Metoda znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metodę znakowania naczyń krwionośnych w skórze zarodkowej i grasicy.

Streszczenie

Utworzenie funkcjonalnej sieci naczyń krwionośnych jest kluczowym elementem organogenezy i jest niezbędne do optymalnego funkcjonowania narządu. Na przykład w grasicy prawidłowy proces tworzenia i rozmieszczenia naczyń krwionośnych jest niezbędny dla wniknięcia tymocytów do narządu oraz wyjścia dojrzałych limfocytów T do obwodu. Przestrzenny układ naczyń krwionośnych w grasicy zależy od sygnałów pochodzących z lokalnego mikrośrodowiska, a mianowicie z komórek nabłonkowych grasicy (TEC). Kilka niedawnych doniesień sugeruje, że zaburzenia tych sygnałów prowadzą do wad naczyń krwionośnych grasicy ^1,2. Wcześniejsze badania opisały techniki stosowane do znakowania naczyń krwionośnych grasicy u noworodków i osobników dorosłych ^1,2. Przedstawiamy tutaj technikę znakowania naczyń krwionośnych w embrionalnej grasicy. Metoda ta łączy zastosowanie iniekcji do żyły twarzowej z użyciem dekstranu-FITC lub lektyny z Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia I (GSL 1 – izolektyna B₄) oraz barwienia przeciwciałem anty-CD31 w celu identyfikacji struktur naczyniowych grasicy i przeciwciałem anty-PDGFR-β do znakowania okołonaczyniowej mezenchymy grasicy ^3-5. Przedstawiono również możliwość zastosowania krioprzekrojów lub przekrojów wykonanych za pomocą wibrotomu. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji wad naczyniowych grasicy, co jest kluczowe dla zdefiniowania roli cząsteczek pochodzących z TEC w tworzeniu naczyń krwionośnych grasicy. Ponieważ metoda ta znakuje cały układ naczyniowy, może być ona również stosowana do analizy sieci naczyniowych w wielu narządach i tkankach embrionu, w tym w skórze i sercu ^6-10.

Protokół

1. Iniekcje do żyły twarzowej z zastosowaniem dekstranu znakowanego fluoresceiną oraz lektyny GSL I-isolectin B₄ w celu znakowania naczyń krwionośnych zarodka

1. Przygotować FITC-dekstran (50ug/mL) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) lub GSL 1 - izolektynę B₄ (20ug/200uL) w PBS w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5mL i ogrzać do 37°C. Dodać 100uL roztwoku zapasu 1,25mM Fast Green/PBS do roztworu FITC-dekstranu (objętość całkowita 1mL) oraz 180uL roztwoku zapasu 1,25mM Fast Green/PBS do GSL 1 - izolektyny B₄ (objętość całkowita 200uL), tak aby roztwór stał się widocznie niebieski.
2. Wypreparować zarodki w stadium E14.5-E18.5 wraz z woreczkiem żółtkowym, pozostawiając nienaruszony szypuł allantois (tętnicę i żyłę pępowinową).
3. Przenieść zarodki do nowej szalki Petriego (60 X 15 mm) i zanurzyć je w PBS w temperaturze pokojowej.
4. Ułożyć zarodek tak, aby uzyskać widok strzałkowy głowy/twarzy. Użyć mikro-pincety do delikatnego uchwycenia zarodka za głowę.
5. Za pomocą igły 30G wstrzyknąć 50uL FITC-dekstranu (50ug/mL) lub GSL 1 - izolektyny B₄ (20ug w 200uL PBS) do żyły twarzowej, kierując igłę w stronę tyłu głowy.
6. Gdy barwnik stanie się widoczny w żyle pępowinowej, usunąć igłę i oddzielić zarodek od szypułu allantois (tętnicy i żyły pępowinowej).
7. Po wstrzyknięciach pozostawić zarodek w PBS w temperaturze pokojowej na 2-3 minuty, aby barwnik mógł rozprzestrzenić się w całym organizmie zarodka.

2. Analiza całoprzestrzenna unaczynienia skóry

1. Po dopuszczeniu do krążenia barwnika w całym embrionie, należy pobrać próbki skóry z obszarów kończyn, grzbietu, brzucha itp. ^8,9.
2. Próbkę skóry należy przemyć zimnym PBS, a następnie utrwalić w 4% PFA/PBS przez 2 godziny ^8,9. Próbkę przemywa się 3 razy przez 10 minut każdorazowo w 4mL przezroczystej probówce z 2mL zimnego PBS.
3. Próbkę skóry należy umieścić na szkiełku przedmiotowym, dodać 100 μl medium montażowego do każdego szkiełka i nakryć szkiełkiem nakrywkowym.
4. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia w ciemnym miejscu przechowywania.
5. Przejść do Kroku 2 w sekcji „Pozyskiwanie obrazów”.

3. Wielokolorowe znakowanie naczyń krwionośnych oraz komórek okołonaczyniowych grasicy i serca do skrawków mrożonych (Kontynuacja z Sekcji 1, Krok 7)

1. Cały embrion poddać szybkiemu zamrożeniu („flash freeze”) w ciekłym azocie. Embriony można przechowywać w temperaturze -80°C do czasu analizy.
2. Alternatywnie, wypreparować grasicę, przepłukać w PBS w temperaturze 4°C i utrwalić w 2 mL 4% Paraformaldehydu (PFA)/PBS przez 2 godziny. Przemyć 3 razy przez 10 minut w zimnym PBS, umieścić grasice w OCT, zamrozić i przechowywać do czasu użycia w -80°C.
3. Do kriosekcjonowania nanieść OCT na blok do sekcji i zamocować embrion lub wypreparowane organy/tkanki do cięcia.
4. Zamrożoną tkankę pociąć na sekcje o grubości 10 μm i zebrać na szkiełkach.
5. Sekcje utrwalić w acetonie przez 5-10 minut. Przemyć 3 razy w zimnym TBS.
6. Zablokować w 10% surowicy osła/TBS w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej.
7. Inkubować sekcje przez 1 godzinę do całej nocy z 100 μl przeciwciał pierwszorzędowych w komorze wilgotnościowej w 4°C: w tym przykładzie zastosowano szczurze przeciwciała anty-mysie CD31 (1:100) do znakowania śródbłonka oraz kozie przeciwciała anty-mysie PDGFR-β (1:100) do znakowania komórek okołonaczyniowych. Wskazane jest przykrycie szkiełek indywidualnie dociętymi paskami Parafilmu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie przeciwciał na całej sekcji.
8. Po inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi przemyć sekcje 3 razy w zimnym TBS. Inkubować z 100 μl odpowiednich przeciwciał drugorzędowych przez minimum 30 minut.
9. Przemyć 3 razy w zimnym TBS. Dodać 100 μl medium montażowego na każde szkiełko i nałożyć szkiełko nakrywkę.
10. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia w ciemnym miejscu przechowywania.
11. Przejść do sekcji „Pozyskiwanie obrazów”.

4. Wielobarwne znakowanie naczyń krwionośnych grasicy i komórek okołonaczyniowych dla przekrojów wykonanych w wibratomie (Kontynuacja z Sekcji 1, Krok 7)

1. Wypreparować płaty grasicy z zarodka i przepłukać w zimnym PBS.
2. Utrwalić grasicę w 4% PFA/PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
3. Przemyć 3 razy przez 10 minut w PBS-Triton X (0.15%), umieścić grasice w małym plastikowym wkładzie i zanurzyć w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia/PBS (˜4°C). Grasica powinna stykać się z dnem wkładu.
4. Pozostawić agarozę do stężenia na lodzie (3-5 minut). Za pomocą żyletki odciąć nadmiar agarozy. Nałożyć klej na blok wibratomu i przytwierdzić próbkę do bloku.
5. Dolać zimny PBS do kąpieli wodnej wibratomu, aż próbka i ostrze zostaną zanurzone.
6. Ustawić prędkość i amplitudę (wysoka amplituda i niska-umiarkowana prędkość są idealne dla miękkich przekrojów grasicy). Amplitudę należy zmniejszyć, jeśli skrawki ulegają rozpadowi z powodu zbyt silnych wibracji.
7. Wyciąć skrawki o grubości 50 um.
8. Za pomocą pędzelka zebrać skrawki do mikropłytki 24-dołkowej z zimnym PBS.
9. Zablokować skrawki w 500 μl 10% surowicy osła w PBS-Triton X (0.15%) przez 30 minut.
10. Inkubować skrawki przez 8 godzin lub przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym, takim jak anty-CD31 i anty-PDGFR-β, w zakrytej mikropłytce 24-dołkowej.
11. Przemyć 3 razy w PBS-Triton X (0.15%) w ciągu łącznie 8 godzin w 4°C.
12. Zablokować skrawki w 10% surowicy osła w PBS-Triton X (0.15%) przez 30 minut.
13. Inkubować skrawki przez 8 godzin lub przez noc w 4°C z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi.
14. Przemyć 3 razy w PBS-Triton X (0.15%) w ciągu łącznie 8 godzin w 4°C.
15. Ponownie utrwalić próbki w 4% PFA/PBS przez 30 minut na lodzie.
16. Przemyć 3 razy w PBS-Triton X (0.15%) przez 30 minut na lodzie.
17. Odwodnić próbki w serii roztworów MeOH/PBS-Triton X o rosnącym stężeniu: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH oraz 100% MeOH przez 10 minut na każdym etapie. Po 10 minutach zastąpić 100% MeOH świeżym MeOH i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
18. W szklanym naczyniu zmieszać BABB (alkohol benzylowy:benzoesan benzylu) w stosunku 1:2. Połączyć BABB z MeOH do uzyskania końcowego stężenia 50% BABB i 50% MeOH. Inkubować próbkę w BABB:MeOH przez 10-15 minut.
19. Przenieść próbkę do szklanego naczynia z 100% BABB i inkubować przez 10-15 minut lub do momentu przejaśnienia w temperaturze pokojowej.
20. Wypełnić szkiełko z wgłębieniem (głębokość 0.7mm) świeżym 100% BABB i przenieść próbkę na bok. Nałożyć szkiełko nakrywkowe (Nr 1.5) i uszczelnić 2-3 warstwami lakieru do paznokci. Pozostawić lakier do utwardzenia w ciemności w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać próbkę w 4°C.
    Uwaga: Szkiełka muszą być całkowicie uszczelnione przed obrazowaniem konfokalnym. Obrazowanie powinno zostać przeprowadzone w ciągu 12-24 godzin, ponieważ barwniki fluorescencyjne mogą blaknąć w BABB.
21. Przejść do sekcji „Pozyskiwanie obrazów”.

5. Akwizycja obrazów

1. Wykonaj obrazy mrożonych skrawków o grubości 10 μm za pomocą mikroskopu konfokalnego, używając obiektywu Plan-Apochromat 20X/0.8 (512 X 512 Pixels) z liniami laserowymi 488- (FITC-dekstran/GSL 1 - izolektyna B₄), 543- oraz 633-nm.
2. Uzyskaj konfokalne przekroje Z całej skóry (whole mount) oraz skrawków o grubości 50 μm zatopionych w agarozie, używając obiektywu Plan-Apochromat 10X/0.4 (512 X 512 Pixels) z liniami laserowymi 488- (FITC-dekstran/GSL 1 - izolektyna B₄), 543- oraz 633-nm. Seryjne przekroje Z należy zbierać sekwencyjnie co 1 mikron dla każdego z kanałów.
3. Zrekonstruuj seryjne przekroje Z przy użyciu oprogramowania Zeiss Axiovision 4.6 lub innego oprogramowania do analizy obrazu.

6. Reprezentatywne wyniki:

Efektywne znakowanie naczyń krwionośnych zarodka jest kluczowe dla oceny wad naczyń krwionośnych u myszy w okresie embrionalnym. Rysunek 1 przedstawia specyficzne znakowanie naczyń krwionośnych grasicy na etapie E16,5 (1A-B) oraz współznakowanie z CD31 (1B), a także barwienie odpowiednio prawej i lewej komory serca (1E-F). W doświadczeniach tych zastosowano protokół GSL I-isolectin B₄ dla skrawków mrożonych, opisany w sekcjach 1, 3 i 5. Znakowanie całego preparatu sieci naczyń krwionośnych skóry myszy na etapie E16,5, z zastosowaniem protokołów opisanych w sekcjach 1, 2 i 5, przedstawiono na Rysunku 1C-D.

Legenda do ryciny 1. Iniekcje FITC GSL I - izolektyny B₄ do żyły twarzowej embrionów myszy w stadium E16.5. a. Przekrój kriostatyczny zarodkowego tymusu po iniekcji. b. Nałożenie obrazów (merge) współoznakowania CD31 z izolektyną B₄. c. i d. Preparat całego organu (whole-mount) naczyń skórnych zarodka po iniekcji. e. i f. Przekrój kriostatyczny zarodkowego serca e. (prawą komorę) f. (lewą komorę) po iniekcji.

Dyskusja

Barwienie całych preparatów (whole-mount) oraz barwienie PECAM-1 (CD31) na przekrojach to konwencjonalne metody znakowania naczyń krwionośnych u embrionów myszy. Metody te wymagają zastosowania bezpośredniej i/lub pośredniej immunofluorescencji oraz detergentów do permeabilizacji tkanki mysiej, co okazuje się procesem dość czasochłonne. W niniejszym protokole zastosowaliśmy wstrzyknięcia do żyły twarzowej FITC-dekstranu lub izolektyny B₄ w celu bezpośredniego znakowania naczyń krwionośnych embrionu, co eliminu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
dekstran FITC	Sigma-Aldrich	FD150S-1G
Izolektyna B GSL 1 znakowana fluoresceiną4	Vector Laboratories	FL-1201
Fast Green	MP Biomedicals	195178
PFA	Fluka	76240
Surowica z płodu bydlęcego	Atlanta Biologicals	S11550
Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T.	VWR international	25608-930
Aceton	JT Baker	9006-33
Surowica osia osiołka	Jackson	017-000-121
przeciwciało szczurze przeciwko mysiemu CD31,	BD Biosciences	558736
przeciwciało kozie przeciwko mysiemu PDGFR-β	R&R&D Systems	AF1042
przeciwciało osioła przeciwko szczuremu CD31 Alexa 647 (Invitrogen)	Biolegend	102516
przeciwciało osiołkowe przeciwko kozim Alexa 594 (Invitrogen)	Invitrogen	A11058
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Agaroza niskotopliwa/PBS	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Metanol	Fisher Scientific	A413-4
Alkohol benzylowy	Acros Organics	148390010
Benzozan benzylu	Acros Organics	105860010
Slajdy dotyczące depresji	Fisher Scientific	S175201
Fluorogel	Nauki o Mikroskopii Elektronowej	17985-10
szkiełko cover glass (22X22)-1.5	Thermo Fisher Scientific, Inc.	152222
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 Meta	Carl Zeiss, Inc.
Pinceta do mikrodyssekcji	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135
Parafilm No. OM992	Fisher Scientific	13-374-16
mikropłytki 12- i 24-dołkowe	Evergreen Scientific	222-8044-01F
Przedmioty szkiełka Superfrost/Plus	Fisher Scientific	12-550-15
przezroczyste fiolki 4 ml	Krajowa Firma Naukowa	B7800-2