Opisane zostaną zewnątrzkomórkowe rejestracje aktywności neuronalnej z wykorzystaniem sond krzemowych u znieczulonego szczura. Technika ta pozwala na pozyskiwanie informacji z wielu obszarów mózgu od ponad 100 neuronów jednocześnie. Dostarcza ona informacji z rozdzielczością pojedynczych komórek na temat dynamiki zespołów neuronalnych w wielu obwodach lokalnych.
Artykuł metodologiczny
Rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Elektrofizjologiczne rejestracje na dużą skalę z zespołów neuronalnych stwarzają możliwość zbadania, w jaki sposób mózg organizuje szeroką gamę zachowań na podstawie aktywności impulsowej swoich neuronów. Jedną z najskuteczniejszych metod monitorowania aktywności impulsowej dużej liczby neuronów w wielu lokalnych obwodach neuronalnych jednocześnie jest zastosowanie krzemowych mat elektrod1-3.
Potencjały czynnościowe powodują znaczne zmiany napięcia przezbłonowego w okolicy ciał komórek. Sygnały wyjściowe te można mierzyć, umieszczając przewodnik w bliskim sąsiedztwie neuronu. Jeśli w pobliżu końcówki znajduje się wiele aktywnych (generujących impulsy) neuronów, elektroda rejestruje połączony sygnał od wszystkich z nich, przy czym wkład pojedynczego neuronu jest ważony przez jego „odległość elektryczną”. Sondy krzemowe są idealnymi elektrodami rejestrującymi do monitorowania wielu neuronów ze względu na dużą liczbę miejsc rejestracji (+64) oraz małą objętość. Co więcej, wiele miejsc może być rozmieszczonych na odcinku kilku milimetrów, co pozwala na jednoczesną rejestrację aktywności neuronalnej w różnych warstwach kory lub w wielu kolumnach korowych (Rys. 1). Co istotne, geometrycznie precyzyjny rozkład miejsc rejestracji pozwala również na określenie relacji przestrzennych odizolowanych pojedynczych neuronów4. W niniejszej pracy opisujemy metodę ostrej, wielkoskalowej rejestracji neuronalnej z lewej i prawej kory somatosensorycznej przedniej kończyny jednocześnie u znieczulonego szczura z wykorzystaniem sond krzemowych (Rys. 2).
Protokół
1. Przygotowanie do zabiegu
- Zanurzyć szczura w narkozie, stosując odpowiedni rodzaj i dawkę środków znieczulających. W tym przypadku stosujemy uretan (1,5 g/kg, Sigma-Aldrich Co., St. Luis, MO) – przygotowany jako roztwór 20% poprzez rozpuszczenie 20 g uretanu w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), co oznacza, że zwierzę otrzyma dojamieniowo (IP) 7,5 ml/kg roztworu uretanu. Ze względu na krzywą dawka-odpowiedź, całkowitą dawkę uretanu podzielono na cztery aplikacje, z których każda jest oddzielona przerwą wynoszącą około 30 minut. Przed dwiema pierwszymi aplikacjami uretanu zwierzę jest znieczulane izofluranem podawanym w stężeniu 3-4% (tlen z przepływem 2 litry na minutę) i utrzymywanym na poziomie 2% (tlen do 2 litry na minutę), aby zapobiec stresowi zwierzęcia podczas wstrzykiwania. W trakcie operacji, w razie potrzeby, można zastosować dodatkową dawkę izofluranu (stężenie 2% przez 2 minuty).
- Ogolić futro wzdłuż miejsca nacięcia (grzbietowa strona głowy), aby upewnić się, że sierść nie zanieczyści rany i że wokół miejsca nacięcia można zdezynfekować wystarczająco duży obszar.
- Przygotować pole operacyjne antyseptycznie, używając organicznego jodu lub mydła z chlorheksydyną oraz środków antyseptycznych (etanolu).
- Przygotować sondy krzemowe (NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI). Sondy można dezynfekować za pomocą 70% etanolu, a następnie płukać wodą destylowaną. W razie potrzeby sondy można oznaczyć markerem fluorescencyjnym przygotowanym antyseptycznie (np. Dye I, Invitrogen Co.), aby później ujawnić pozycję sondy w analizie histologicznej. W tym celu używamy małego i bardzo miękkiego pędzla, delikatnie dotykając tyłu sondy krzemowej barwnikiem. Procedura ta powinna być zawsze wykonywana pod mikroskopem, aby upewnić się, że sonda nie zostanie uszkodzona ani wygięta. Zawsze należy sprawdzać, czy barwnik nie blokuje żadnego z kanałów. Wszelkie pozostałości barwnika na sondzie można później usunąć alkoholem, a następnie wypłukać wodą.
- Pielęgnacja elektrod krzemowych: Ze względu na niewielki rozmiar sondy krzemowe są delikatne i niezwykle podatne na złamania, nawet przy zachowaniu znacznej ostrożności. Dlatego zalecamy stałe monitorowanie potencjalnych zagrożeń, takich jak: (i) przechowywanie sond w odpowiednio wyznaczonym pudełku; (ii) zapobieganie uderzeniom lub upuszczeniu sond podczas ich przenoszenia; (iii) upewnienie się, że manipulatory stereotaktyczne są dobrze zamocowane, aby zapobiec wypadkom; (iv) podczas rejestracji do sond mogą przywierać otaczające tkanki i/lub krew. Dlatego ważne jest zachowanie ostrożności podczas wyjmowania sond po zakończeniu rejestracji. Zdecydowanie zaleca się stosowanie stałego przepływu PBS lub roztworu soli fizjologicznej; (v) zawsze należy czyścić sondy po rejestracji. Do czyszczenia sond zdecydowanie zaleca się zanurzenie ich na kilka minut w płynnym enzymatycznym środku czyszczącym (Boston, Bausch & Lomb). Zawsze należy płukać sondy wodą destylowaną i odkładać je do dedykowanego pudełka. W naszym doświadczeniu odpowiednia pielęgnacja sond krzemowych zapewnia dobrą jakość rejestracji przez ponad 10 eksperymentów. Jeśli kanał „stanie się szumny” podczas użytkowania, należy go wykluczyć z późniejszych analiz. Stwierdziliśmy, że przesłuchy między kanałami są minimalne; zatem szumiący kanał zazwyczaj ma niewielki wpływ na sygnał w innych kanałach.
2. Operacja
- Przed jakimikolwiek manipulacjami chirurgicznymi na powierzchnię oka należy nanieść maść do oczu.
- Podaj Deksametazon 5 mg/ml podskórnie w celu zmniejszenia stanu zapalnego mózgu.
- Zwierzę należy unieruchomić w aparacie stereotaktycznym przez cały czas trwania operacji.
- Przed wykonaniem nacięcia w miejscu nacięcia podaj podskórnie Lidokainę HCl 2% z Epinefryną (2-4 mg/kg rozcieńczone do roztworu 0,5%), aby zredukować potencjalne ryzyko krwawienia rany oraz w celu znieczulenia miejscowego.
- Wykonaj nacięcie o długości 2 cm wzdłuż linii środkowej skóry głowy i przesuń skórę bocznie, aby odsłonić powierzchnię czaszki.
- Oczyść grzbietową część skóry głowy z powięzi za pomocątępej dyssekcji i opanuj krwawienie za pomocą mikrokauteryzacji lub wosku kostnego.
- Wywierć dwa otwory na małe śruby w kości potylicznej czaszki w celu uziemienia zwierzęcia i ustanowienia punktu odniesienia. Śruba referencyjna musi stykać się z oponą twardą. Aby zredukować szumy elektryczne podczas rejestracji, zaleca się, aby śruby były przez cały czas wilgotne. W tym celu można zbudować niewielką barierę akrylową wokół śrub lub pokryć śruby agarem.
- Wykonaj kraniotomię o średnicy 1-2 mm w współrzędnych odpowiadających obszarom korowym i/lub podkorowym zainteresowania 5. W razie potrzeby podczas kraniotomii (wiercenia otworu) używaj sprężonego powietrza do usuwania pyłu kostnego. Zapobiegaj nagrzewaniu się czaszki podczas wiercenia, aplikując krople PBS. Jeśli jest to konieczne do wprowadzenia drugiej sondy, wykonaj drugą kraniotomię. W tym filmie prezentujemy rejestrację z dwóch obszarów korowych jednocześnie, dlatego wykonano dwie kraniotomie.
- Zbuduj niewielką barierę z żywicy akrylowej (np.: Lang Dental Manufacturing, Co., Inc., Wheeting, IL) wokół obu kraniotomii, aby utrzymać PBS na odsłoniętej oponie twardej i zapobiec jej wysychaniu. Aplikuj PBS w sposób ciągły przez cały czas trwania eksperymentu.
- Otwórz oponę twardą w obu miejscach kraniotomii. Do tej manipulacji można użyć dwóch igieł (rozmiar 30 ½ G) zagiętymi końcówkami (tworzącymi haczyk).
- Przymocuj złącze sond krzemowych do manipulatorów stereotaktycznych. Złącza są mocowane do słupka, aby trzpienie sond były idealnie równoległe do manipulatora stereotaktycznego. Jest to kluczowe dla zachowania stabilności rejestracji i uniknięcia uszkodzenia sond.
- Połącz śrubę referencyjną z pinem referencyjnym sondy krzemowej. Aby zredukować szumy elektryczne, śruby uziemiające muszą być połączone z: i) masą wtyczki sondy; ii) masą obudowy urządzenia rejestrującego; oraz iii) aparatem stereotaktycznym.
- Umieść końcówkę sond krzemowych tak, aby stykała się z oponą miękką.
- Powoli wprowadzaj sondy krzemowe i upewnij się, że trzpienie sond krzemowych (Ryc. 1 i 2) mogą zostać wprowadzone do mózgu bez oporu lub wyginania.
- Ostrożnie obniżaj sondy, aż dotrą do pożądanego obszaru rejestracji. W razie potrzeby dodawaj krople PBS na wierzch kraniotomii, aby uniknąć wysychania tkanki.
- Ponieważ znieczulenie uretanem powinno być stosowane wyłącznie w procedurach terminalnych, zwierzę poddaje się eutanazji poprzez wtryśnięcie do jamy otrzewnowej co najmniej 20 mg/kg pentobarbitalu sodowego rozcieńczonego do stężenia nie wyższego niż 60 mg/ml. Następnie wykonuje się dekapitację zwierzęcia.
3. Reprezentatywne wyniki:
Reprezentatywne zapisy potencjałów polowych oraz aktywności impulsowej przedstawiono na rysunku 3A. Po przeprowadzeniu sortowania impulsów (rozróżnianiu impulsów pochodzących z różnych neuronów; Rys. 3B,C; 6, 7, 8) zapisy z sondy krzemowej umożliwiają badanie aktywności populacji neuronalnych zaangażowanych m.in. w następujące procesy: pamięć i podejmowanie decyzji 9, plastyczność 10, kodowanie bodźców 11, aktywność spontaniczną 12 oraz efekty działania różnych leków 13.
Rysunek 1. A. Przykład sondy krzemowej z jednym ramieniem nałożony na montaż zrekonstruowanych neuronów (dzięki uprzejmości S. Sakaty) 14). B. Przykład sondy z konfiguracją tetrodową na każdym z 8 ramion. C. Schemat czaszki szczura. Zielone pola wyznaczają zakres kraniotomii nad prawą i lewą korą somatosensoryczną.
Rysunek 2. Przykład eksperymentu z sondami krzemowymi wprowadzonymi do przedczołowej kory mózgowej i hipokampa. Krople PBS pokrywają otwór trepanacyjny, aby chronić odsłoniętą tkankę mózgową przed wysychaniem. Dwie śruby umieszczone nad móżdżkiem zostaną podłączone odpowiednio do uziemienia i elektrody referencyjnej.
Rysunek 3. A. Rysunek przedstawia 50 ms reprezentatywnego zapisu elektrofizjologicznego potencjału polowego (LFP) z jednej tetrody (uwaga: ujemne napięcie naniesiono w górę osi rzędnych). Wstawka przedstawia przebieg pojedynczego kolca (spike). B. Dwuwymiarowe rzuty klastrów jednostek w przestrzeni cech z jednej tetrody. Każdy klaster reprezentuje impulsy pochodzące z pojedynczej jednostki (neuronu). C. Średnie przebiegi impulsów z reprezentatywnych jednostek (oznaczonych kolorami) dla każdego z czterech miejsc rejestracji z jednej tetrody. D. Energia kształtu fali (związana z amplitudą) zarejestrowanych impulsów w czasie. Należy zwrócić uwagę na stosunkowo stałe wartości energii dla każdej jednostki; wskazuje to na stabilność rejestracji w trakcie wyświetlanego okresu.
Dyskusja
Niniejszy artykuł demonstruje sposób wykorzystania krzemowych macierzy elektrod do rejestracji aktywności z dużej populacji neuronów (>100) w wielu obszarach kory mózgowej jednocześnie. Aby zapewnić powodzenie zabiegu chirurgicznego oraz rejestracji, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
- Wprowadzanie sond do pożądanego obszaru: Wprowadzanie sond do tkanki mózgowej może spowodować znaczne uszkodzenia, co z kolei może skutkować niską jakością zarejestrowanych jednostek. Aby uniknąć tego problemu, zaleca się następujące działania: (i) wprowadzanie sond pod pewnym kątem (zalecany kąt 10 stopni), co pozwala zredukować uszkodzenia dendrytów rejestrowanych neuronów; (ii) po wprowadzeniu sond do tkanki mózgowej, początkowo obniża się je z większą prędkością (około 50 do 100 mikronów na 10-30 s), aż znajdą się w pobliżu pożądanego obszaru rejestracji. Gdy sondy znajdują się około 200 mikronów od obszaru docelowego, pozycję koryguje się wolniej (około 10 mikronów co 2 lub 3 minuty).
- Stabilizacja rejestracji: Gdy sondy znajdują się w wyznaczonym obszarze i zostanie wykryta znaczna aktywność (wyraźne impulsy w większości kanałów), zaleca się odczekanie około 30 minut przed rozpoczęciem rejestracji. Pozwoli to tkance mózgowej na mechaniczną stabilizację po wprowadzeniu sond i zapewni stabilniejszy zapis.
- Pulsacja mózgu: Okazyjnie może wystąpić pulsacja mózgu, która może znacząco obniżyć jakość rejestracji. Mała kraniotomia (wystarczająca przestrzeń, aby zmieścić sondę) może zredukować pulsację mózgu w obszarze rejestracji. W razie potrzeby można wykonać nakłucie cysterny wielkiej (cisterna magna), co zmniejsza ciśnienie płynu mózgowo-rdzeniowego oraz ogranicza obrzęk i pulsację.
- Konfiguracja sondy krzemowej: Sondy krzemowe mogą mieć różne kształty i konfiguracje miejsc rejestracji. Mogą się one różnić na przykład liczbą trzpieni, ich długością i grubością oraz rozmieszczeniem miejsc rejestracji (np. konfiguracja tetrodowa versus liniowa; patrz: www.neuronexustech.com). Wybór konkretnej konfiguracji sondy zależy od pytania badawczego, na które należy odpowiedzieć. Na przykład, jeśli celem jest rejestracja populacji neuronów w wielu lokalizacjach w jednej konkretnej warstwie (jak przedstawiono w tych rejestracjach), najlepszym wyborem jest użycie sondy z ośmioma trzpieniami w konfiguracji tetrodowej. Pozwala to na rejestrację wielu pojedynczych jednostek w każdej tetrodzie i próbkowanie ośmiu lokalizacji w zakresie 1.4 mm. W innym przypadku, jeśli celem jest badanie propagacji aktywności przez warstwy kory, najlepszym wyborem byłaby sonda z jednym trzpieniem z regularnie rozmieszczonymi miejscami rejestracji wzdłuż tego trzpienia, co umożliwia jednoczesną rejestrację w wielu warstwach kory 14.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez NSERC oraz AHFMR. Autorzy dziękują Mariam Alaverdashvili i Amanda Mauthe-Kaddoura za uwagi do rękopisu, a także Hiroe Yamazaki za pomoc w przygotowaniu do operacji.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Uretan | Sigma-Aldrich | ||
| Bufor fosforanowo-solny (PBS) | |||
| Izofluran | Benson Medical Instruments | 02241315 | |
| Sondy krzemowe | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312 | |
| Barwnik I (DiIC18)18(3)) | Invitrogen | 617830 | |
| Deksametazon 5 | Vétoquinol | 0A0640B | |
| Maść do oczu | Vétokinol | 005165414 | |
| Chlorowodorek lidokainy 2% z epinefryną | Bimeda-MTC | 00141984 | |
| Stereotaksometr | Kopf Instruments | 1430-B | |
| Manipulator i uchwyt elektrody | Kopf Instruments | 960 | |
| Uchwyty do uszu szczurów | Kopf Instruments | 1955 | |
| Adaptor szczurzy | Kopf Instruments | 920 | |
| Maska anestezjologiczna | Kopf Instruments | 906 | |
| Skalpel | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Ostrza skalpela | Paragon | 0086 | |
| Nożyczki do mikrodysekcji | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910 | |
| Śruby | Gould Pasteners Limited | 14084701 | |
| Kleszczyki hemostatyczne | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7130 RS-7211 | |
| 30½ igły o określonej średnicy (gauge) | BD Biosciences | 305115 | |
| Sterowanie mikrosilnikiem | Wstęp | HP4-917 | |
| Pęseta anatomiczna | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5237 | |
| Wosk kostny | Lukens | M263500 | |
| Butla ze sprężonym powietrzem | Falcon BD | 50-10521C | |
| Środek czyszczący enzymatyczny | Bausch and Lomb | BAUSCH497628 | |
| Woda destylowana | |||
| Proszek akrylowy stomatologiczny | Lang Dental | 1220 | |
| Płyn akrylowy stomatologiczny | Lang Dental | 1404 | |
| System Digital Lynx SX | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 | |
| Oprogramowanie Cheeta | Neuralynx Inc. | ||
| Przewody z krokodylkami |
Bibliografia
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat. Neurosci. 7, 446-451 (2004).
- Kipke, D. R. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J. Neurosci. 28, 11830-11838 (2008).
- Csicsvari, J. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J. Neurophysiol. 90, 1314-1323 (2003).
- Bartho, P. Characterization of neocortical principal cells and interneurons by network interactions and extracellular features. J. Neurophysiol. 92, 600-608 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain: in stereotaxic coordinates. , 4th Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, R53-R78 (1998).
- Harris, K. D., Henze, D. A., Csicsvari, J., Hirase, H., Buzsaki, G. Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements. J. Neurophysiol. 84, 401-414 (2000).
- Luczak, A., Narayanan, N. S. Spectral representation--analyzing single-unit activity in extracellularly recorded neuronal data without spike sorting. J. Neurosci. Methods. 144, 53-61 (2005).
- Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321, 1322-1327 (2008).
- Fujisawa, S., Amarasingham, A., Harrison, M. T., Buzsaki, G. Behavior-dependent short-term assembly dynamics in the medial prefrontal cortex. Nat Neurosci. 11, 823-833 (2008).
- Harris, K. D. How do neurons work together? Lessons from auditory cortex. Hear. Res. 271, 37-53 (2011).
- Luczak, A., Bartho, P., Marguet, S. L., Buzsaki, G., Harris, K. D. Sequential structure of neocortical spontaneous activity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 347-352 (2007).
- Robbe, D. Cannabinoids reveal importance of spike timing coordination in hippocampal function. Nat. Neurosci. 9, 1526-1533 (2006).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64, 404-418 (2009).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie