kolejności do manipulowania granulkami) wynosiła od 32 do 35 mm, natomiast obwód paliczka dystalnego (koniuszka) palca wskazującego u małp objętych badaniem wynosił od 22 do 25 mm. Jak wykazano w poprzednich eksperymentach, te same testy chwytania są odpowiednie również dla macaca mulatta.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (1996) i zatwierdzone przez lokalne (szwajcarskie) organy weterynaryjne. Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzone na małpach, jak również warunki utrzymania w zwierzęciu, zostały szczegółowo opisane w ostatnich raportach naszego laboratorium: patrz odniesienia 12-18.