Artykuł metodologiczny

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

28.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3297

⸱

23 grudnia 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Materials Science Program, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin-Madison, 4Carbone Comprehensive Cancer Center and Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Streszczenie

W ciągu ostatnich 40 lat Stany Zjednoczone zainwestowały ponad 200 miliardów dolarów w badania nad rakiem, co doprowadziło do spadku śmiertelności jedynie o 5%. Główną przeszkodą w poprawie wyników leczenia pacjentów jest niewystarczające zrozumienie mechanizmów leżących u podłoża migracji komórkowej związanej z agresywną inwazją komórek nowotworowych, przerzutami oraz opornością terapeutyczną1. Glioblastoma Multiforme (GBM), najczęściej występujący pierwotny złośliwy nowotwór mózgu u dorosłych2, jest przykładem tej trudności. Pomimo standardowej operacji, radioterapii i chemioterapii, mediana przeżycia pacjentów wynosi zaledwie piętnaście miesięcy, co wynika z agresywnej infiltracji GBM do sąsiednich obszarów mózgu i szybkiego nawrotu nowotworu2. Interakcje między aberracyjnymi mechanizmami migracji komórek a mikrośrodowiskiem guza prawdopodobnie odróżniają komórki nowotworowe od prawidłowych3. Dlatego ulepszenie podejść terapeutycznych w GBM wymaga lepszego zrozumienia mechanizmów migracji komórek rakowych. Niedawne prace sugerują, że niewielka subpopulacja komórek w GBM, czyli macierzyste komórki nowotworu mózgu (BTSC), może odpowiadać za oporność terapeutyczną i nawroty. Mechanizmy leżące u podłoża zdolności migracyjnej BTSC zaczynają być dopiero charakteryzowane1,4.

Ze względu na ograniczenia w inspekcji wizualnej i manipulacji geometrycznej, konwencjonalne testy migracji5 ograniczają się do ilościowej oceny całych populacji komórek. W przeciwieństwie do nich, urządzenia mikroprzepływowe umożliwiają analizę pojedynczych komórek dzięki kompatybilności z nowoczesną mikroskopią oraz kontroli nad mikrośrodowiskiem6-9.

Przedstawiamy metodę szczegółowej charakterystyki migracji BTSC przy użyciu mikroprzepływowych urządzeń przedzielonych na komory. Urządzenia te, wykonane z PDMS, przekształcają środowisko hodowli tkankowej w trzy połączone komory: komorę zasiewu, komorę odbiorczą oraz mikrokanały łączące. Urządzenie zostało opracowane w taki sposób, aby obie komory zawierały wystarczającą ilość pożywki do podtrzymania żywotności BTSC przez 4-5 dni bez wymiany pożywki. Wysoko mobilne komórki BTSC, początkowo wprowadzone do komory zasiewu, są izolowane po migracji przez mikrokanały łączące do równoległej komory odbiorczej. Migracja ta symuluje rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych przez przestrzenie śródmiąższowe mózgu. W ciągu kilku dni rejestrowane są obrazy w fazie jasnej, ukazujące morfologię komórek podczas migracji. Dzięki temu możliwe jest wyizolowanie, ponowne hodowanie i dalsza analiza wysoce migrujących BTSC.

Kompartymentacja mikroprzepływowa może stanowić wszechstronną platformę do badania zachowania migracyjnego BTSCs oraz innych komórek macierzystych nowotworu. Dzięki połączeniu generatorów gradientów, systemów obsługi płynów, mikroelektrod i innych modułów mikroprzepływowych, urządzenia te mogą być również wykorzystywane do przesiewania leków i diagnostyki chorób6. Izolacja agresywnej subpopulacji komórek migrujących umożliwi badanie leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych.

Protokół

1. Dysocjacja komórek BTSC

BTSCs pochodzą z istniejących kultur hodowanych w bezserwatkowym medium dla komórek macierzystych w formie neurosfer, których hodowla została opisana wcześniej10, 1.

  1. Przygotować zawiesinę komórkową z neurosfer pochodzących z BTSC. Neurosfery pochodzące z BTSC zebrać do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować z prędkością 90 rpm przez 5 minut. Szybsze wirowanie może doprowadzić do ścinania i/lub uszkodzenia neurosfer. Nadpłyn odessać, a kulturę neurosfer zawiesić ponownie w 0,5 ml uprzednio ogrzanej Accutase. Roztwór inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37°C, aby umożliwić rozluźnienie neurosfer. Komórki rozbić mechanicznie, wykonując 10-20 delikatnych ruchów pipetą P10, a następnie dodać do komórek 1,5 ml pożywki dla komórek macierzystych w celu neutralizacji Accutase.
  2. Następnie BTSC odwirować z prędkością 1300 rpm przez 5 minut i zawiesić ponownie w 1 ml pożywki dla komórek macierzystych.
  3. Z zawiesiny pobrać alikwot o objętości 50 μl i przenieść go do probówki do mikrocentryfugi w celu policzenia komórek. Do probówki Eppendorf dodać 50 μl błękitu trypanowego, a zawiesinę nanieść na komorę liczniczą (hemocytometr) w celu policzenia komórek.
  4. Jeśli po policzeniu komórek okaże się to konieczne, do zawiesiny BTSC dodać dodatkową ilość pożywki dla komórek macierzystych, aby uzyskać gęstość komórkową na poziomie 20 0 żywych komórek/μl pożywki.

2. Wykonanie dwuwarstwowej matrycy SU-8 i odlewanie stempla PDMS (patrz rycina 1)

Wykorzystujemy litografię optyczną oraz litografię miękką do wytworzenia matrycy z SU-8 i stempla z PDMS, które są niezbędne do montażu urządzeń mikroprzepływowych. W odróżnieniu od standardowej procedury12, nasza matryca z SU-8 składa się z dwóch warstw. Mikrokanały o wysokości 3 μm są odlewane w pierwszej/dolnej warstwie we wcześniejszym etapie procesu, natomiast komory zasiewcze i odbiorcze o wysokości 250 μm znajdują się w drugiej/górnej warstwie. Aby zapewnić prawidłowe połączenie między dwiema komorami hodowlanymi (mikrokanałami a komorami), obie warstwy muszą zostać precyzyjnie wyrównane pod względem położenia. Jednak grubość i nieprzezroczystość drugiej warstwy są na tyle duże, że blokują dostęp markerów referencyjnych/optycznego wyrównywacza do elementów dolnej warstwy. W związku z tym zaprojektowaliśmy maski z markerami referencyjnymi umieszczonymi w zdalnej pozycji. Dzięki temu markery w pierwszej warstwie mogą zostać selektywnie osłonięte podczas wirowania drugiej warstwy. W rezultacie oba poziomy struktur są wytwarzane w jednej matrycy i gotowe do odciśnięcia w formie basreliefu stempla z PDMS.

  1. Zaprojektować i przygotować dwie fotomaski. Pierwsza maska składa się z dwóch znaczników fiducjalnych i matrycy mikrokanałów (o długości 40 μm i szerokości 10-50 μm) dla pierwszej warstwy. Druga maska składa się z komór wysiewczych i odbiorczych (o długości 2 mm i szerokości 60 μm) dla drugiej warstwy. Obie maski są projektowane w programie Illustrator (Adobe, California), drukowane laserowo na foliach przezroczystych (Thin Metal Parts, Colorado), oczyszczane izopropanolem i suszone powietrzem.
  2. Wykonać pierwszą warstwę z fotorezystu SU-8 (MicroChem, Massachusetts) zgodnie z instrukcją produktu od dostawcy. Najpierw nałożyć metodą spin-coatingu na wafer nośny (WRS Materials, California) fotorezyst SU-8 (5) o grubości 3 μm, a następnie przeprowadzić wstępne wygrzewanie (soft-baking). Fotorezyst jest następnie naświetlany promieniami ultrafioletowymi i utwardzany z zastosowaniem odpowiedniej maski w kontakcie ścisłym, po czym następuje wygrzewanie końcowe (post-baking) i wywoływanie.
  3. Nałożyć metodą spin-coatingu drugą warstwę z SU-8 (210) o grubości 250 μm. Aby zapobiec zablokowaniu znaczników fiducjalnych z pierwszej warstwy przez grubą warstwę fotorezystu, obszary te zaklejamy taśmą klejącą przed nałożeniem drugiej warstwy. Następnie taśmę odkleja się, aby odsłonić znaczniki w celu wyrównania.
  4. Naświetlić drugą warstwę promieniami UV za pomocą drugiej maski. Po odsłonięciu znaczników wyrównania można je łatwo dopasować do znaczników na drugiej masce za pomocą optycznego wyrównywacza masek. Druga warstwa fotorezystu jest następnie naświetlana promieniami ultrafioletowymi i utwardzana w kontakcie ścisłym, po czym następuje wygrzewanie końcowe (post-baking) i wywoływanie.
  5. Nałożyć powłokę antyadhezyjną na otrzymaną matrycę. Aby ułatwić usuwanie utwardzonego PDMS, matrycę SU-8 można silanizować metodą osadzania z fazy gazowej, aby uzyskać powierzchnię o właściwościach nieprzywierających. Wystarczy umieścić ją w eksykatorze na co najmniej jedną godzinę w próżni z kilkoma kroplami roztworu trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silanu.
  6. Odlać PDMS z matrycy. Dokładnie zmieszać bazę prepolimeru i utwardzacz PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) w stosunku 10:1. Umieścić mieszaninę w eksykatorze w celu odgazowania próżniowego, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Wylać mieszaninę na maskę i ponownie odgazować, jeśli pojawiły się nowe pęcherzyki powietrza. Utwardzać formę na poziomej płycie grzejnej przez 2 godziny w temperaturze 90 °C. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej ostrożnie odkleić stempel z PDMS. W ten sposób w PDMS zostają wytrawione kanały hodowlane, gotowe do montażu urządzenia. Matryca nadaje się do wielokrotnego użytku w procesie odlewania, dopóki nie ulegnie pęknięciu lub zużyciu. Powłokę antyadhezyjną należy nałożyć ponownie, gdy powierzchnia odzyska właściwości przylegania.

3. Montaż urządzeń mikroprzepływowych i hodowla komórek (rycina 2)

W celu hodowli komórek stempel z PDMS z wytrawionymi strukturami zostaje przymocowany do szkiełka nakrywkowego, aby utworzyć zamknięte kanały. Tworzone są wloty i wyloty służące do wprowadzania pożywki/mediów. Jednocześnie konieczne jest przeprowadzenie oczyszczania oraz innych procedur w odniesieniu do podłoża szklanego i stempla z PDMS, aby zapewnić biokompatybilność z komórkami.

  1. Za pomocą wycinaka do biopsji wykonaj otwory tworzące zbiorniki w stemplu z PDMS. Wybieramy średnicę 6 mm. Zbiorniki te służą dwóm celom: przechowywaniu dodatkowych składników odżywczych dla wzrostu komórek oraz umożliwieniu dostępu dla pipety podczas ładowania i aspiracji próżniowej.
  2. Namocz stempel z PDMS w 70% etanolu przez 30 min, a następnie płucz go wodą dejonizowaną przez kolejne 10 min. Celem jest usunięcie potencjalnych pozostałości organicznych wprowadzonych podczas procesu produkcji oraz zanieczyszczeń z nieusieciowanego PDMS. W innych pracach stosowano bardziej intensywne i gruntowne procesy czyszczenia, takie jak ekstrakcja organiczna13 i ekstrakcja Soxhleta14, jednak w przypadku hodowli BTSC uznaliśmy je za zbędne.
  3. Sterylizuj stempel z PDMS w autoklawie (121°C, 35 min). Ten etap dodatkowo dopełnia reakcję sieciowania PDMS. Od tego momentu aż do kroku 3.6 wszystkie procedury należy przeprowadzać w warunkach sterylnych.
  4. Stempel z PDMS umieść na szklanej lamelce, która została wcześniej pokryta poli-L-lizyną.15-17 Następnie pokryj urządzenie lamininą, wypełniając kanał roztworem lamininy przez noc w temperaturze 37°C. Odaspiruj lamininę z urządzenia i przemyj je pożywką dla komórek macierzystych.
  5. Wprowadź zawiesinę komórkową z kroku 1 do zbiorników i kanałów. Do jednego zbiornika zasiewowego wprowadź 11 μl zdysocjowanych komórek. W razie potrzeby użyj aspiracji próżniowej, aby wprowadzić komórki do komory zasiewowej. Do sąsiedniego zbiornika zasiewowego wprowadź dodatkowe 7 μl komórek. Uwaga: Średnia gęstość komórek wynosi 20,0 komórek/μl pożywki. Po pięciu minutach wypełnij zbiorniki zasiewowe i odbiorcze pożywką.
  6. Na wierzchu umieść wstępnie autoklawowaną arkusz z PDMS o grubości 0,5-1 mm. Naturalna adhezja powierzchniowa między dwoma kawałkami PDMS zapewni szczelność hodowli komórkowej, przygotowując ją do transportu, inkubacji i obrazowania mikroskopowego.

4. Długoterminowe obrazowanie poklatkowe migracji BTSC z wykorzystaniem systemu BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, USA).

Łącząc w jednej obudowie kamerę, oprogramowanie i inkubator, ten system mikroskopowy umożliwia obrazowanie hodowli komórkowych przez wiele dni bez ich zakłócania. Ponadto unikalna konstrukcja silnika przesuwa obiektyw, utrzymując stoлик z próbką w bezruchu podczas korzystania z funkcji odwiedzania punktów. Dzięki temu system ten jest praktyczny do obrazowania eksperymentów równoległych oraz śledzenia lokomocji komórek w badaniach wysokoprzepustowych.

  1. Poddać Biostation IM wstępnemu wyrównaniu przez 45 minut w celu stabilizacji temperatury, wilgotności i dopływu powietrza. W celu utrzymania odpowiedniej wilgotności w komorze próbki należy umieścić kilka naczyń z wodą.
  2. Umieścić urządzenie z komórkami w komorze próbki mikroskopu i wycentrować je za pomocą mikropincety.
  3. Ustawić ostrość, punkty położenia oraz punkty czasowe w oprogramowaniu Biostation i rozpocząć obrazowanie poklatkowe (time-lapse).

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykłady wizualnej inspekcji i charakterystyki migracji komórek rakowych z wykorzystaniem kompartymentowego urządzenia mikroprzepływowego przedstawiono na rysunku 3 oraz rysunku 4. Wykorzystano linię komórkową BTSC. Przy obecnej konfiguracji aparatury obrazy fazowe hodowli komórkowej mogą być rejestrowane w sposób ciągły przez okres do 5 dni (rysunek 3) z częstotliwością co 2 sekundy (rysunek 4). Po upływie 5 dni konieczna jest wymiana pożywki w celu uzupełnienia składników odżywczych i usunięcia produktów przemiany materii. Nasz długoterminowy obraz time-lapse pozwala zidentyfikować cykliczną sekwencję sześciu etapów stanu komórek podczas migracji, w oparciu o zmiany morfologiczne. Jak pokazano na rysunku 3, opisano je jako: (i) przedmigracyjny, (ii) inicjacji, (iii) eksploracji ścieżki, (iv) przemieszczania się, (v) eksploracji celu i (vi) pomigracyjny. W komorze odbiorczej komórki o wrzecionowatym kształcie pozostają w stadium (i), podobnie jak w guzach litej masy, gdzie są zdolne do wzrostu, podziału i stopniowej migracji. W miarę zbliżania się do wejścia do mikrokanału, niektóre komórki przechodzą do stadium (ii), w którym powiększają się i tworzą wypustki adhezyjne. Tylko jedna z nich jest w stanie zająć wejście i przejść do stadium (iii), w którym następuje eksploracja kierunku migracji. Po ustaleniu kierunku migracji, komórka przechodzi do stadium (iv), aby przemieszczać się przez mikrokanał ze stałą i wysoką prędkością, co utrzymuje się przez cały odcinek mikrokanału. Na końcu mikrokanału komórka przechodzi do stadium (v), aby eksplorować wolną przestrzeń komory odbiorczej, a następnie do stadium (vi). W mikrokanale siła napędowa migracji jest generowana głównie przez aktywność pęcherzykową (blebbing), jak zilustrowano na rysunku 4, co przypomina ruch komórek ameboidalnych. Proces blebbingu komórkowego i deformacji błony został tutaj w pełni zarejestrowany.

Schemat procesu fotolitografii; naświetlanie światłem UV wafla krzemowego z fotorezystem w celu mikrofabrykacji.
Rycina 1. Schematy wykonania urządzenia mikroprzepływowego. Cały proces przeprowadzono na 3-calowym podłożu z wafla krzemowego przy użyciu zmodyfikowanej techniki miękkiej litografii. 3-μm– wysokie mikrokanały oraz markery wyrównawcze wykonuje się analogicznie jak w pierwszej warstwie. Następnie 250-μmNanosi się grubą warstwę SU-8 metodą spin-coatingu, podczas gdy markery wyrównujące zostają zakryte taśmą klejącą, aby były one później dostępne dla urządzenia do wyrównywania masek bez blokowania widoczności przez gruby fotorezyst. Dzięki temu elementy komory mogą zostać wykonane jako druga warstwa i precyzyjnie wyrównane względem pierwszej warstwy. Następnie z otrzymanego matrycy odlewa się stempel z PDMS.

Schemat urządzenia mikroprzepływowego; mikrokanały PDMS, komory do hodowli komórek; wysiew komórek, przepływ pożywki.
Rycina 2. Schematy montażu urządzenia i procesu zasiewu komórek. Przestrzeń do hodowli 3D, zamknięta przez PDMS i szklaną lamellkę, składa się z komór, zbiorników i mikrokanałów. Komora zasiewna jest wypełniona kulturą komórek, natomiast komora odbiorcza jest początkowo wypełniona pożywką pozbawioną komórek. Mikrokanały łączące obie komory stanowią ścieżkę migracji komórek ze strony zasiewnej do strony odbiorczej.

Schemat przepływu w mikrokanale przedstawiający migrację komórek z komory zasiewu do komory odbiorczej w PDMS.
Rysunek 3. Migracja BTSC przez mikrokanał. Góra: migawki z filmu poklatkowego przedstawiają migrację pojedynczej komórki (wyróżnionej na zielono) przez 400 μm od strony zasiewu do strony odbiorczej. Cały proces trwa około 2 dni i obejmuje sekwencję zmian morfologicznych komórek. Pasek skali wynosi 40 μmNa dole: schematyczne przedstawienie sześciu etapów migracji. Przed migracją (i): w komorze zasiewczej wrzecionowate i zdolne do podziału komórki stopniowo migrują wzdłuż siebie. Komórki znajdujące się w pobliżu wlotu do mikrokanału konkurują ze sobą poprzez polaryzację ciała komórki i wysuwanie lamellipodiów. Inicjacja (ii): komórka migracyjna o najwyższej zdolności zajmuje wlot do kanału, podczas gdy pozostałe komórki wycofują się. Eksploracja ścieżki (iii): komórka migracyjna przechodzi w tryb ameboidalny o niewielkiej polaryzacji. Ten tryb migracji charakteryzuje się niezwykle wysoką ruchliwością i zdolnością do eksploracji ścieżki we wszystkich kierunkach poprzez tworzenie drobnych wypustek błonowych (blebbing). Przesuwanie się (iv): po wyznaczeniu ścieżki migracji komórka przechodzi w przystosowany tryb ameboidalny, utrzymując dodatkową dużą wypustkę skierowaną do przodu. W ten sposób komórka zachowuje wysoką ruchliwość oraz stały kierunek i prędkość. Eksploracja celu (v): na końcu ścieżki komórka zwalnia i rozwija filopodia, aby przeszukać komorę odbiorczą w poszukiwaniu celu inwazji. Po migracji (vi): po wejściu do komory odbiorczej komórka przybiera kształt gwiazby i zachowuje wysoką ruchliwość, lecz nie posiada określonego kierunku.

Analiza lokomocji owadów, schemat, markery strzałkowe, ruch kierunkowy, badanie biomechaniczne.
Rycina 4. Klatki z filmu time-lapse przedstawiają cykl aktywności blebowania i deformacji błony BTSC: (A-B) inicjacja; (B-D) ekspansja; (D-F) retrakcja. Strzałki i linie krzywe reprezentują odpowiednio kierunek oraz miejsce deformacji błony. Klatki były zbierane co 8 sekund.

Dyskusja

Przedstawione tutaj urządzenie mikroprzepływowe oraz technika rejestracji obrazu umożliwiają wizualną charakterystykę morfologii komórkowej podczas migracji. W porównaniu z istniejącymi konwencjonalnymi metodami, platforma mikroprzepływowa charakteryzuje się opłacalnością, wysoką przepustowością oraz elastycznością projektu. Przedstawiony system wizualizacji mikroskopowej pozwala na badanie i rejestrację długoterminowej migracji żywych komórek. Funkcja zmotoryzowanego obiektywu umożliwia śledzenie wielu ścieżek migracji z wysoką rozdzielczością obrazu bez zakłócania próbki.

Podczas montażu urządzenia stempel PDMS jest tymczasowo przytwierdzony do szkiełka podstawowego w celu ułatwienia powlekania PDL (krok 3.4). Osiągnięcie szczelnego połączenia jest kluczowe dla powodzenia tego protokołu. Zanieczyszczenia wprowadzone podczas produkcji urządzenia, takie jak pęcherzyki powietrza w stemplu lub kurz i drobiny na podłożu, mogą pogorszyć wiązanie i doprowadzić do wycieku płynu. Dlatego ważne jest obchodzenie się z urządzeniem w sposób zapobiegający zapyleniu, aby uniknąć awarii. Przed powlekaniem PDL szkiełka podstawowe są traktowane kwasem azotowym, a roztwór PDL jest wirowany w celu usunięcia kurzu i drobin. W przypadku braku dostępu do pomieszczenia czystego bardzo pomocne w usuwaniu kurzu i drobin ze stempla PDMS są taśma klejąca, płukanie alkoholem oraz kąpiel wodna. Po zetknięciu stempla PDMS ze szkiełkiem podstawowym delikatne opukiwanie stempla pęsetą ułatwia uszczelnienie.

Komórki macierzyste guza mózgu (BTSCs) można wzbogacić z próbek pobranych podczas operacji u ludzi poprzez hodowlę sfer w medium dla komórek macierzystych, analogicznie do hodowli prawidłowych neuralnych komórek macierzystych10. BTSCs wzbogacone w ten sposób wykazują właściwości typowe dla komórek macierzystych, takie jak ekspresja markerów komórek macierzystych (CD133, nestyna), różnicowanie w kierunku wielu linii neuralnych (glejowej i neuronalnej) oraz zdolność do inicjowania nowotworu w ortotopowym modelu mysim z niedoborem odporności przy użyciu zaledwie 100 komórek18. Mimo że istnieją pewne kontrowersje dotyczące oczyszczania i utrzymania BTSCs1, 19-21, BTSCs hodowane w formie sfer lepiej zachowują fenotyp i genotyp guza rodzicielskiego22-24.

Przegrodzona przestrzeń naśladuje środowisko fizjologiczne dla migracji komórek. W naszym urządzeniu BTSC wykazują silną zdolność do migracji przez przestrzeń o ograniczonej wielkości poprzez regulację morfologii komórkowej. Nasza charakterystyka zmian morfologicznych komórek wskazuje na transformacje trybów w sekwencji sześcioetapowej, która może stanowić nowy, szczegółowy opis procesu inwazji BTSC do sąsiednich obszarów mózgu. W początkowych etapach komórki zyskują znaczną polaryzację i generują wypustki adhezyjne, aby skutecznie zakotwiczyć się wewnątrz mikrokanału. Po ustaleniu obecności komórki w mikrokanale, przechodzi ona w tryb przelotowy i utrzymuje go przez całą drogę w mikrokanale. Na tym etapie BTSC zachowują wysoką ruchliwość i stały kierunek, jednocześnie oszczędzając energię. Co ciekawe, wydaje się, że jeden mikrokanał jest ograniczony do jednej komórki w trybie przelotowym w danym czasie, tak że gdy pojedyncza komórka przejdzie do tego etapu, pozostałe komórki wycofują się z mikrokanału. Mechanizm ten prawdopodobnie zapewnia efektywność rozprzestrzeniania się guza i zapobiega nadmiernemu zużyciu składników odżywczych w mikrokanale. Po zakończeniu migracji przez mikrokanał, komórka odzyskuje zdolność do tworzenia wypustek wielokierunkowych i dalszego poszukiwania celów inwazji lub nowych dróg migracji. Przegrodzone urządzenie mikrofluidyczne oferuje nową metodę in vitro tworzenia mikrośrodowiska do badania infiltracji miąższu mózgu przez BTSC.

Metodę tę można łatwo dostosować do badania komórek macierzystych nowotworu (CSC) oraz linii komórek migrujących pochodzących z innych typów guzów. Hodowlę komórek w urządzeniu mikrofluidycznym można przeprowadzić w każdym nowoczesnym laboratorium biologicznym wyposażonym w inkubator i zaplecze specjalistyczne w zakresie hodowli tkanek. Przy zastosowaniu matrycy su-8, odlewanie PDMS oraz montaż urządzenia są możliwe do wykonania po podstawowym przeszkoleniu w zakresie litografii miękkiej. Ponadto platformę tę można rozszerzyć o inne zastosowania poprzez integrację z dodatkowymi modułami funkcjonalnymi, takimi jak mieszalnik gradientowy, strukturyzacja powierzchni, kontrola przepływu cieczy oraz mikroelektrody.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

PAC jest częściowo finansowany z grantu NIH T32 przyznanego Programowi Szkolenia w Zakresie Komórek Macierzystych Uniwersytetu w Wisconsin (P. A. Clark). JSK był częściowo wspierany przez stanowisko profesora badań nad guzami mózgu HEADRUSH Brain Tumor Research Professorship, Roger Loff Memorial GBM Research Fund oraz UW Foundation/ Neurosurgery Brain Tumor Research and Education Fund. JCW i YH są częściowo finansowani z grantu NIH NIBIB 1R01EB009103-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco’zmodyfikowana pożywka Eagle (modified Eagle medium)’pożywka DMEM, wysoka zawartość glukozyGIBCO, by Life Technologies11965Materiały do hodowli komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
Szynka’s F12GIBCO, by Life Technologies31765Materiały do hodowli komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
suplement B27 bez witaminy AGIBCO, by Life Technologies12587-010Materiały do hodowli macierzystych komórek glejaka (BTSC)
Antybiotykowo-antymykotyczny (PSA)GIBCO, by Life Technologies15240Materiały do hodowli komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
Epidermal Growth Factor (EGF), ludzki rekombinowanyGIBCO, by Life TechnologiesPHG0313Materiały do hodowli macierzystych komórek nowotworu mózgu (BTSC)
podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), rekombinowany ludzkiGIBCO, by Life TechnologiesPHG0021Materiały do hodowli komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
Heparyna sodowa, z błony śluzowej jelit świniSigma-AldrichH1027-250KUMateriały do hodowli komórek macierzystych glejaka (BTSC)
Laminina (naturalna mysia)GIBCO, by Life Technologies23017-015Materiały do hodowli komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
AccutaseEMD MilliporeSCR005Materiały do hodowli macierzystych komórek guza mózgu (BTSC)
Pożywka do komórek macierzystych
  • 30% Hams F12
  • 70% DMEM
  • 1% antybiotyk-antymykotyk
  • 2% B27 bez witaminy A
  • EGF (20 ng/mL) i bFGF/heparyna (20 ng/mL bFGF, 5 mg/ml heparyny). Wymieszać składniki i przefiltrować sterylnie przed użyciem.
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)/Heparyna
  • Aliquot o stężeniu 20 μg/ml
  • Dla 25 μg: Dodaj 1,25 ml heparyny o stężeniu 5 mg/ml do 25 μg bFGF.
  • Dla 250 μg: Dodaj 1 ml heparyny o stężeniu 5 mg/ml do 250 μg bFGF. Przenieść do stożkowej probówki 15 ml i dodać 11,5 ml heparyny o stężeniu 5 mg/ml.
  • Przechowywać w temperaturze 50°C μl lub 250 μalikwoty w temperaturze -80°C°C.
Epidermalny czynnik wzrostu (EGF)<µl>
  • Koncentracja alikwotu 20 μg/ml
  • Dla 200 μg: Dodać 1 ml sterylnego DMEM (Gibco 11965-118) do 200 μg EGF. Przenieść do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i dodać 9 ml DMEM.
  • Dla 500 μg: Dodaj 1 ml sterylnego DMEM (Gibco 11965-118) do 200 μg EGF. Przenieść do probówki stożkowej o pojemności 50 ml i dodać 24 ml DMEM.
  • Przechowywać w temperaturze 50 μl lub 250 μalikwoty w temperaturze -80°C°C.
    • Heparyna
    • Stężenie alikwotu 5 mg/ml
    • Odważyć 100 mg heparyny.
    • Dodać 100 mg heparyny do 20 mL (70%)DMEM-(30%)F12-(1%)PSA (14 mL DMEM, 6 mL F12, 200 μL PSA)
    • Filtr sterylny
    • Przechowywać w temperaturze 50°C μl lub 250 μalikwoty w temp. -80°C°C
    fotorezyst SU-8MicroChem Corp.
    Krzemowy podłoże nośny (wafer)Materiały WRS3P01-5SSP-INV
    trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanSigma-Aldrich448931
    PDMS Sylgard 184Dow Corning
    lamininaBD Biosciences50 μg/ml w buforze PBS dla uzyskania stężenia końcowego
    Biostation IMNikon Instruments

    Bibliografia

    1. Carke, M. F. Cancer Stem Cells-Perspectives on Current Status and Future Directions. AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Research. 66, 9339-9344 (2006).
    2. Stupp, R. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352, 987-996 (2005).
    3. Sahai, E. Mechanisms of cancer cell invasion. Current Opinion in Genetics & Development. 15, 87-96 (2005).
    4. Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E. R., Morrison, S. J. Heterogeneity in Cancer: Cancer Stem Cells versus Clonal Evolution. Cell. 138, 822-829 (2009).
    5. Karnoub, A. E. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449, 557-557 (2007).
    6. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based Devices: New Tools for Studying Cancer and Cancer Stem Cell Migration. Biomicrofluidics. 5, (2011).
    7. Rolli, C. G., Seufferlein, T., Kemkemer, R., Spatz, J. P. Impact of Tumor Cell Cytoskeleton Organization on Invasiveness and Migration: A Microchannel-Based Approach. Plos One. 5, (2010).
    8. Chung, S. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a Chip. 9, 269-275 (2009).
    9. Irimia, D., Toner, M. Spontaneous migration of cancer cells under conditions of mechanical confinement. Integrative Biology. 1, 506-512 (2009).
    10. Svendsen, C. N. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85, 141-152 (1998).
    11. Clark, P. A. Glioblastoma cancer stem cells exhibit decreased dependence on exogenous growth factors for proliferation and survival. , Forthcoming Forthcoming.
    12. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37, 551-575 (1998).
    13. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab on a Chip. 7, 987-994 (2007).
    14. Regehr, K. J. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab on a Chip. 9, 2132-2139 (2009).
    15. Dent, E. W. Filopodia are required for cortical neurite initiation. Nature Cell Biology. 9, 1347-1347 (2007).
    16. Hu, X. D., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-Dependent Dynamic Microtubule Invasion of Dendritic Spines. Journal of Neuroscience. 28, 13094-13105 (2008).
    17. Vitzthum, L. Study of Na(+)/H(+) exchange-mediated pH(i) regulations in neuronal soma and neurites in compartmentalized microfluidic devices. Integrative Biology. 2, 58-64 (2010).
    18. Clark, P. A., Treisman, D. M., Ebben, J., Kuo, J. S. Developmental signaling pathways in brain tumor-derived stem-like cells. Developmental Dynamics. 236, 3297-3308 (2007).
    19. Chen, R. H. A Hierarchy of Self-Renewing Tumor-Initiating Cell Types in Glioblastoma. Cancer Cell. 17, 362-375 (2010).
    20. Pollard, S. M. Glioma Stem Cell Lines Expanded in Adherent Culture Have Tumor-Specific Phenotypes and Are Suitable for Chemical and Genetic Screens. Cell Stem Cell. 4, 568-580 (2009).
    21. Lobo, N. A., Shimono, Y., Qian, D., Clarke, M. F. The biology of cancer stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 675-699 (2007).
    22. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
    23. Lee, J. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
    24. Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Research. 64, 7011-7021 (2004).

    Przedruki i uprawnienia

    Tagi

    Macierzyste komórki glejakaanaliza migracji w mikrokanałachwytwarzanie urządzeń PDMSmikroskopia poklatkowaprotokół dysocjacji komórekanaliza pojedynczych komórekizolacja komórek migrujących
    Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek
    Skontaktuj się z nami
    Poleć bibliotece

    Prywatność

    Warunki korzystania z usługi

    Zasady

    Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.