Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów przy użyciu histochemii z podwójnym znakowaniem oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX/SDH)

Podsumowanie

Metoda podwójnego znakowania oksydazy cytochromu c/dehydrogenazy sodowej (COX/SDH) umożliwia bezpośrednią wizualizację niedoborów enzymów oddechowych mitochondriów w świeżo zamrożonych przekrojach tkanek. Jest to prosta technika histochemiczna, która okazuje się przydatna w badaniu chorób mitochondrialnych, starzenia się oraz zaburzeń związanych z wiekiem.

Streszczenie

Defekty mitochondrialnego DNA (mtDNA) stanowią istotną przyczynę chorób i mogą leżeć u podstaw procesów starzenia oraz zmian z nimi związanych ^1,2. Mitochondrialna teoria starzenia sugeruje, że mutacje mtDNA, które mogą zaburzać homeostazę bioenergetyczną i funkcje komórkowe, odgrywają rolę w procesie starzenia ³. Zebrano wiele dowodów wspierających tę teorię ^1,4, czego przykładem jest mysz mutator mtDNA ⁵; jednak precyzyjna rola uszkodzeń mtDNA w starzeniu nie jest w pełni zrozumiała ^6,7.

Obserwacja aktywności enzymów oddechowych jest prostym podejściem do badania dysfunkcji mitochondriów. Kompleks IV, czyli oksydaza cytochromu c (COX), jest niezbędny dla funkcji mitochondrialnych. Podjednostki katalityczne COX są kodowane przez mtDNA i są niezbędne do montażu kompleksu (Rysunek 1). Zatem prawidłowa synteza i funkcja opierają się w dużej mierze na integralności mtDNA ². Chociaż można badać inne kompleksy oddechowe, kompleksy IV i II są najbardziej podatne na badanie histochemiczne ^8,9. Kompleks II, czyli dehydrogenaza bursztyczanowa (SDH), jest w całości kodowany przez DNA jądrowe (Rysunek 1), a jego aktywność zazwyczaj nie jest zaburzona przez uszkodzenia mtDNA, choć jej wzrost może wskazywać na biogenezę mitochondriów ^10-12. Zaburzenia mtDNA obserwowane w chorobach mitochondrialnych, starzeniu się oraz chorobach związanych z wiekiem często prowadzą do obecności komórek o niskiej lub całkowicie zniesionej aktywności COX ^2,12-14. Chociaż aktywność COX i SDH można badać indywidualnie, sekwencyjna metoda podwójnego znakowania ^15,16 okazała się korzystna w lokalizowaniu komórek z dysfunkcją mitochondrialną ^12,17-21.

Wyznaczono wiele optymalnych parametrów analizy, takich jak stężenie substratu, akceptory/donory elektronów, pośrednie przenośniki elektronów, wpływ pH oraz czas reakcji ^9,22,23. 3,3'-diaminobenzydyna (DAB) jest skutecznym i niezawodnym donorem elektronów ²². W komórkach z funkcjonującą COX brązowy polimerowy produkt indaminy zlokalizuje się w grzebieniach mitochondriów i nasyci komórki ²². Komórki z dysfunkcyjną COX nie zostaną zatem nasycone produktem DAB, co umożliwi wizualizację aktywności SDH poprzez redukcję nitrobłękitu tetrazolium (NBT), akceptora elektronów, do niebieskiego produktu końcowego – formazanu ^9,24. Cytochrom c oraz substraty w postaci bursztynianu sodu są dodawane w celu normalizacji poziomów endogennych pomiędzy tkankami kontrolnymi a tkanek chorych/zmutowanych ⁹. Katalaza jest dodawana profilaktycznie, aby uniknąć możliwych reakcji kontaminacyjnych wynikających z aktywności peroksydazy ^9,22. Metanosiarczan fenazyny (PMS), pośredni przenośnik elektronów, jest stosowany wraz z azotkiem sodu, inhibitorem łańcucha oddechowego, aby zwiększyć tworzenie końcowych produktów reakcji ^9,25. Mimo tych informacji, niektóre krytyczne szczegóły wpływające na wynik tej pozornie prostej analizy, a także kontrole specyficzności i ulepszenia techniki, nie zostały jeszcze przedstawione.

Protokół

1. Przygotowanie tkanki do kriotomii

1. Uśmierć zwierzę poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych lub dekapitację, zgodnie z posiadanym zezwoleniem etycznym.
2. Szybko pobierz interesujące tkanki (np. mózg) i gwałtownie zamroź je na suchym lodzie (tkanki mogą wymagać zamrożenia w izopentanie lub propanie schłodzonym ciekłym azotem w celu uzyskania optymalnej morfologii). Przechowuj tkanki w folii aluminiowej w temperaturze -80 °C do momentu przystąpienia do krojenia.
3. Zatop zamrożoną tkankę w preparacie do kriosekcji.
4. Pobierz przekroje kriosztatem o grubości 14-μm w temperaturze -21 °C (może być konieczna korekta temperatury ....

Dyskusja

Połączona metoda histochemiczna COX/SDH umożliwia wizualizację komórek z dysfunkcją mitochondriów. Technika ta, której wczesne badania datują się na 1968 rok, pozostaje popularna, a wielu uznaje ją za „złoty standard” w identyfikacji chorób mitochondrialnych u pacjentów^14,19,26,27. Obecnie jest ona często wykorzystywana do badania procesów starzenia napędzanych mutacjami mtDNA oraz zaburzeń związanych ze starzeniem ^{12,13,18,20,21,24}. Metoda podwójnego znakowania COX/SDH jest często stosowana równole.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Suchy lód	AGA Gas AB	forma blokowa
Izopentan (2-metylobutane)	Sigma-Aldrich	277258 CAS: 78-78-4
Roztwór do zatapiania w kriotomacie	Sakura Finetek	Tkanka Tek 4583
Kriostat	Microm International	Microm model HM 500M
Preparaty histologiczne	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ
Lamelki Szkło borokrzemowe	VWR international	16004-098	24 x 50 mm
Papier filtracyjny	Munktell Filter AB	Jakość: 1350 Numer artykułu: 242 001	430 x 430 mm
3,3′tetrahydrochlorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)	Sigma-Aldrich	Sigma Liquid Substrate System, D7304
Cytochrom c (typ III, z serca konia)	Sigma-Aldrich	C2506 CAS: 9007-43-6
Katalaza wołowa (z wątroby)	Sigma-Aldrich	C9322 CAS: 9001-05-2
Nitroblue tetrazolium (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876 CAS: 298-83-9
Karboksylan sodu (sukcynian sodu)	Sigma-Aldrich	S2378 CAS: 6106-21-4
Metosulfian fenazyny (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625 CAS: 299-11-6	PMS jest światłoczuły. Należy chronić przed światłem.
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S8032 CAS: 26628-22-8
Ksylen	VWR international	EM-XX0060-4
Entellan	VWR international	100503-870
Malonian (Kwas malonowy)	Sigma-Aldrich	M1296 CAS: 141-82-2