Wykorzystanie modelu EpiAirway do charakteryzowania długoterminowych interakcji gospodarz-patogen

Podsumowanie

Ta metoda pozwala na scharakteryzowanie rozszerzonej kokultury bakteryjnej z EpiAirways, pierwotną ludzką tkanką nabłonka oddechowego wyhodowaną na granicy powietrze-ciecz, biologicznie istotny model in vitro. Podejście to można zastosować w przypadku każdego drobnoustroju, który jest podatny na długotrwałą kokulturę.

Streszczenie

Nietypowalny Haemophilus influenzae (NTHi) to przystosowane do człowieka bakterie Gram-ujemne, które mogą powodować nawracające i przewlekłe infekcje błony śluzowej dróg oddechowych ^{1; 2}. Aby zbadać mechanizmy, dzięki którym organizmy te przeżywają na tkankach układu oddechowego i wewnątrz nich, potrzebny jest model, w którym można przeprowadzić udaną długoterminową kohodowlę bakterii i komórek ludzkich. Wykorzystujemy pierwotne tkanki nabłonka oddechowego człowieka podniesione do granicy faz powietrze-ciecz, model EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Są to nieunieśmiertelnione, dobrze zróżnicowane, trójwymiarowe tkanki, które zawierają ścisłe połączenia, komórki rzęskowe i nierzęskowe, komórki kubkowe, które wytwarzają mucynę i zachowują zdolność do wytwarzania cytokin w odpowiedzi na infekcję.

Ten biologicznie istotny model in vitro górnych dróg oddechowych człowieka może być używany na wiele sposobów; ogólnym celem tej metody jest przeprowadzenie długoterminowej kohodowli tkanek EpiAirway z NTHi i ilościowe określenie liczby bakterii związanych z komórkami i internalizowanych w czasie. Można również określić produkcję mucyny i profil cytokin zakażonych kokultur. Podejście to stanowi ulepszenie istniejących metod, ponieważ wiele obecnych protokołów wykorzystuje zanurzone monowarstwowe lub Transwell hodowle komórek ludzkich, które nie są w stanie wspierać infekcji bakteryjnych przez dłuższy czas³. Na przykład, jeśli organizm może replikować się w leżących nad nim pożywkach, może to spowodować niedopuszczalne poziomy cytotoksyczności i utratę komórek gospodarza, co zatrzyma eksperyment. Model EpiAirway pozwala na scharakteryzowanie długoterminowych interakcji gospodarz-patogen. Co więcej, ponieważ źródłem EpiAirway są normalne ludzkie komórki tchawiczo-oskrzelowe, a nie unieśmiertelniona linia, każda z nich jest doskonałą reprezentacją rzeczywistej tkanki górnych dróg oddechowych człowieka, zarówno pod względem struktury, jak i funkcji.

Dla tej metody, tkanki EpiAirway są odzwyczajane od związków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych na 2 dni przed porodem, a wszystkie procedury są wykonywane w warunkach wolnych od antybiotyków. Wymaga to szczególnych względów, ponieważ zarówno bakterie, jak i pierwotne tkanki ludzkie są używane w tej samej komorze bezpieczeństwa biologicznego i są hodowane wspólnie przez dłuższy czas.

Protokół

1. Przygotowanie szafy bezpieczeństwa biologicznego dla tkanek EpiAirway

1. Ubrany w dedykowany fartuch laboratoryjny, z włosami związanymi z tyłu i założonymi rękawiczkami, rozpocznij przepływ laminarny. Po 5 minutach odsuń wszelkie narzędzia w szafce (pipety, końcówki, probówki wirówkowe itp.) na bok, spryskaj wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego i skrzydło 70% etanolem i wytrzyj czystymi ręcznikami papierowymi. Ponownie spryskaj oczyszczone wnętrze 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Przesuń narzędzia na czystą stronę i powtórz procedurę z etanolem.
2. W szafie należy używać końcówek do pipet z barierą aerozolową i dedykowanych pipet. Aby użyć pojedynczo zapakowanych sterylnych pipet serologicznych, przełóż zatkaną końcówkę przez przepływ laminarny, otwórz i wsuń pipetę do szafki, wyrzucając opakowanie na zewnątrz.
3. Z wkładkami EpiAirway należy obchodzić się za pomocą sterylnych kleszczyków. Umieść 6-calowe zakrzywione kleszcze preparacyjne z cienką końcówką w samouszczelniających się woreczkach sterylizacyjnych i autoklawie. Przygotuj się na tyle, aby mieć pod ręką co najmniej sześć dziennie.

2. Rozpakowywanie tkanek EpiAirway

1. Spryskaj powierzchnię roboczą w komorze bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i wytrzyj czystymi ręcznikami papierowymi. Spryskaj ponownie i pozostaw powierzchnię do wyschnięcia przed użyciem. Otwórz pudełko EpiAirway i wyrzuć styropian oraz materiał opakowaniowy.
2. Niezawierające antybiotyków media konserwacyjne EpiAirway, AIR-100-MM ABF (MM), są zastrzeżone przez MatTek i są wysyłane w zestawie z wkładkami. W komorze bezpieczeństwa biologicznego oznacz sześć sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml typem pożywki i datą, a następnie poluzuj nakrętki. Spryskaj butelkę z mediami 70% etanolem i otwórz wnętrze szafki. Podać 25 ml MM do każdej probówki za pomocą nowej sterylnej pipety serologicznej dla każdej probówki, zakręcić nakrętki i przechowywać w temperaturze 4°C. Codziennie stosować świeżą porcję MM.
3. Powtórzyć czynności opisane w pkt 2.2 powyżej, używając świeżej butelki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami 1 X Dulbecco (D-PBS) z wapniem i magnezem. Powtórz ponownie, używając D-PBS bez wapnia i magnezu. Przechowywać wszystkie porcje w temperaturze 4°C.
4. Wkładki EpiAirway AIR-100 są dostarczane do 24-dołkowej płytki w temperaturze 4°C na stałych podłożach zawierających agarozę i muszą być umieszczone w 6-dołkowych płytkach do użycia. Oznacz każdą tabliczkę datą i opisem za pomocą markera odpornego na etanol. Umieść 1 mililitr EpiAirway MM o temperaturze 4°C w każdym dołku. Wyjmij płytkę transportową z opakowania, spryskaj ją 70% etanolem i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Usuń taśmę i otwórz płytkę. Za pomocą autoklawowanych kleszczyków usuń wilgotną gazę z wkładek EpiAirway.
5. Podnieś wkładkę za pomocą autoklawowanych kleszczyków, wykonując ruch obrotowy, aby pomóc w uwolnieniu jej z agarozy, i umieść w dołku na 6-dołkowej płytce. Część agarozy może przylegać do wkładki, szczególnie gdy temperatura płyty transportowej wzrasta do temperatury otoczenia. Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby ostrożnie usunąć agarozę z wkładu. Unikaj dotykania membrany i sprawdź, czy pod wkładkami nie utknęły pęcherzyki powietrza. Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37°C z 5% CO_{2 .}
6. Przed rozpoczęciem współhodowli należy odczekać co najmniej 24 godziny, aby tkanki osiągnęły równowagę w inkubatorze.

3. Utrzymanie tkanek EpiAirway

1. Za pomocą autoklawowanych kleszczyków podnieś wkładkę i delikatnie odpipetuj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego D-PBS z wapniem i magnezem na tkankę i kołysz wkładką. Przechyl wkładkę pod kątem i przyłóż sterylną końcówkę pipety P1000 do plastikowego pierścienia, który przytrzymuje membranę na spodzie wkładu. Nie dotykaj chusteczki. Odessać płukankę D-PBS i umieścić w oznakowanym sterylnym kriowiale. Próbki można zamrozić w temperaturze -20°C i oznaczyć pod kątem ekspresji mucyny i/lub cytokin w późniejszym terminie.
2. Zmieniaj podstawowy MM codziennie, odsysając i zastępując 1 mililitrem świeżego MM. Do każdego dołka należy użyć nowej końcówki pipety barierowej. Zużyte podłoże należy potraktować 10% wybielaczem przez noc i wyrzucić.

4. Inokulacja tkanek EpiAirway

1. Usunąć świeżą kulturę Haemophilus influenzae (NTHi) z zamrożonego bulionu glicerolowego na agar czekoladowy. Uprawiaj przez noc w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
2. Następnego dnia ponownie zawiesić pojedyncze kolonie NTHi we wstępnie podgrzanym D-PBS z wapniem i magnezem do OD (600 nm) około 0,7. Energicznie wirować przed pomiarem gęstości optycznej. Zależność gęstości optycznej od jednostek tworzących kolonie na ml (CFU/ml) NTHi polega na tym, że OD (600 nm) 0,2 w przybliżeniu wynosi 1,0 x 10⁸ CFU/ml. Dlatego OD (600 nm) 0,7 wynosi około 3,5 x 10⁸ CFU/ml. Algorytm ten powinien zostać zweryfikowany dla każdego szczepu NTHi przed inokulacją.
3. Tkanki EpiAirway AIR-100 są hodowane na wkładkach o powierzchni 0,6^cm2 i membranie 0,4 mikrona. Tkanki składają się z ~8,0 x 10⁵ do ~1,0 x 10⁶ komórek. Dlatego inokulacja 1,0 x 10⁷ CFU odpowiada wielokrotności infekcji około 10 - 12. Aby zaszczepić, przepłukać każdą wkładkę EpiAirway jak w ppkt 3.1, a następnie dodać 28 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w ppkt 4.2 do powierzchni wierzchołkowej każdej wkładki EpiAirway w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Nie należy szczepić podstawnego MM. Umieścić każdą płytkę z powrotem w inkubatorze.

5. Kwantyfikacja inokulum NTHi

1. Przygotować buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) z 0,1% żelatyną (PBS-G), w autoklawie do sterylizacji. Oznaczyć sterylne probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml żądanymi rozcieńczeniami 1:10 w oparciu o OD (600 nm) inokulum i podwielokrotnością 900 mikrolitrów sterylnego PBS-G do każdej probówki.
2. Określić liczbę płytek agaru czekoladowego wymaganych do wyliczenia zaszczepionego NTHi. Umieść te płytki w inkubatorze powietrznym do góry nogami, tak aby spód płytki spoczywał na połowie górnej części przez godzinę. Pozwoli to zarówno na ogrzanie płytki do 37°C, jak i wyschnięcie powierzchni, co ułatwi powlekanie kroplowe NTHi.
3. Rozpocznij seryjne rozcieńczenia inokulum w stosunku 1:10, dodając 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej z 4,2 do pierwszej probówki. Energicznie wirować każde rozcieńczenie przez 5 sekund przed przygotowaniem następnego. Upuść 10 mikrolitrów porcji na wstępnie podgrzane i wysuszone powierzchniowo czekoladowe płytki agarowe, używając połowy płytki na każde rozcieńczenie. Pięć do sześciu podwielokrotności o pojemności 10 mikrolitrów może zmieścić się na jednej połowie każdej płytki o średnicy 100 mm bez konieczności łączenia się ze sobą. Po wyschnięciu umieść na noc do góry nogami w nawilżonym inkubatorze CO₂ o temperaturze 37°C.
4. Następnego dnia określ jtk/ml, licząc rozcieńczenia, które mają 15-30 różnych kolonii w każdej kropli i obliczając z powrotem do twojego rzeczywistego żywotnego inokulum NTHi.

6. Długoterminowa kokultura z NTHi

1. Co 24 godziny przemyć wkładki jak w ppkt 3.1, a następnie zebrać popłuczyny każdej tkanki, która została zaszczepiona tym samym szczepem bakterii i zamrozić w temperaturze -20°C w oznakowanym kriowiale do przyszłej analizy. Próbki te można oznaczyć na obecność mucyny za pomocą plam punktowych lub pod kątem ekspresji cytokin za pomocą testu ELISA. Alternatywnie można pobrać tkanki pod kątem mRNA, a qPCR można przeprowadzić na genach będących przedmiotem zainteresowania. Zmieniaj podstawowy MM codziennie, jak w 3.2. Kontynuuj przez czas trwania kokultury.

7. Pobieranie tkanek EpiAirway

1. Przygotować świeży 1% roztwór saponiny w D-PBS bez wapnia i magnezu, przefiltrować-wysterylizować i ogrzać do 37°C.
2. Podgrzej 50 ml probówkę MM i drugą probówkę D-PBS bez wapnia i magnezu do 37°C.
3. Przygotować probówki do rozcieńczania jak w ppkt. 5.1, jak również jedną pustą sterylną probówkę Eppendorfa o pojemności 1,5 ml na wkładkę, oznaczoną numerem wkładki i szczepem NTHi.
4. EpiAirways mogą być zbierane zarówno dla wszystkich bakterii związanych z komórkami, co obejmuje zarówno organizmy przylegające, jak i zinternalizowane, lub tylko dla bakterii zinternalizowanych.
5. Określić liczbę płytek z agarem czekoladowym potrzebną do umieszczenia płytki na płytce NTHi związanej z komórką lub zaatakowanej, oznaczyć i wysuszyć przez jedną godzinę w inkubatorze powietrznym, jak w ppkt 5.2.
6. Aby zebrać wszystkie bakterie związane z komórkami, należy trzykrotnie przepłukać wierzchołkową powierzchnię EpiAirways 200 mikrolitrami D-PBS bez wapnia lub magnezu, a następnie przechylić wkładkę i wypłukać pozostały MM z błony podstawnej. Pierwsze pranie można zamrozić do późniejszej analizy; Wyrzuć następujące prania.
7. Umieścić umytą wkładkę w świeżej 6-dołkowej płytce bez MM i odpipetować 250 mikrolitrów sterylnego 1% roztworu saponin z 7,1 na wierzchołkową powierzchnię każdej tkanki. Wróć do inkubatora na 10 minut.
8. Wyjąć z inkubatora i za pomocą sterylnej końcówki pipety P1000 wyszorować tkanki z membrany, wykonując ruchy w przód iw tył, a następnie ruchem okrężnym, aby usunąć tkankę z krawędzi wkładki. Używając sterylnej końcówki do pipety P1000 o dużym otworze, umieścić zawiesinę w pustej oznaczonej probówce przygotowanej w ppkt 7.3. Dodać 250 mikrolitrów D-PBS bez wapnia i magnezu na wierzchołkową powierzchnię wkładki.
9. Zbadaj wkładkę za pomocą mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym, aby określić, czy pozostała jakaś tkanka do pobrania. W razie potrzeby ponownie wyszorować inną sterylną końcówką do pipety P1000, a następnie dodać tę zawiesinę do probówki z 7,8 za pomocą sterylnej końcówki do pipety P1000 o dużym otworze. Doprowadzić całkowitą objętość probówki do 1 mililitra za pomocą D-PBS bez wapnia i magnezu.
10. Energicznie wirować zawiesinę komórek z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Za pomocą jałowej strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 26 należy zassać zawiesinę do strzykawki przez igłę. Powoli przepuść zawiesinę przez igłę 3 razy, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków. Ponownie energicznie wirować przez minutę.
11. Za pomocą końcówki do pipet o dużym otworze umieścić 100 mikrolitrów zawiesiny w pierwszej probówce rozcieńczającej, przygotowanej w ppkt 7.3. Wirować energicznie przez pięć sekund, a następnie wykonać seryjne rozcieńczenia 1:10. Umieść pożądane rozcieńczenia na wysuszonych powierzchniowo płytkach z agarem czekoladowym.
12. Aby zebrać tylko zinternalizowane bakterie, umyj każdą wkładkę 3 razy 200 mikrolitrami D-PBS bez wapnia i magnezu. Zachowaj i zamroź pierwsze pranie. Dodać siarczan gentamycyny do wstępnie podgrzanego MM do końcowego stężenia 100 mikrogramów/ml. Przygotować 1,5 ml pożywki na wkładkę do zbioru. Zastąp podstawowy MM MM MM zawierającym gentamycynę i dodaj 300 mikrolitrów MM zawierającego gentamycynę na powierzchnię wierzchołkową. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze CO₂ na jedną godzinę.
13. Usunąć MM zawierający gentamycynę z powierzchni wierzchołkowej i dokładnie umyć powierzchnię wierzchołkową i błonę podstawną wkładki wstępnie podgrzanym D-PBS bez wapnia i magnezu. Postępować jak w 7.7-7.11.

8. Reprezentatywne wyniki:

Skaningowe mikrofotografie elektronowe (A.) niezainfekowanej tkanki EpiAirway i (B.) tkanki po 5-dniowej kohodowli z NTHi są pokazane na rysunku 1. Długotrwała kohodowla z NTHi nie powoduje znacznego uszkodzenia tkanek wierzchołkowych, co podkreśla użyteczność modelu EpiAirway. Wykres przedstawiający liczbę zinternalizowanych bakterii oznaczonych ilościowo w czasie wewnątrz tkanek przedstawiono na rysunku 2. Oba wyniki są dość powtarzalne, co sprawia, że tkanki EpiAirway są spójnym i biologicznie istotnym modelem górnych dróg oddechowych człowieka in vitro, w którym można badać interakcje NTHi gospodarz-patogen

.

Rysunek 1. Skaningowa mikroskopia elektronowa tkanek EpiAirway. A. Niezakażona tkanka kontrolna. B. Tkanka po pięciu dniach kohodowli z NTHi. W zakażonych tkankach nie obserwuje się znaczących uszkodzeń powierzchni wierzchołkowej.

Rysunek 2. Liczba NTHi zinternalizowanych w czasie podczas kohodowli EpiAirway. Szczep R2866 inokulowano w ilości około 1,0 x 10⁷ jtk/wstawkę (dzień 0), a następnie zebrano w poszukiwaniu bakterii internalizowanych w każdym wskazanym punkcie czasowym. Słupki reprezentują n=3 powtórzenia w co najmniej duplikacie. Paski błędów to SD.

Dyskusja

Metoda ta pozwala na badanie długoterminowych interakcji gospodarz-patogen w biologicznie istotnym tle pierwotnych tkanek oddechowych człowieka na granicy faz powietrze-ciecz. Tutaj użyliśmy NTHi jako organizmu infekującego, ale interakcja każdej bakterii, która nie wprowadza niedopuszczalnej cytotoksyczności w czasie, może być określona ilościowo za pomocą tej metody. Model EpiAirway może być również wykorzystany do badania wirusów, leków lub substancji chemicznych, które wpływają na górne drogi oddechowe człowieka^...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Saponin	Calbiochem	558255-25GM	1% w D-PBS bez wapnia i magnezu, sterylizacja filtra
1 X Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami z wapniem i magnezem	Lonza Inc.	17-513Q
1 x Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezu	Lonza Inc.	17-515Q
Tkanki wolne od antybiotyków EpiAirway MatTek	Corp.	AIR-100-ABF
EpiAirway bezantybiotykowe media konserwacyjne	MatTek Corp.	AIR-100-MM-ABF	Dostarczany z zestawem
10X buforowany fosforanem roztwór soli	EMD Millipore	6506	Rozcieńczyć do 1X przed użyciem
Żelatyna	JT Baker	2124-01	Dodać do końcowego stężenia 0,1% w 1 X PBS i autoklawie
Difco GC Medium Base (agar czekoladowy)	VWR international	90002-016	Autoklaw 36 g w 500 ml ddH2O i schłodzić do 60°
C BBL Hemoglobina (agar czekoladowy)	Autoklaw VWR international	90000-662	10 g w 500 ml ddH2O, schłodzić do 60° C i wymieszać z pożywką GC powyżej
BD BBL Wzbogacenie IsoVitaleX (agar czekoladowy)	VWR international	90000-414	Schłodzić mieszaninę pożywki GC i hemoglobiny do 55° C i dodać 10 ml uwodnionego IsoVitaleX, wlać czekoladowe płytki agarowe Kleszcze
preparacyjne, cienka końcówka, zakrzywione	VWR international	82027-406
Samouszczelniające się woreczki do sterylizacji	VWR international	89140-802
Siarczan gentamycyny, 10 mg/ml	Lonza Inc.	17-519Z	Dodaj 10 mikrolitrów/ml do EpiAirway MM w celu zabicia gentamycyny