Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów za pomocą oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX / SDH) Podwójne znakowanie Histochemia

Summary

Metoda podwójnego znakowania oksydazy cytochromu c/dehydrogenazy sodowej (COX/SDH) pozwala na bezpośrednią wizualizację niedoborów mitochondrialnych enzymów oddechowych w świeżo zamrożonych skrawkach tkanek. Jest to prosta technika histochemiczna i jest przydatna w badaniu chorób mitochondrialnych, starzenia się i zaburzeń związanych ze starzeniem się.

Abstract

Defekty mitochondrialnego DNA (mtDNA) są ważną przyczyną chorób i mogą leżeć u podstaw starzenia się i zmian związanych ze starzeniem ^{się 1,2}. Mitochondrialna teoria starzenia się sugeruje rolę mutacji mtDNA, które mogą zmieniać homeostazę bioenergetyczną i funkcję komórkową w procesie starzenia ^{się 3}. Na poparcie tej teorii zebrano wiele dowodów ^1,4, czego przykładem jest mysz z mutatorem mtDNA ⁵; jednak dokładna rola uszkodzenia mtDNA w starzeniu się nie jest do końca poznana ^6,7.

Obserwacja aktywności enzymów oddechowych jest prostym podejściem do badania dysfunkcji mitochondriów. Kompleks IV, czyli oksydaza cytochromu c (COX), jest niezbędna do funkcjonowania mitochondriów. Podjednostki katalityczne COX są kodowane przez mtDNA i są niezbędne do złożenia kompleksu (ryc. 1). Tak więc prawidłowa synteza i funkcja są w dużej mierze oparte na integralności mtDNA ². Chociaż można by badać inne kompleksy oddechowe, kompleksy IV i II są najbardziej podatne na badanie histochemiczne ^8,9. Kompleks II, czyli dehydrogenaza bursztynianowa (SDH), jest całkowicie kodowana przez jądrowy DNA (ryc. 1), a na jego aktywność zwykle nie ma wpływu upośledzone mtDNA, chociaż wzrost może wskazywać na biogenezę mitochondriów ^10-12. Upośledzone mtDNA obserwowane w chorobach mitochondrialnych, starzeniu się i chorobach związanych z wiekiem często prowadzi do obecności komórek o niskiej lub nieobecnej aktywności COX ^2,12-14. Chociaż aktywność COX i SDH można badać indywidualnie, sekwencyjna metoda podwójnego znakowania ^15,16 okazała się korzystna w lokalizowaniu komórek z dysfunkcją mitochondriów ^12,17-21.

Wiele optymalnych składów testu zostało już określonych, takich jak stężenie substratu, akceptory/donory elektronów, pośrednie nośniki elektronów, wpływ pH i czas reakcji ^9,22,23. 3,3'-diaminobenzydyna (DAB) jest skutecznym i niezawodnym donorem elektronów ²². W komórkach z funkcjonalnym COX brązowy produkt polimeru indyminy będzie lokalizował się w grzebieniach mitochondrialnych i nasycał komórki ²². Komórki z dysfunkcyjnym COX nie będą zatem wysycane produktem DAB, co pozwoli na wizualizację aktywności SDH poprzez redukcję tetrazolu nitroniebieskiego (NBT), akceptora elektronów, do produktu końcowego niebieskiego formazanu ^9,24. Substraty cytochromu c i bursztynianu sodu dodaje się w celu normalizacji poziomów endogennych między tkankami kontrolnymi i chorymi/zmutowanymi ⁹. Katalazę dodaje się jako środek ostrożności w celu uniknięcia możliwych reakcji skażających spowodowanych aktywnością peroksydazy ^9,22. Metosiarczan fenazyny (PMS), pośredni nośnik elektronów, jest stosowany w połączeniu z azydkiem sodu, inhibitorem łańcucha oddechowego, w celu zwiększenia tworzenia końcowych produktów reakcji ^9,25. Pomimo tych informacji, niektóre krytyczne szczegóły wpływające na wynik tego pozornie prostego testu, oprócz kontroli swoistości i postępów w technice, nie zostały jeszcze przedstawione.

Protocol

1. Przygotowanie tkanek do kriosekcji

1. Zwierzę należy złożyć w ofierze poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub ścięcie głowy, zgodnie z dostępnym zezwoleniem etycznym.
2. Szybko zbierz interesujące Cię tkanki (np. mózg) i szybko zamroź na suchym lodzie (tkanki mogą wymagać zamrożenia w izopentanie lub propanie schłodzonym ciekłym azotem w celu uzyskania optymalnej morfologii). Chusteczki należy przechowywać w folii aluminiowej w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do cięcia.
3. Osadź zamrożoną tkankę w ramach przygotowań do kriosekcji.
4. Zebrać skrawki kriostatu 14 μm w temperaturze -21 °C (może być konieczne dostosowanie t....

Discussion

Połączona metoda histochemiczna COX/SDH umożliwia wizualizację komórek z dysfunkcją mitochondriów. Ta technika, której wczesne badania sięgają 1968 roku, pozostaje popularna, a wielu uważa ją za "złoty standard" w identyfikacji chorób mitochondrialnych u pacjentów^14,19,26,27. Obecnie jest często używany do badania starzenia się i zaburzeń związanych ze starzeniem się spowodowanych mutacjami mtDNA ^{12,13,18,20,21,24}. Metoda podwójnego znakowania COX/SDH jest często stosowana równolegle z innymi techni.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suchy lód	AGA Gaz AB	w formie
Izpentan (2-metylobutan)	Sigma-Aldrich	277258 CAS: 78-78-4
Roztwór do zatapiania cyrostatu	Sakura Finetek	Tissue Tek 4583
Cryostat	Microm International	Microm Model HM 500M
Slides	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Super Frost Plus Menzel Glä ser J1800AMWZ
Szkła nakrywkowe Szkło borokrzemianowe	VWR international	16004-098	24 x 50 mm
Bibuła filtracyjna	Filtr Munktell AB	Jakość: 1350 Numer artykułu: 242 001	430 x 430 mm
3,3′-diaminobenzydyny tetrachlorowodorek (DAB)	Sigma-Aldrich	Sigma Liquid Substrate System, D7304
Cytochrom c (Typ III, od końskie serce)	Sigma-Aldrich	C2506 CAS: 9007-43-6
Katalaza bydlęca (z wątroby)	Sigma-Aldrich	C9322 CAS: 9001-05-2
Nitroniebieski tetrazolium (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876 CAS: 298-83-9
Bursztynian sodu	Sigma-Aldrich	S2378 CAS: 6106-21-4
Metosiarczan fenazyny (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625 CAS: 299-11-6	PMS jest wrażliwy na światło. Tarcza przed światłem.
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S8032 CAS: 26628-22-8
Ksylen	VWR international	EM-XX0060-4
Entellan	VWR international	100503-870
Malonian (kwas malonowy)	Sigma-Aldrich	M1296 CAS: 141-82-2