Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzacji długotrwałych interakcji gospodarz-patogen

Podsumowanie

Metoda ta umożliwia charakteryzację rozszerzonej kokultury bakteryjnej z EpiAirways, czyli pierwotną ludzką tkanką nabłonkową dróg oddechowych hodowaną na granicy faz powietrze-ciecz, która stanowi biologicznie istotny model in vitro. Podejście to można zastosować w przypadku każdego mikroorganizmu nadającego się do długotrwałej kokultury.

Streszczenie

Nietypowalne Haemophilus influenzae (NTHi) to przystosowane do organizmu człowieka bakterie Gram-ujemne, które mogą powodować nawracające i przewlekłe infekcje błony śluzowej dróg oddechowych ^{1; 2}. Aby zbadać mechanizmy, dzięki którym organizmy te przeżywają na powierzchni i wewnątrz tkanek oddechowych, wymagany jest model umożliwiający skuteczną długotrwałą ko-kulturę bakterii i ludzkich komórek. Stosujemy pierwotne ludzkie tkanki nabłonka oddechowego hodowane na granicy powietrze-ciecz, model EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Są to nieunieśmiertelnione, dobrze zróżnicowane tkanki trójwymiarowe, które posiadają połączenia ścisłe, komórki rzęsate i nierzęsate, komórki kubkowe produkujące mucynę oraz zachowują zdolność do produkcji cytokin w odpowiedzi na infekcję.

Ten biologicznie istotny model in vitro ludzkich górnych dróg oddechowych może być wykorzystany na wiele sposobów; ogólnym celem tej metody jest prowadzenie długoterminowej kokultury tkanek EpiAirway z NTHi oraz ilościowe określanie bakterii związanych z komórkami i zinternalizowanych w czasie. Ponadto można określić produkcję mucyn oraz profil cytokin w zainfekowanych kokulturach. Podejście to stanowi udoskonalenie istniejących metod, ponieważ wiele obecnych protokołów wykorzystuje monowarstwy zanurzone lub hodowle komórek ludzkich w systemach Transwell, które nie są w stanie utrzymać infekcji bakteryjnych przez dłuższe okresy³. Na przykład, jeśli organizm może replikować się w znajdującym się powyżej medium, może to prowadzić do nieakceptowalnych poziomów cytotoksyczności i utraty komórek gospodarza, co przerywa eksperyment. Model EpiAirway pozwala na charakteryzację długoterminowych interakcji między gospodarzem a patogenem. Co więcej, ponieważ źródłem EpiAirway są prawidłowe ludzkie komórki tchawcowo-oskrzelowe, a nie linia unieśmiertelniona, każda z nich stanowi doskonałą reprezentację rzeczywistej tkanki górnych dróg oddechowych człowieka, zarówno pod względem struktury, jak i funkcji⁴.

W tej metodzie tkanki EpiAirway są odstawiane od związków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych na 2 dni przed dostawą, a wszystkie procedury są przeprowadzane w warunkach wolnych od antybiotyków. Wymaga to szczególnych środków ostrożności, ponieważ zarówno bakterie, jak i pierwotne tkanki ludzkie są wykorzystywane w tej samej komorze z laminarnym przepływem powietrza i poddawane współhodowli przez dłuższe okresy.

Protokół

1. Przygotowanie komory z laminarnym przepływem powietrza dla tkanek EpiAirway

1. Ubrani w dedykowany fartuch laboratoryjny, z włosami związanymi z tyłu i w rękawiczkach, uruchomcie przepływ laminarny. Po 5 minutach przesuńcie wszystkie narzędzia znajdujące się w komorze (pipety, końcówki, probówki do wirowania itp.) na jedną stronę, spryskajcie wnętrze komory bezpieczeństwa biologicznego oraz przesłonę 70% etanolem i przetrzyjcie czystymi ręcznikami papierowymi. Ponownie spryskajcie oczyszczone wnętrze 70% etanolem i pozostawcie do wyschnięcia. Przenieście narzędzia na czystą stronę i powtórzcie procedurę z użyciem etanolu.
2. Używajcie końcówek do pipet z barierą aerozolową oraz dedykowanych pipet wewnątrz komory. Aby użyć indywidualnie pakowanych sterylnych pipet serologicznych, przeprowadźcie zatyczkę przez przepływ laminarny, otwórzcie ją i wsuńcie pipetę do komory, wyrzucając opakowanie na zewnątrz.
3. Wkładki EpiAirway muszą być obsługiwane za pomocą sterylnych pincet. Umieśćcie zakrzywione pęsety sekcyjne z cienką końcówką o długości 6 cali w samoczynnie uszczelniających workach do sterylizacji i poddajcie autoklawowaniu. Przygotujcie taką ilość, aby każdego dnia dostępne były co najmniej sześć sztuk.

2. Rozpakowywanie tkanek EpiAirway

1. Spryskaj powierzchnię roboczą w komorze z laminarnym przepływem powietrza 70% etanolem i przetrzyj czystymi ręcznikami papierowymi. Spryskaj ponownie i poczekaj, aż powierzchnia wyschnie przed użyciem. Otwórz pudełko EpiAirway i usuń styropian oraz materiały opakowaniowe.
2. Bezantybiotyczne podłoże konserwacyjne EpiAirway, AIR-100-MM ABF (MM), jest produktem zastrzeżonym firmy MatTek i jest przesyłane w zestawie z wkładkami. W komorze z laminarnym przepływem powietrza opisz sześć sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, podając rodzaj podłoża i datę, a następnie poluzuj zakrętki. Spryskaj butelkę z podłożem 70% etanolem i otwórz ją wewnątrz komory. Odmierz 25 ml MM do każdej probówki, używając nowej sterylnej pipety serologicznej dla każdej z nich, mocno zakręć nakrętki i przechowuj w temperaturze 4°C. Codziennie używaj świeżej porcji MM.
3. Powtórz krok 2.2 powyżej, używając nowej butelki 1 X Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) z dodatkiem wapnia i magnezu. Powtórz czynność ponownie, używając D-PBS bez wapnia i magnezu. Wszystkie alikwoty przechowuj w temperaturze 4°C.
4. Wkładki EpiAirway AIR-100 dostarczane są w płytce 24-dołkowej w temperaturze 4°C na stałym podłożu zawierającym agarozę i muszą zostać przeniesione do płytek 6-dołkowych w celu użytkowania. Opisz każdą płytkę datą i opisem, używając markera odpornego na działanie etanolu. Wlej 1 ml MM EpiAirway o temperaturze 4°C do każdego dołka. Wyjmij płytkę transportową z opakowania, spryskaj 70% etanolem i umieść w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Usuń taśmę i otwórz płytkę. Używając autoklawowanej pęsety, usuń wilgotną gazę znajdującą się nad wkładkami EpiAirway.
5. Chwyć wkładkę autoklawowaną pęsetą, wykonując ruch obrotowy, aby ułatwić jej oddzielenie od agarozy, i umieść ją w dołku płytki 6-dołkowej. Część agarozy może przylgnąć do wkładki, szczególnie gdy temperatura płytki transportowej wzrośnie do temperatury otoczenia. Użyj sterylnego patyczka bawełnianego, aby ostrożnie usunąć agarozę z wkładki. Unikaj dotykania membrany i upewnij się, że pod wkładkami nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Umieść płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C z zawartością 5% CO₂.
6. Pozostaw tkanki w inkubatorze na co najmniej 24 godziny w celu ich ekwilibracji przed rozpoczęciem kokultur.

3. Konserwacja tkanek EpiAirway

1. Używając autoklawowanych pęset, wyjmij insert i delikatnie nanieś pipetą 200 µL podgrzanego wcześniej D-PBS z wapniem i magnezem na tkankę, a następnie delikatnie potrząśnij insertem. Przechyl insert pod kątem i przyłóż sterylną końcówkę pipety P1000 do plastikowego pierścienia utrzymującego membranę na dnie insertu. Nie dotykaj tkanki. Odessij płukanie D-PBS i przelej je do opisanej sterylnej probówki kriogenicznej. Próbki można zamrozić w temperaturze -20°C i poddać analizie pod kątem ekspresji mucyn i/lub cytokin w późniejszym terminie.
2. Wymieniaj podstawowe medium MM codziennie, odsysając je i zastępując 1 ml świeżego MM. Do każdego dołka używaj nowej końcówki pipety z filtrem. Zużyte media należy potraktować 10% wybielaczem przez noc, a następnie zutylizować.

4. Inokulacja tkanek EpiAirway

1. Wysiać świeżą kulturę nietypowalnego Haemophilus influenzae (NTHi) z zamrożonego zapasu w glicerolu na agar czekoladowy. Inkubować przez noc w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂.
2. Następnego dnia resuspender pojedyncze kolonie NTHi w uprzednio ogrzanym D-PBS z dodatkiem wapnia i magnezu do uzyskania OD (600 nm) na poziomie około 0,7. Przed pomiarem gęstości optycznej energicznie wymieszać na wortexie. Relacja gęstości optycznej do liczby jednostek tworzących kolonie na ml (CFU/ml) dla NTHi jest taka, że OD (600 nm) wynosząca 0,2 odpowiada w przybliżeniu 1,0 x 10⁸ CFU/ml. Zatem OD (600 nm) na poziomie 0,7 to około 3,5 x 10⁸ CFU/ml. Algorytm ten należy zwalidować dla każdego szczepu NTHi przed inokulacją.
3. Tkanki EpiAirway AIR-100 są hodowane na wkładkach o powierzchni 0,6 cm² i membranie o wielkości oczek 0,4 mikrona. Tkanki składają się z ~8,0 x 10⁵ do ~1,0 x 10⁶ komórek. W związku z tym inokulacja 1,0 x 10⁷ CFU odpowiada wielokrotności zakażenia (MOI) na poziomie około 10 - 12. Aby przeprowadzić inokulację, opłukać każdą wkładkę EpiAirway zgodnie z opisem w punkcie 3.1, a następnie w komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 28 µL zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w punkcie 4.2 na powierzchnię apikalną każdej wkładki EpiAirway. Nie inokulować podłoża basal MM. Umieścić każdą płytkę z powrotem w inkubatorze.

5. Ilościowe oznaczenie inokulum NTHi

1. Przygotować roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) z 0,1% żelatyną (PBS-G) i wysterylizować w autoklawie. Jałowe probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml opisać zgodnie z planowanymi rozcieńczeniami 1:10, ustalonymi na podstawie OD (600 nm) inokulum, a następnie do każdej probówki odnieść 900 µL sterylnego PBS-G.
2. Określić liczbę płytek z agarem czekoladowym niezbędnych do zliczenia zaszczepionych bakterii NTHi. Umieścić płytki w inkubatorze powietrznym dnem do góry, tak aby dno płytki opierało się o połowę górnej części, na jedną godzinę. Pozwoli to na ogrzanie płytek do 37°C oraz wysuszenie ich powierzchni, co ułatwi nanoszenie kropli NTHi.
3. Rozpocząć seryjne rozcieńczenia 1:10 inokulum, dodając 100 µL zawiesiny bakteryjnej z etapu 4.2 do pierwszej probówki. Każdą probówkę z rozcieńczeniem intensywnie mieszać w vorteksie przez 5 sekund przed wykonaniem kolejnego rozcieńczenia. Nanieść alikwoty o objętości 10 µL na uprzednio ogrzane i wysuszone płytki z agarem czekoladowym, wykorzystując połowę płytki dla każdego rozcieńczenia. Na połowie każdej płytki o średnicy 100 mm można zmieścić od pięciu do sześciu alikwotów po 10 µL bez ryzyka ich zlewania się. Po wyschnięciu płytek umieścić je dnem do góry w nawilżonym inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C na noc.
4. Następnego dnia wyznaczyć CFU/ml, zliczając rozcieńczenia, w których w każdej kropli znajduje się od 15 do 30 wyraźnie oddzielnych kolonii, a następnie obliczyć rzeczywistą liczbę żywych bakterii NTHi w inokulum.

6. Długoterminowa kokultura z NTHi

1. Co 24 godziny należy przemyć wkłady zgodnie z instrukcją w punkcie 3.1, a następnie połączyć płukaniny z każdej tkanki zaszczepionej tym samym szczepem bakterii i zamrozić je w temperaturze -20°C w podpisanej probówce kriogenicznej do późniejszej analizy. Próbki te można poddać analizie w celu wykrycia obecności mucyn za pomocą techniki dot blot lub oceny ekspresji cytokin metodą ELISA. Alternatywnie można pobrać tkanki w celu izolacji mRNA i przeprowadzić qPCR dla wybranych genów. Codziennie należy wymieniać podstawowe medium MM zgodnie z punktem 3.2. Procedurę powtarzać przez cały czas trwania kokultury.

7. Pobieranie tkanek EpiAirway

1. Przygotować świeży 1% roztwór saponiny w D-PBS bez wapnia i magnezu, wysterylizować go przez filtrację i ogrzać do 37°C.
2. Ogrzać do 37°C probówkę 50 ml z MM oraz drugą z D-PBS bez wapnia i magnezu.
3. Przygotować probówki do rozcieńczeń zgodnie z punktem 5.1, a także jedną pustą sterylną probówkę Eppendorf 1,5 ml na każdy insert, opisaną numerem insertu i szczepem NTHi.
4. Z EpiAirways można zebrać bakterie całkowicie związane z komórkami, co obejmuje zarówno organizmy przylegające, jak i zinternalizowane, lub tylko bakterie zinternalizowane.
5. Określić liczbę płytek z agarem czekoladowym potrzebnych do metody drop-plating dla NTHi związanych z komórkami lub zinternalizowanych, opisać je i suszyć przez jedną godzinę w inkubatorze powietrznym zgodnie z punktem 5.2.
6. Aby zebrać całkowite bakterie związane z komórkami, przepłukać powierzchnię apikalną EpiAirways trzy razy 200 µl D-PBS bez wapnia i magnezu, a następnie przechylić insert i wypłukać pozostałe MM z błony bazalnej. Pierwszy płukanie można zamrozić do późniejszej analizy; kolejne płukanki należy odrzucić.
7. Umieścić wypłukany insert w nowej płytce 6-dołkowej bez MM i nanieść pipetą 250 µl sterylnego 1% roztworu saponiny z punktu 7.1 na powierzchnię apikalną każdej tkanki. Przenieść do inkubatora na 10 minut.
8. Wyjąć z inkubatora i za pomocą sterylnej końcówki pipety P1000 zeskrobać tkanki z błony, wykonując ruchy posuwisto-zwrotne, a następnie ruchy okrężne, aby usunąć tkankę z krawędzi insertu. Używając sterylnej końcówki pipety P1000 o szerokim otworze, przenieść zawiesinę do pustej opisanej probówki przygotowanej w punkcie 7.3. Dodać 250 µl D-PBS bez wapnia i magnezu na powierzchnię apikalną insertu.
9. Obejrzeć insert pod odwróconym mikroskopem fazowo-kontrastowym, aby sprawdzić, czy pozostała tkanka do zebrania. W razie potrzeby ponownie zeskrobać tkankę inną sterylną końcówką pipety P1000, a następnie dodać tę zawiesinę do probówki z punktu 7.8, używając sterylnej końcówki pipety P1000 o szerokim otworze. Uzupełnić całkowitą objętość w probówce do 1 ml za pomocą D-PBS bez wapnia i magnezu.
10. Intensywnie wymieszać zawiesinę komórkową na wirówce typu vortex z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Używając sterylnej strzykawki 1 ml z igłą 26G, zaciągnąć zawiesinę do strzykawki przez igłę. Powoli przepuścić zawiesinę przez igłę 3 razy, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Ponownie intensywnie wymieszać na vortexie przez jedną minutę.
11. Używając końcówki pipety o szerokim otworze, przenieść 100 µl zawiesiny do pierwszej probówki z rozcieńczeniem przygotowanej w punkcie 7.3. Intensywnie wymieszać na vortexie przez pięć sekund, a następnie wykonać seryjne rozcieńczenia 1:10. Nanieść wybrane rozcieńczenia metodą drop-plating na wysuszone powierzchniowo płytki z agarem czekoladowym.
12. Aby zebrać tylko bakterie zinternalizowane, wypłukać każdy insert 3 razy 200 µl D-PBS bez wapnia i magnezu. Zachować i zamrozić pierwsze płukanie. Dodać siarczan gentamycyny do uprzednio ogrzanego MM do końcowego stężenia 100 µg/ml. Przygotować 1,5 ml pożywki na każdy zbierany insert. Zastąpić bazalne MM pożywką MM zawierającą gentamycynę i dodać 300 µl MM z gentamycyną na powierzchnię apikalną. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze CO₂ na jedną godzinę.
13. Usunąć MM z gentamycyną z powierzchni apikalnej i dokładnie wypłukać powierzchnię apikalną oraz błonę bazalną insertu uprzednio ogrzanym D-PBS bez wapnia i magnezu. Postąpić zgodnie z punktami 7.7-7.11.

8. Reprezentatywne wyniki:

Na Ryc. 1 przedstawiono mikrografie z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (A.) niezakażonej tkanki EpiAirway oraz (B.) tkanki po 5-dniowej kokulturze z NTHi. Długotrwała kokultura z NTHi nie powoduje istotnych uszkodzeń tkanek apikalnych, co podkreśla użyteczność modelu EpiAirway. Wykres przedstawiający liczbę zinternalizowanych bakterii ilościowo określonych w czasie wewnątrz tkanek pokazano na Ryc. 2. Oba wyniki są wysoce powtarzalne, co sprawia, że tkanki EpiAirway stanowią spójny i biologicznie istotny model in vitro ludzkich górnych dróg oddechowych do badania interakcji gospodarz-patogen w przypadku NTHi.

Rysunek 1. Skaningowa mikroskopia elektronowa tkanek EpiAirway. A. Niezinfekowana tkanka kontrolna. B. Tkanka po pięciu dniach kokultury z NTHi. W tkankach zakażonych nie obserwuje się istotnych uszkodzeń powierzchni apikalnej.

Rycina 2. Liczba zinternalizowanych NTHi w czasie podczas kokultury EpiAirway. Szczep R2866 inokulowano w dawce około 1,0 x 10⁷ CFU/insert (Dzień 0), a następnie pobierano próbki w celu oznaczenia zinternalizowanych bakterii w każdym wskazanym punkcie czasowym. Słupki reprezentują n=3 powtórzeń wykonanych w co najmniej dwóch seriach. Słupki błędu oznaczają SD.

Dyskusja

Niniejsza metoda umożliwia badanie długoterminowych interakcji między gospodarzem a patogenem w biologicznie istotnym środowisku pierwotnych ludzkich tkanek dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz. W tym przypadku jako organizm zakaźny wykorzystano NTHi, jednak za pomocą tej metody można ilościowo określić interakcję każdej bakterii, która nie wywołuje w czasie niedopuszczalnej cytotoksyczności. Model EpiAirway może być również stosowany do badania wirusów, leków lub substancji chemicznych oddziałujących na górne...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Saponina	Calbiochem	558255-25GM	1% w D-PBS bez wapnia i magnezu, sterylizować przez filtrację
1 X Dulbecco’s fosforanowy bufor solny z wapniem i magnezem	Lonza Inc.	17-513Q
1 X Dulbecco’s fosforanowy bufor solny bez wapnia i magnezu	Lonza Inc.	17-515Q
Tkanki EpiAirway bez antybiotyków	MatTek Corp.	AIR-100-ABF
Pożywka utrzymująca EpiAirway bez antybiotyków	MatTek Corp.	AIR-100-MM-ABF	Dostarczona w zestawie
10X fosforanowy bufor solny	EMD Millipore	6506	Rozcieńczyć do 1X przed użyciem
Żelatyna	JT Baker	2124-01	Dodać do końcowego stężenia 0,1% w 1 X PBS i autoklawować
Baza pożywki Difco GC (agar czekoladowy)	VWR international	90002-016	Autoklawować 36 g w 500 ml ddH2O i schłodzić do 60°C
Hemoglobina BBL (agar czekoladowy)	VWR international	90000-662	Autoklawować 10 g w 500 ml ddH2O, schłodzić do 60°C i zmieszać z powyższą bazą pożywki GC
Wzbogacacz BD BBL IsoVitaleX (agar czekoladowy)	VWR international	90000-414	Schłodzić mieszaninę bazy pożywki GC i hemoglobiny do 55°C i dodać 10 ml rehydratowanego IsoVitaleX, wylać agar czekoladowy na płytki
Pęseta anatomiczna, z cienką końcówką, zakrzywiona	VWR international	82027-406
Samozamykające się torby do sterylizacji	VWR international	89140-802
Siarczan gentamicyny, 10 mg/ml	Lonza Inc.	17-519Z	Dodać 10 µl/ml do EpiAirway MM w celu eliminacji gentamicyną