Hodowla i elektrofizjologia komórek na chipach do patch-clampingu NRCC

Podsumowanie

Przedstawiamy sposób sterylizacji, przygotowania, napełniania medium, wysiewania komórek oraz wykorzystywania do rejestracji elektrofizjologicznej płaskich chipów do patch-clampu, wyprodukowanych w Narodowej Radzie Badań Kanady (National Research Council of Canada).

Streszczenie

Ze względu na wyjątkową czułość oraz możliwość monitorowania i kontrolowania pojedynczych komórek na poziomie kanałów jonowych, technika patch-clamp jest złotym standardem elektrofizjologii stosowanym zarówno w modelach chorób, jak i w badaniach farmakologicznych ¹. Tradycyjnie metoda ta polega na delikatnym zetknięciu komórki z szklaną pipetą wypełnioną roztworem fizjologicznym w celu wyizolowania fragmentu błony pod jej wierzchołkiem ². Elektroda wprowadzona do pipety rejestruje aktywność kanałów jonowych w obrębie fragmentu błony lub, po przerwaniu uszczelnienia, dla całej komórki. W ostatniej dekadzie zaproponowano chipy do patch-clamp jako alternatywę ^{3, 4}: zawieszona błona oddziela medium fizjologiczne od medium hodowlanego, a mikrofabrykowany w błonie otwór zastępuje wierzchołek pipety. Chipy do patch-clamp zostały zintegrowane z systemami zautomatyzowanymi i wprowadzone do obrotu w celu prowadzenia wysokoprzepustowych przesiewów ⁵. Aby zwiększyć przepustowość, obejmują one fluidyczne dostarczanie komórek z zawiesiny, ich pozycjonowanie nad otworem za pomocą ssania oraz zautomatyzowane procedury wykrywania uszczelnienia między komórką a sondą i przechodzenia w tryb całej komórki. Opisaliśmy proces produkcji krzemowego chipu do patch-clamp z optymalizowaną impedancją i kształtem otworu, który umożliwia wysokiej jakości rejestrację potencjałów czynnościowych w hodowanych neuronach ślimaka ⁶; niedawno zgłosiliśmy również postępy w badaniu neuronów ssaków ⁷. Nasze chipy do patch-clamp są produkowane w Canadian Photonics Fabrication Centre ⁸, komercyjnej odlewni, i są dostępne w dużych seriach. Jesteśmy zainteresowani współpracą z elektrofizjologami w celu walidacji zastosowania technologii NRCC w różnych modelach. Chipy są wykorzystywane zgodnie z ogólnym schematem przedstawionym na Rysunku 1: krzemowy chip znajduje się na dnie pleksiglasowej fiolki hodowlanej, a tył otworu jest połączony z podziemnym kanałem wyposażonym w rurki na obu końcach obudowy. Komórki są hodowane w fiolce, a komórka znajdująca się nad sondą jest monitorowana przez elektrodę pomiarową wprowadzoną do kanału. Dwa zewnętrzne porty fluidyczne umożliwiają wymianę roztworu przy minimalnym zaburzeniu komórki; jest to zaleta w porównaniu z szklanymi pipetami stosowanymi do perfuzji wewnątrzkomórkowej.

Rysunek 1. Zasada pomiaru z wykorzystaniem chipa do techniki patch-clamp NRCC

Opisujemy tutaj protokoły sterylizacji i przygotowania chipów, ich napełniania pożywką, wysiewania komórek, a na koniec wykorzystania ich do rejestracji elektrofizjologicznych.

Protokół

1. Wytwarzanie chipa

Proces opisany w ⁶ pozwala na otrzymanie samodzielnej błony o grubości 3 μm, niskiej rezystancji dostępowej wynoszącej 1 Mohm oraz gładkiej otwory o kształcie lejka, co ułatwia szczelne połączenie z komórką ⁹, patrz Rysunek 2. Chipy są rozdzielane i przyklejane w obudowach z pleksiglasu, tak aby otwór był skierowany w stronę otworu łączącego chip z kanałem podziemnym. Klejenie jest wykonywane w sposób minimalizujący pojemność boczniczą do wartości nominalnej 17 pF. Obudowy są wyposażone w dwie szklane rurki o średnicy 1,5 mm i długości 6 mm, służące jako porty płynowe (Rysunek 3).

Rysunek 2. Mikrografia z rastrowego mikroskopu elektronowego przekroju chipa do techniki patch-clamp NRCC, wykonanego za pomocą skupionej wiązki jonów, pokazuje gładką powierzchnię dwutlenku krzemu oraz kształt lejka sprzyjający ścisłemu kontaktowi z komórką, a także płytki otwór, który warunkuje niską rezystancję dostępu.

Rysunek 3. Chip zostaje przyklejony do dna fiolki hodowlanej w obudowie z pleksiglasu, wyposażonej w podziemny system mikroprzepływowy i szklane rurki.

2. Sterylizacja, przygotowanie i testowanie

Kolejne kroki należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć kontaminacji lub zapchania otworu.

• Sterylizować chipy w podstawowym czyszczarce plazmowej Harrick (www.harrickplasma.com) przy resztkowym ciśnieniu powietrza 0,1-0,3 mbar przez 15 min przy maksymalnej mocy 18 W. Można stosować inne systemy plazmy powietrznej o porównywalnej gęstości mocy (24 mW/cm³), zachowując stały iloczyn gęstości mocy i czasu. Obróbka plazmą czyni również chipy hydrofilowymi, co ułatwia przygotowanie powierzchni (priming).
• Wyposażyć rurki szklane w sterylne silikonowe rurki laboratoryjne Silastic, 1mm I.D. x 2mm O.D. (Cole Parmer Kat. nr 9615-08), 3 cali po jednej stronie i 1 cal po drugiej stronie.
• Wypełnić układ mikroprzepływowy poprzez rurki sterylnym filtrowanym standardowym roztworem buforu fosforanowego (PBS), upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.
• Zaciisnąć długą rurkę silikonową, zwiększając ciśnienie PBS od strony krótkiej do 1 atm. W fiolce może być widoczna kałuża PBS przesączająca się przez otwór. Zaciisnąć dopływ PBS pod ciśnieniem i odłączyć krótką rurkę silikonową od tego źródła.
• Wypełnić fiolkę filtrowanym PBS za pomocą strzykawki.
• Zanurzyć elektrodę Ag/Ag:Cl w krótkiej rurce oraz przeciwelektrodę w fiolce. Użyć miernika impedancji, aby potwierdzić, że oporność dostępu wynosi od 300kohm do 3Mohm, a pojemność bocznicza od 10pF do 25pF. Chip o niższej oporności prawdopodobnie posiada nieszczelność, natomiast wyższa pojemność jest uznawana za niewłaściwą do użytku, ponieważ może nie zarejestrować najszybszej dynamiki elektrofizjologii komórki ⁶. Chip o niższej pojemności lub wyższej oporności uznaje się za zatkany, choć może to być po prostu efekt uwięzionego w otworze pęcherzyka powietrza. Niektóre chipy są ponownie testowane po 1H i wykazują prawidłową impedancję elektrochemiczną.
• Przepłukać kanał mikroprzepływowy sterylną wodą dejonizowaną; opróżnić górną fiolkę i dwukrotnie przepłukać ją tą samą wodą.
• Zanurzyć zapakowany chip z rurkami w świeżej sterylnej wodzie dejonizowanej na 30min, a następnie umieścić go wraz z innymi chipami w sterylnym pojemniku wypełnionym sterylną wodą dejonizowaną. Zapewnia to zachowanie właściwości hydrofilowych chipów oraz ochronę przed zanieczyszczeniem.

3. Przygotowanie chipów w laboratorium biologii komórki

Następujące kroki są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza z filtrem HEPA z zachowaniem technik aseptycznych; wszystkie roztwory wykorzystywane w tej procedurze muszą zostać poddane sterylizacji przez filtrowanie przy użyciu filtra 0,2μm przed użyciem.

• Otwórz pojemnik z chipami pod laminarnym przepływem powietrza z filtrem HEPA i wyjmij chipy z pojemnika stroną skierowaną w dół, aby uniknąć wpadnięcia ewentualnych pływających zanieczyszczeń do górnej fiolki.
• Przepłucz górną część fiolki chipu 2x świeżo przefiltrowaną sterylną wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości zanieczyszczeń z powierzchni chipu.
• Odsuń sterylną wodę dejonizowaną z górnej fiolki za pomocą aspiratora.
• Podłącz jeden koniec rurki silastykowej przymocowanej do kanału płynowego do strzykawki ciśnieniowej zawierającej sterylną przefiltrowaną wodę dejonizowaną. W naszym systemie strzykawki wypełnione roztworem są poddawane ciśnieniu poprzez podłączenie do zbiornika ze sprężonym powietrzem ustawionego na 20psi. Aby zapewnić sterylność, powietrze jest filtrowane (filtr 0.2 μm) przed wprowadzeniem do strzykawki; nasz system posiada również zawór włącz/wyłącz, który pozwala na zatrzymanie lub przyłożenie ciśnienia w razie potrzeby.
• Za pomocą kleszczyków hemostatycznych zaciśnij wylotowy koniec rurki.
• Otwórz zawory włącz/wyłącz, aby podać ciśnienie do roztworu.
• Aby przepłukać podziemny układ płynowy chipu świeżą sterylną wodą dejonizowaną, zwolnij wylotowy koniec rurki.
• Aby wymusić przepływ wody w górę przez aperturę, zaciśnij wylotowy koniec rurki kleszczykami hemostatycznymi.
• Aby zapobiec odpływowi wody, zaciśnij wlotowy i wylotowy koniec rurki kleszczykami hemostatycznymi i zamknij zawory włącz/wyłącz.
• Odłącz wlotowy koniec rurki od strzykawki.
• Włóż szklane zatyczki do obu końców rurki i usuń kleszczyki hemostatyczne.
• Napełnij górną fiolkę filtrowaną sterylną wodą dejonizowaną.
• Umieść pokrywkę sterylnej szalki 35 mm w podstawie sterylnej szalki 10 mm.
• Umieść chip na pokrywce szalki 35 mm i przykryj go pokrywką szalki 10 mm.
• Wykonaj obrazowanie chipów, aby upewnić się, że membrana i apertura chipów są wolne od zanieczyszczeń i/lub pęcherzyków powietrza. W naszym laboratorium używamy mikroskopu pionowego i obiektywu 20x o długiej odległości roboczej.
• Jeśli obecne są zanieczyszczenia i/lub pęcherzyki powietrza, wielokrotnie przepłucz kanał płynowy i górną fiolkę. Jeśli zanieczyszczeń i/lub pęcherzyków powietrza nie można usunąć, chip zostaje odrzucony.
• Po wykonaniu obrazowania chipów wróć do komory z laminarnym przepływem powietrza i wyjmij zatyczki z obu końców rurki.
• Podłącz jeden koniec rurki do strzykawki ciśnieniowej zawierającej medium fizjologiczne.
• Zaciśnij wylotowy koniec rurki kleszczykami hemostatycznymi.
• Otwórz zawór ciśnienia, usuń kleszczyki hemostatyczne z końca układu płynowego i przepłucz kanał płynowy medium fizjologicznym.
• Aby przepłukać podziemny układ płynowy medium fizjologicznym, otwórz zawory włącz/wyłącz i usuń kleszczyki hemostatyczne z wylotowego końca rurki.
• Aby wymusić przepływ medium fizjologicznego w górę przez aperturę, zaciśnij wylotowy koniec rurki kleszczykami hemostatycznymi.
• Zaciśnij wlotowy koniec rurki kleszczykami hemostatycznymi i zamknij zawory włącz/wyłącz.
• Usuń wlotowy koniec rurki ze strzykawki i zatkaj oba końce rurki szklanymi zatyczkami.
• Usuń kleszczyki hemostatyczne.
• Usuń wodę z górnej fiolki.
• Napełnij górną fiolkę filtrowanym sterylnym medium fizjologicznym.
• Umieść chip z powrotem w szalce Petriego 10 mm.
• Wstaw podstawę szalki 35 mm do szalki 10 mm i napełnij ją filtrowaną sterylną wodą dejonizowaną, aby zwiększyć wilgotność.
• Przykryj szalkę aż do momentu wysiewania.

4. Wysiew neuronów ślimaka

Chipach do techniki patch-clamp mogą być odpowiednie dla różnych rodzajów preparatów. Obecnie testujemy nasze chipy z użyciem pierwotnych neuronów kory ssaków i uzyskaliśmy wstępne wyniki dla komórek hodowanych przez 14 dni ⁷, co wskazuje, że nasz protokół sterylizacji jest odpowiedni, a chipy nie wykazują cytotoksyczności w hodowlach długoterminowych. Na potrzeby niniejszego protokołu wybrano neurony ślimaka, ponieważ stanowią one prosty, ale dobrze udokumentowany model do badania elektrofizjologii neuronów ¹, i to właśnie na tych komórkach uzyskaliśmy do tej pory najbardziej znaczące wyniki ¹⁰. Szczegółowe procedury izolacji i hodowli komórek zostały opisane wcześniej ^{12, 13}.

• 
  
  Usuń zewnętrzną powłokę z osobników w wieku 2-3 miesięcy Lymnaea stagnalis za pomocą pęsety tępej i znieczulić zwierzęta w Lymnaea roztwór soli fizjologicznej zawierający 10% Listerine.
  
  Wszystkie kolejne etapy przeprowadzono aseptycznie w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy użyciu wysterylizowanego sprzętu do sekcji oraz roztworów w temperaturze pokojowej.
• Wymień media fizjologiczne w układzie płynnym na odpowiedni roztwór rejestracyjnyużywając pipetkę Eppendorf. W przypadku Lymnaea neurony; roztwór zawiera (w mM): 50 KCl, 5 MgCl2₂, 5 kwasu etylenobis(oksyetylenenitrylo)tetraoctowego (EGTA) oraz 5 kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES; pH 7,4; 130 mOsm)¹⁴
• Przymocuj ślimaki szpilkami do naczynia Sylgard wypełnionego Lymnaea płucząc solą fizjologiczną i usuwając cały mózg zgodnie z wcześniejszym opisem ¹³
• Wyizolowane mózgi w określonym medium (DM) inkubowano z enzymem trypsyną (roztwór 0,2%, Sigma, nr katalogowy T-9201) przez 18 minut, a następnie poddano działaniu DM i inhibitora trypsyny (Sigma, sojowy, nr katalogowy T-903) przez 15 minut.
• Przymocuj mózgi w małym naczyniu z Sylgardu wypełnionym zdefiniowaną pożywką o wysokiej osmoliarności (HODM – pożywka DM z dodatkiem glukozy; 750 μL roztworu glukozy 1M do 20 ml medium DM).
• Używając precyzyjnej pęsety i nożyczek do sekcji, należy usunąć osłonkę zewnętrzną i wewnętrzną badanych zwojów, aby odsłonić neurony.
• Używając wypalanej szklanej pipety wypełnionej medium HODM i podłączonej do mikroszystrzyki, należy zastosować delikatne ssanie w pobliżu wybranej komórki (lewa grzbietowa 1 kończyny krocznej), aż neuron oddzieli się od mózgu i zostanie zawieszony w pipecie.
• Następnie szklaną pipetę przenosi się i zanurza w poszczególnych neurochipach, gdzie delikatne wypchnięcie zawartości z mikrosyringi pozwala na łagodne przesunięcie neuronów z pipety i umieszczenie ich nad poszczególnymi otworami typu patch w chipach.
• Pozostawić komórki w spokoju przez co najmniej 2 h w temperaturze pokojowej, aby wspomóc ich przywieranie do powierzchni chipa wokół otworu.

5. Rejestracje elektrofizjologiczne

Aby podłączyć chipy do wzmacniacza (w naszym przypadku był to wzmacniacz Multiclamp 70B, Molecular Devices, Foster City, CA, USA)

• Wymień roztwór w podziemnym kanale płynowym oraz w fiolce chipa na odpowiednie roztwory pomiarowe. W przypadku neuronów Lymnaea górne komory hodowlane wypełnia się solą fizjologiczną dla Lymnaea (w mM: 51.3 NaCl, 1.7 KCl, 4 CaCl2 i 1.5 MgCl2) z buforem HEPES do pH 7.9.¹⁴
• W celu zapewnienia stabilności przyklej chip do szkiełka przedmiotowego i umieść go pod mikroskopem.
• Aby podłączyć chip do wzmacniacza (w naszym przypadku wzmacniacz Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, USA), przetnij jeden koniec rurki i włóż srebrny drut połączony z przedwzmacniaczem (head-stage).
• Umieść elektrodę odniesienia w górnej fiolce chipa.
• Chip jest teraz gotowy do rejestracji.
• Przy użyciu wzmacniacza zastosuj skok napięcia 5 mV, aby zmierzyć całkowitą rezystancję (R_t) i określić konfigurację neuronów: cell-attached (R_t > 1 GΩ); whole-cell (Rt = 50-100 MΩ wraz z przejściami pojemnościowymi, co wskazuje na przerwanie błony w obrębie apertury); lub brak uszczelnienia (R_t < 5 MΩ). W naszej ostatniej serii doświadczeń ¹⁰ 58% komórek posiadało uszczelnienia o wysokiej rezystancji, a z nich 80% wykazało odpowiedzi pobudliwe.

6. Reprezentatywne wyniki

• Przyłożone do neuronu (w tym przypadku LPeD1) depolaryzujące impulsy prądowe (w przyrostach 20 pA).
• Utrzymanie neuronu przy Vm bliskim jego potencjałowi spoczynkowemu (~ - 60 mV).
• Obserwacja odpowiedzi na te impulsy depolaryzacyjne. W przypadku żywotnego neuronu powinny być obserwowane potencjały czynnościowe z overshootem.
• Rycina 4 przedstawia reprezentatywny wynik, który został szczegółowo omówiony w ^{14, 15}.

Rycina 4. Odpowiedzi napięciowe (góra) neuronu LPeD1 na stopniowaną serię impulsów prądu wewnątrzkomórkowego (dół). Impulsy prądu aplikowano przy Vm = -60 mV.

Rozwiązywanie problemów

• Przed wysiewaniem należy wykonać obrazowanie chipów, aby sprawdzić, czy membrana i otwór są wolne od zanieczyszczeń i nadają się do wysiewania. Używamy mikroskopu pionowego i obiektywu 20x z dużą odległością roboczą. W naszej ostatniej serii eksperymentów ¹ w ten sposób pomyślnie przygotowano 67% chipów.
• W przypadku obecności zanieczyszczeń i/lub pęcherzyków powietrza należy odrzucić chip i spróbować innego.
• Można wypróbować różne obróbki powierzchniowe (plazma) lub powłoki (PDL, PEI itp.), jednak sukces może być w dużej mierze zależny od użytego typu komórek.
• Skład roztworu płynnego („pipetowego”) ma kluczowe znaczenie dla utworzenia giga-uszczelnienia i konfiguracji whole-cell. Należy dostosować roztwór, zwracając uwagę na osmolarność, pH i skład jonowy.
• W przypadku hodowli długoterminowej należy rozpocząć od pożywki w kanale mikroprzepływowym, a następnie przed rejestracją zmienić ją na roztwór pipetowy poprzez łagodną perfuzję grawitacyjną (~0,5 ml/min).

Dyskusja

Platforma badawcza chipów do techniki patch-clamp opracowana przez NRCC stanowi potencjalnie potężne narzędzie do wysokoinformacyjnych analiz farmakologicznych oraz badania modeli chorób in vitro. Jej zaletą w porównaniu do szklanych pipet jest niski opór dostępu, co ułatwia badanie dużych komórek, a mimo nieco większej pojemności, zapewnia porównywalną dynamikę w przypadku mniejszych komórek. Rutynowo uzyskiwano spontaniczne uszczelnienia między komórką a otworem, a wejście w konfigurację whole-cell miało charakter spontaniczny ¹⁴. Wyraźną różnicą między chipami a metodą z użyciem szklanej pipety jest fakt, że sonda stanowi część naczynia do hodowli komórkowej i nie jest wprowadzana w kontakt z błoną komórkową ręcznie. Hodowanie komórek, potencjalnie będących częścią sieci funkcjonalnych, pozwala na uzyskanie bardziej biologicznie istotnych modeli chorób oraz zapewnia inny mechanizm uzyskiwania wysokich uszczelnień między komórką a sondą ¹⁶. Jednak w przeciwieństwie do zawiesin komórkowych, do pozycjonowania komórki na sondzie nie można zastosować aspiracji. Neurony ślimaka, podobnie jak inne duże komórki, można pozycjonować ręcznie nad sondą. W przypadku mniejszych komórek wymagających dłuższego czasu hodowli wyeliminowaliśmy konieczność jakiejkolwiek manipulacji i utrzymaliśmy wysokie prawdopodobieństwo uzyskania uszczelnienia poprzez naniesienie wzorów z polipeptydów adhezyjnych na wierzchołki sond w celu rozmieszczenia na nich komórek, co zostało udowodnione w badaniach ^17,18.

NRCC opracowuje również polimidowy mikrofluidyczny chip do techniki patch-clamp ¹⁹ o pojemności porównywalnej z pojemnością szklanej pipety. Ostatecznym celem tego projektu jest stworzenie wielosondowego chipa patch-clamp, który umożliwi jednoczesne monitorowanie aktywności elektrofizjologicznej kilku neuronów zaangażowanych w zachowania sieciowe z rozdzielczością pojedynczych kanałów jonowych ¹⁴. Metoda ta stanowi wysokorozdzielczą metodę komplementarną do macierzy wieloelektrodowych 20.