Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzowania długoterminowych interakcji gospodarz-patogen

DOI:

10.3791/3261

⸱

2 września 2011

 , 
1Division of Basic Medical Sciences, Mercer University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda pozwala na scharakteryzowanie rozszerzonej kokultury bakteryjnej z EpiAirways, pierwotną ludzką tkanką nabłonka oddechowego wyhodowaną na granicy powietrze-ciecz, biologicznie istotny model in vitro. Podejście to można zastosować w przypadku każdego drobnoustroju, który jest podatny na długotrwałą kokulturę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nietypowalny Haemophilus influenzae (NTHi) to przystosowane do człowieka bakterie Gram-ujemne, które mogą powodować nawracające i przewlekłe infekcje błony śluzowej dróg oddechowych 1; 2. Aby zbadać mechanizmy, dzięki którym organizmy te przeżywają na tkankach układu oddechowego i wewnątrz nich, potrzebny jest model, w którym można przeprowadzić udaną długoterminową kohodowlę bakterii i komórek ludzkich. Wykorzystujemy pierwotne tkanki nabłonka oddechowego człowieka podniesione do granicy faz powietrze-ciecz, model EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Są to nieunieśmiertelnione, dobrze zróżnicowane, trójwymiarowe tkanki, które zawierają ścisłe połączenia, komórki rzęskowe i nierzęskowe, komórki kubkowe, które wytwarzają mucynę i zachowują zdolność do wytwarzania cytokin w odpowiedzi na infekcję.

Ten biologicznie istotny model in vitro górnych dróg oddechowych człowieka może być używany na wiele sposobów; ogólnym celem tej metody jest przeprowadzenie długoterminowej kohodowli tkanek EpiAirway z NTHi i ilościowe określenie liczby bakterii związanych z komórkami i internalizowanych w czasie. Można również określić produkcję mucyny i profil cytokin zakażonych kokultur. Podejście to stanowi ulepszenie istniejących metod, ponieważ wiele obecnych protokołów wykorzystuje zanurzone monowarstwowe lub Transwell hodowle komórek ludzkich, które nie są w stanie wspierać infekcji bakteryjnych przez dłuższy czas3. Na przykład, jeśli organizm może replikować się w leżących nad nim pożywkach, może to spowodować niedopuszczalne poziomy cytotoksyczności i utratę komórek gospodarza, co zatrzyma eksperyment. Model EpiAirway pozwala na scharakteryzowanie długoterminowych interakcji gospodarz-patogen. Co więcej, ponieważ źródłem EpiAirway są normalne ludzkie komórki tchawiczo-oskrzelowe, a nie unieśmiertelniona linia, każda z nich jest doskonałą reprezentacją rzeczywistej tkanki górnych dróg oddechowych człowieka, zarówno pod względem struktury, jak i funkcji.

Dla tej metody, tkanki EpiAirway są odzwyczajane od związków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych na 2 dni przed porodem, a wszystkie procedury są wykonywane w warunkach wolnych od antybiotyków. Wymaga to szczególnych względów, ponieważ zarówno bakterie, jak i pierwotne tkanki ludzkie są używane w tej samej komorze bezpieczeństwa biologicznego i są hodowane wspólnie przez dłuższy czas.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie szafy bezpieczeństwa biologicznego dla tkanek EpiAirway

  1. Ubrany w dedykowany fartuch laboratoryjny, z włosami związanymi z tyłu i założonymi rękawiczkami, rozpocznij przepływ laminarny. Po 5 minutach odsuń wszelkie narzędzia w szafce (pipety, końcówki, probówki wirówkowe itp.) na bok, spryskaj wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego i skrzydło 70% etanolem i wytrzyj czystymi ręcznikami papierowymi. Ponownie spryskaj oczyszczone wnętrze 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Przesuń narzędzia na czystą stronę i powtórz procedurę z etanolem.
  2. W szafie należy używać końcówek do pipet z barierą aerozolową i dedykowanych pipet. Ab....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta pozwala na badanie długoterminowych interakcji gospodarz-patogen w biologicznie istotnym tle pierwotnych tkanek oddechowych człowieka na granicy faz powietrze-ciecz. Tutaj użyliśmy NTHi jako organizmu infekującego, ale interakcja każdej bakterii, która nie wprowadza niedopuszczalnej cytotoksyczności w czasie, może być określona ilościowo za pomocą tej metody. Model EpiAirway może być również wykorzystany do badania wirusów, leków lub substancji chemicznych, które wpływają na górne drogi oddechowe człowieka.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Patrickowi Haydenowi (MatTek) za pomocne dyskusje, oraz Robertowi Smithowi i Libby Perry z Georgia Health Sciences University za ich umiejętności EM. Badanie zostało sfinansowane z grantu NIDCD DC010187 dla D.A.D.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SaponinCalbiochem558255-25GM1% w D-PBS bez wapnia i magnezu, sterylizacja filtra
1 X Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami z wapniem i magnezemLonza Inc.17-513Q
1 x Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezuLonza Inc.17-515Q
Tkanki wolne od antybiotyków EpiAirway MatTekCorp.AIR-100-ABF
EpiAirway bezantybiotykowe media konserwacyjneMatTek Corp.AIR-100-MM-ABFDostarczany z zestawem
10X buforowany fosforanem roztwór soliEMD Millipore6506Rozcieńczyć do 1X przed użyciem
ŻelatynaJT Baker2124-01Dodać do końcowego stężenia 0,1% w 1 X PBS i autoklawie
Difco GC Medium Base (agar czekoladowy)VWR international90002-016Autoklaw 36 g w 500 ml ddH2O i schłodzić do 60°
C BBL Hemoglobina (agar czekoladowy)Autoklaw VWR international90000-66210 g w 500 ml ddH2O, schłodzić do 60° C i wymieszać z pożywką GC powyżej
BD BBL Wzbogacenie IsoVitaleX (agar czekoladowy)VWR international90000-414Schłodzić mieszaninę pożywki GC i hemoglobiny do 55° C i dodać 10 ml uwodnionego IsoVitaleX, wlać czekoladowe płytki agarowe Kleszcze
preparacyjne, cienka końcówka, zakrzywioneVWR international82027-406
Samouszczelniające się woreczki do sterylizacjiVWR international89140-802
Siarczan gentamycyny, 10 mg/mlLonza Inc.17-519ZDodaj 10 mikrolitrów/ml do EpiAirway MM w celu zabicia gentamycyny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
  2. Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

EpiAirway ModelNTHi Co cultureLong term Host pathogen InteractionsPrimary Human Respiratory Epithelial TissuesAir liquid Interface CultureBacterial Adhesion and InvasionMucin Production AnalysisCytokine Profile DeterminationSerial Dilution PlatingGentamycin Protection Assay

Powiązane artykuły