Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

15.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3267

⸱

7 października 2011

 ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Centre for Immunology and Infection, Department of Biology and HYMS, University of York, 3Department of Genetics, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metodę znakowania naczyń krwionośnych w skórze zarodkowej i grasicy.

Streszczenie

Utworzenie funkcjonalnej sieci naczyń krwionośnych jest kluczowym elementem organogenezy i jest niezbędne do optymalnego funkcjonowania narządu. Na przykład w grasicy prawidłowy proces tworzenia i rozmieszczenia naczyń krwionośnych jest niezbędny dla wniknięcia tymocytów do narządu oraz wyjścia dojrzałych limfocytów T do obwodu. Przestrzenny układ naczyń krwionośnych w grasicy zależy od sygnałów pochodzących z lokalnego mikrośrodowiska, a mianowicie z komórek nabłonkowych grasicy (TEC). Kilka niedawnych doniesień sugeruje, że zaburzenia tych sygnałów prowadzą do wad naczyń krwionośnych grasicy 1,2. Wcześniejsze badania opisały techniki stosowane do znakowania naczyń krwionośnych grasicy u noworodków i osobników dorosłych 1,2. Przedstawiamy tutaj technikę znakowania naczyń krwionośnych w embrionalnej grasicy. Metoda ta łączy zastosowanie iniekcji do żyły twarzowej z użyciem dekstranu-FITC lub lektyny z Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia I (GSL 1 – izolektyna B4) oraz barwienia przeciwciałem anty-CD31 w celu identyfikacji struktur naczyniowych grasicy i przeciwciałem anty-PDGFR-β do znakowania okołonaczyniowej mezenchymy grasicy 3-5. Przedstawiono również możliwość zastosowania krioprzekrojów lub przekrojów wykonanych za pomocą wibrotomu. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji wad naczyniowych grasicy, co jest kluczowe dla zdefiniowania roli cząsteczek pochodzących z TEC w tworzeniu naczyń krwionośnych grasicy. Ponieważ metoda ta znakuje cały układ naczyniowy, może być ona również stosowana do analizy sieci naczyniowych w wielu narządach i tkankach embrionu, w tym w skórze i sercu 6-10.

Protokół

1. Iniekcje do żyły twarzowej z zastosowaniem dekstranu znakowanego fluoresceiną oraz lektyny GSL I-isolectin B4 w celu znakowania naczyń krwionośnych zarodka

  1. Przygotować FITC-dekstran (50ug/mL) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) lub GSL 1 - izolektynę B4 (20ug/200uL) w PBS w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5mL i ogrzać do 37°C. Dodać 100uL roztwoku zapasu 1,25mM Fast Green/PBS do roztworu FITC-dekstranu (objętość całkowita 1mL) oraz 180uL roztwoku zapasu 1,25mM Fast Green/PBS do GSL 1 - izolektyny B4 (objętość całkowita 200uL), tak aby roztwór stał się widocznie niebieski.
  2. Wypreparować zarodki w stadium E14.5-E18.5 wraz z woreczkiem żółtkowym, pozostawiając nienaruszony szypuł allantois (tętnicę i żyłę pępowinową).
  3. Przenieść zarodki do nowej szalki Petriego (60 X 15 mm) i zanurzyć je w PBS w temperaturze pokojowej.
  4. Ułożyć zarodek tak, aby uzyskać widok strzałkowy głowy/twarzy. Użyć mikro-pincety do delikatnego uchwycenia zarodka za głowę.
  5. Za pomocą igły 30G wstrzyknąć 50uL FITC-dekstranu (50ug/mL) lub GSL 1 - izolektyny B4 (20ug w 200uL PBS) do żyły twarzowej, kierując igłę w stronę tyłu głowy.
  6. Gdy barwnik stanie się widoczny w żyle pępowinowej, usunąć igłę i oddzielić zarodek od szypułu allantois (tętnicy i żyły pępowinowej).
  7. Po wstrzyknięciach pozostawić zarodek w PBS w temperaturze pokojowej na 2-3 minuty, aby barwnik mógł rozprzestrzenić się w całym organizmie zarodka.

2. Analiza całoprzestrzenna unaczynienia skóry

  1. Po dopuszczeniu do krążenia barwnika w całym embrionie, należy pobrać próbki skóry z obszarów kończyn, grzbietu, brzucha itp. 8,9.
  2. Próbkę skóry należy przemyć zimnym PBS, a następnie utrwalić w 4% PFA/PBS przez 2 godziny 8,9. Próbkę przemywa się 3 razy przez 10 minut każdorazowo w 4mL przezroczystej probówce z 2mL zimnego PBS.
  3. Próbkę skóry należy umieścić na szkiełku przedmiotowym, dodać 100 μl medium montażowego do każdego szkiełka i nakryć szkiełkiem nakrywkowym.
  4. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia w ciemnym miejscu przechowywania.
  5. Przejść do Kroku 2 w sekcji „Pozyskiwanie obrazów”.

3. Wielokolorowe znakowanie naczyń krwionośnych oraz komórek okołonaczyniowych grasicy i serca do skrawków mrożonych (Kontynuacja z Sekcji 1, Krok 7)

  1. Cały embrion poddać szybkiemu zamrożeniu („flash freeze”) w ciekłym azocie. Embriony można przechowywać w temperaturze -80°C do czasu analizy.
  2. Alternatywnie, wypreparować grasicę, przepłukać w PBS w temperaturze 4°C i utrwalić w 2 mL 4% Paraformaldehydu (PFA)/PBS przez 2 godziny. Przemyć 3 razy przez 10 minut w zimnym PBS, umieścić grasice w OCT, zamrozić i przechowywać do czasu użycia w -80°C.
  3. Do kriosekcjonowania nanieść OCT na blok do sekcji i zamocować embrion lub wypreparowane organy/tkanki do cięcia.
  4. Zamrożoną tkankę pociąć na sekcje o grubości 10 μm i zebrać na szkiełkach.
  5. Sekcje utrwalić w acetonie przez 5-10 minut. Przemyć 3 razy w zimnym TBS.
  6. Zablokować w 10% surowicy osła/TBS w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej.
  7. Inkubować sekcje przez 1 godzinę do całej nocy z 100 μl przeciwciał pierwszorzędowych w komorze wilgotnościowej w 4°C: w tym przykładzie zastosowano szczurze przeciwciała anty-mysie CD31 (1:100) do znakowania śródbłonka oraz kozie przeciwciała anty-mysie PDGFR-β (1:100) do znakowania komórek okołonaczyniowych. Wskazane jest przykrycie szkiełek indywidualnie dociętymi paskami Parafilmu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie przeciwciał na całej sekcji.
  8. Po inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi przemyć sekcje 3 razy w zimnym TBS. Inkubować z 100 μl odpowiednich przeciwciał drugorzędowych przez minimum 30 minut.
  9. Przemyć 3 razy w zimnym TBS. Dodać 100 μl medium montażowego na każde szkiełko i nałożyć szkiełko nakrywkę.
  10. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia w ciemnym miejscu przechowywania.
  11. Przejść do sekcji „Pozyskiwanie obrazów”.

4. Wielobarwne znakowanie naczyń krwionośnych grasicy i komórek okołonaczyniowych dla przekrojów wykonanych w wibratomie (Kontynuacja z Sekcji 1, Krok 7)

  1. Wypreparować płaty grasicy z zarodka i przepłukać w zimnym PBS.
  2. Utrwalić grasicę w 4% PFA/PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  3. Przemyć 3 razy przez 10 minut w PBS-Triton X (0.15%), umieścić grasice w małym plastikowym wkładzie i zanurzyć w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia/PBS (˜4°C). Grasica powinna stykać się z dnem wkładu.
  4. Pozostawić agarozę do stężenia na lodzie (3-5 minut). Za pomocą żyletki odciąć nadmiar agarozy. Nałożyć klej na blok wibratomu i przytwierdzić próbkę do bloku.
  5. Dolać zimny PBS do kąpieli wodnej wibratomu, aż próbka i ostrze zostaną zanurzone.
  6. Ustawić prędkość i amplitudę (wysoka amplituda i niska-umiarkowana prędkość są idealne dla miękkich przekrojów grasicy). Amplitudę należy zmniejszyć, jeśli skrawki ulegają rozpadowi z powodu zbyt silnych wibracji.
  7. Wyciąć skrawki o grubości 50 um.
  8. Za pomocą pędzelka zebrać skrawki do mikropłytki 24-dołkowej z zimnym PBS.
  9. Zablokować skrawki w 500 μl 10% surowicy osła w PBS-Triton X (0.15%) przez 30 minut.
  10. Inkubować skrawki przez 8 godzin lub przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym, takim jak anty-CD31 i anty-PDGFR-β, w zakrytej mikropłytce 24-dołkowej.
  11. Przemyć 3 razy w PBS-Triton X (0.15%) w ciągu łącznie 8 godzin w 4°C.
  12. Zablokować skrawki w 10% surowicy osła w PBS-Triton X (0.15%) przez 30 minut.
  13. Inkubować skrawki przez 8 godzin lub przez noc w 4°C z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi.
  14. Przemyć 3 razy w PBS-Triton X (0.15%) w ciągu łącznie 8 godzin w 4°C.
  15. Ponownie utrwalić próbki w 4% PFA/PBS przez 30 minut na lodzie.
  16. Przemyć 3 razy w PBS-Triton X (0.15%) przez 30 minut na lodzie.
  17. Odwodnić próbki w serii roztworów MeOH/PBS-Triton X o rosnącym stężeniu: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH oraz 100% MeOH przez 10 minut na każdym etapie. Po 10 minutach zastąpić 100% MeOH świeżym MeOH i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  18. W szklanym naczyniu zmieszać BABB (alkohol benzylowy:benzoesan benzylu) w stosunku 1:2. Połączyć BABB z MeOH do uzyskania końcowego stężenia 50% BABB i 50% MeOH. Inkubować próbkę w BABB:MeOH przez 10-15 minut.
  19. Przenieść próbkę do szklanego naczynia z 100% BABB i inkubować przez 10-15 minut lub do momentu przejaśnienia w temperaturze pokojowej.
  20. Wypełnić szkiełko z wgłębieniem (głębokość 0.7mm) świeżym 100% BABB i przenieść próbkę na bok. Nałożyć szkiełko nakrywkowe (Nr 1.5) i uszczelnić 2-3 warstwami lakieru do paznokci. Pozostawić lakier do utwardzenia w ciemności w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać próbkę w 4°C.
    Uwaga: Szkiełka muszą być całkowicie uszczelnione przed obrazowaniem konfokalnym. Obrazowanie powinno zostać przeprowadzone w ciągu 12-24 godzin, ponieważ barwniki fluorescencyjne mogą blaknąć w BABB.
  21. Przejść do sekcji „Pozyskiwanie obrazów”.

5. Akwizycja obrazów

  1. Wykonaj obrazy mrożonych skrawków o grubości 10 μm za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając obiektywu Plan-Apochromat 20X/0.8 (512 X 512 Pixels) z liniami laserowymi 488- (FITC-dekstran/GSL 1 - izolektyna B4), 543- oraz 633-nm.
  2. Uzyskaj konfokalne przekroje Z całej skóry (whole mount) oraz skrawków o grubości 50 μm zatopionych w agarozie, używając obiektywu Plan-Apochromat 10X/0.4 (512 X 512 Pixels) z liniami laserowymi 488- (FITC-dekstran/GSL 1 - izolektyna B4), 543- oraz 633-nm. Seryjne przekroje Z należy zbierać sekwencyjnie co 1 mikron dla każdego z kanałów.
  3. Zrekonstruuj seryjne przekroje Z przy użyciu oprogramowania Zeiss Axiovision 4.6 lub innego oprogramowania do analizy obrazu.

6. Reprezentatywne wyniki:

Efektywne znakowanie naczyń krwionośnych zarodka jest kluczowe dla oceny wad naczyń krwionośnych u myszy w okresie embrionalnym. Rysunek 1 przedstawia specyficzne znakowanie naczyń krwionośnych grasicy na etapie E16,5 (1A-B) oraz współznakowanie z CD31 (1B), a także barwienie odpowiednio prawej i lewej komory serca (1E-F). W doświadczeniach tych zastosowano protokół GSL I-isolectin B4 dla skrawków mrożonych, opisany w sekcjach 1, 3 i 5. Znakowanie całego preparatu sieci naczyń krwionośnych skóry myszy na etapie E16,5, z zastosowaniem protokołów opisanych w sekcjach 1, 2 i 5, przedstawiono na Rysunku 1C-D.

Mikroskopia fluorescencyjna markerów naczyniowych; izolektyna B4 GSL1, dekstran FITC CD31; struktura komórkowa.
Legenda do ryciny 1. Iniekcje FITC GSL I - izolektyny B4 do żyły twarzowej embrionów myszy w stadium E16.5. a. Przekrój kriostatyczny zarodkowego tymusu po iniekcji. b. Nałożenie obrazów (merge) współoznakowania CD31 z izolektyną B4. c. i d. Preparat całego organu (whole-mount) naczyń skórnych zarodka po iniekcji. e. i f. Przekrój kriostatyczny zarodkowego serca e. (prawą komorę) f. (lewą komorę) po iniekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Barwienie całych preparatów (whole-mount) oraz barwienie PECAM-1 (CD31) na przekrojach to konwencjonalne metody znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy. Metody te wymagają zastosowania bezpośredniej i/lub pośredniej immunofluorescencji oraz detergentów do permeabilizacji tkanki mysiej, co okazuje się procesem dość czasochłonne. W niniejszym protokole zastosowaliśmy wstrzyknięcia do żyły twarzowej FITC-dekstranu lub izolektyny B4 w celu bezpośredniego znakowania naczyń krwionośnych embrionu, co eliminu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca była wspierana przez granty nr R01AI055001 oraz R01AI082127 z NIAID przyznane NRM oraz stypendium doktoranckie SREB Dissertation Fellowship Award przyznane JLB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
dekstran FITCSigma-AldrichFD150S-1G
Izolektyna B GSL 1 znakowana fluoresceiną4Vector LaboratoriesFL-1201
Fast GreenMP Biomedicals195178
PFAFluka76240
Surowica z płodu bydlęcegoAtlanta BiologicalsS11550
Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T.VWR international25608-930
AcetonJT Baker9006-33
Surowica osia osiołkaJackson017-000-121
przeciwciało szczurze przeciwko mysiemu CD31,BD Biosciences558736
przeciwciało kozie przeciwko mysiemu PDGFR-βR&R&D SystemsAF1042
przeciwciało osioła przeciwko szczuremu CD31 Alexa 647 (Invitrogen) Biolegend102516
przeciwciało osiołkowe przeciwko kozim Alexa 594 (Invitrogen)InvitrogenA11058
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Agaroza niskotopliwa/PBSSigma-AldrichA9414-25G
MetanolFisher ScientificA413-4
Alkohol benzylowyAcros Organics148390010
Benzozan benzyluAcros Organics105860010
Slajdy dotyczące depresjiFisher ScientificS175201
Fluorogel Nauki o Mikroskopii Elektronowej17985-10
szkiełko cover glass (22X22)-1.5Thermo Fisher Scientific, Inc.152222
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 MetaCarl Zeiss, Inc.
Pinceta do mikrodyssekcji Roboz Surgical Instruments Co.RS-5135
Parafilm No. OM992Fisher Scientific13-374-16
mikropłytki 12- i 24-dołkoweEvergreen Scientific222-8044-01F
Przedmioty szkiełka Superfrost/PlusFisher Scientific12-550-15
przezroczyste fiolki 4 mlKrajowa Firma NaukowaB7800-2

Bibliografia

  1. Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
  2. Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
  3. Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
  4. Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
  5. Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
  6. Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
  7. Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
  8. Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
  9. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  10. Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Układ naczyniowy zarodka myszyiniekcja do żyły twarzowejznakowanie FITC-dekstranąizolektyna B4 GSL-1barwienie przeciwciałem CD31peryvaskularny PDGFR-betaprotokół kriosekcjonowaniasekcjonowanie w wibratomieobrazowanie w mikroskopii konfokalnejanaliza naczyniowa grasicy
Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.