Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Podsumowanie

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Streszczenie

W ciągu ostatnich 40 lat Stany Zjednoczone zainwestowały ponad 200 miliardów dolarów w badania nad rakiem, co doprowadziło do spadku śmiertelności jedynie o 5%. Główną przeszkodą w poprawie wyników leczenia pacjentów jest niewystarczające zrozumienie mechanizmów leżących u podłoża migracji komórkowej związanej z agresywną inwazją komórek nowotworowych, przerzutami oraz opornością terapeutyczną¹. Glioblastoma Multiforme (GBM), najczęściej występujący pierwotny złośliwy nowotwór mózgu u dorosłych², jest przykładem tej trudności. Pomimo standardowej operacji, radioterapii i chemioterapii, mediana przeżycia pacjentów wynosi zaledwie piętnaście miesięcy, co wynika z agresywnej infiltracji GBM do sąsiednich obszarów mózgu i szybkiego nawrotu nowotworu². Interakcje między aberracyjnymi mechanizmami migracji komórek a mikrośrodowiskiem guza prawdopodobnie odróżniają komórki nowotworowe od prawidłowych³. Dlatego ulepszenie podejść terapeutycznych w GBM wymaga lepszego zrozumienia mechanizmów migracji komórek rakowych. Niedawne prace sugerują, że niewielka subpopulacja komórek w GBM, czyli macierzyste komórki nowotworu mózgu (BTSC), może odpowiadać za oporność terapeutyczną i nawroty. Mechanizmy leżące u podłoża zdolności migracyjnej BTSC zaczynają być dopiero charakteryzowane^1,4.

Ze względu na ograniczenia w inspekcji wizualnej i manipulacji geometrycznej, konwencjonalne testy migracji⁵ ograniczają się do ilościowej oceny całych populacji komórek. W przeciwieństwie do nich, urządzenia mikroprzepływowe umożliwiają analizę pojedynczych komórek dzięki kompatybilności z nowoczesną mikroskopią oraz kontroli nad mikrośrodowiskiem^6-9.

Przedstawiamy metodę szczegółowej charakterystyki migracji BTSC przy użyciu mikroprzepływowych urządzeń przedzielonych na komory. Urządzenia te, wykonane z PDMS, przekształcają środowisko hodowli tkankowej w trzy połączone komory: komorę zasiewu, komorę odbiorczą oraz mikrokanały łączące. Urządzenie zostało opracowane w taki sposób, aby obie komory zawierały wystarczającą ilość pożywki do podtrzymania żywotności BTSC przez 4-5 dni bez wymiany pożywki. Wysoko mobilne komórki BTSC, początkowo wprowadzone do komory zasiewu, są izolowane po migracji przez mikrokanały łączące do równoległej komory odbiorczej. Migracja ta symuluje rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych przez przestrzenie śródmiąższowe mózgu. W ciągu kilku dni rejestrowane są obrazy w fazie jasnej, ukazujące morfologię komórek podczas migracji. Dzięki temu możliwe jest wyizolowanie, ponowne hodowanie i dalsza analiza wysoce migrujących BTSC.

Kompartymentacja mikroprzepływowa może stanowić wszechstronną platformę do badania zachowania migracyjnego BTSCs oraz innych komórek macierzystych nowotworu. Dzięki połączeniu generatorów gradientów, systemów obsługi płynów, mikroelektrod i innych modułów mikroprzepływowych, urządzenia te mogą być również wykorzystywane do przesiewania leków i diagnostyki chorób⁶. Izolacja agresywnej subpopulacji komórek migrujących umożliwi badanie leżących u ich podstaw mechanizmów molekularnych.

Protokół

1. Dysocjacja komórek BTSC

BTSC są pochodne z istniejących kultur hodowanych w bezserwatkowym medium dla komórek macierzystych w formie neurosfer, których hodowla została opisana wcześniej^{10, 11}.

1. Przygotować zawiesinę komórkową z neurosfer pochodzących z BTSC. Neurosfery pochodzące z BTSC zbiera się do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wiruje przy 900 rpm przez 5 minut. Zbyt szybkie wirowanie może doprowadzić do ścinania i/lub uszkodzenia neurosfer. Nadkład jest odsysany, a hodowlę neurosfer resuspensuje się w 0,5 ml uprzednio ogrzanej substancji Accutase. Roztwór inkubuje się przez 5-10 minut w temperaturze 37°C, aby umożliwić rozluźnienie neurosfer. Komórki rozbija się mechanicznie, wykonując 10-20 delikatnych ruchów pipetą P100, a następnie dodaje 1,5 ml medium dla komórek macierzystych, aby zneutralizować Accutase.
2. Następnie BTSC wiruje się przy 1300 rpm przez 5 minut i resuspensuje w 1 ml medium dla komórek macierzystych.
3. Z zawiesiny pobiera się alikwot o objętości 50 μl i przenosi do probówki do mikrocentryfugi w celu zliczenia komórek. Do probówki Eppendorf dodaje się 50 μl błękitu trypanu, a następnie nanosi zawiesinę na komorę licznikową do zliczenia komórek.
4. Jeśli po zliczeniu komórek jest to konieczne, do zawiesiny BTSC dodaje się dodatkowe medium dla komórek macierzystych, aby uzyskać gęstość 20 000 żywych komórek/μl medium.

2. Wytwarzanie dwuwarstwowej matrycy z su-8 i odlewanie stempla z PDMS (patrz ryc. 1)

Do wykonania matrycy z SU-8 oraz stempla z PDMS, które są niezbędne do montażu urządzeń mikroprzepływowych, wykorzystujemy litografię optyczną i litografię miękką. W odróżnieniu od standardowej procedury¹², nasza matryca z SU-8 składa się z dwóch warstw. Mikrokanały o wysokości 3 μm są odlewane w pierwszej/dolnej warstwie wcześniej w procesie, natomiast komory wysiewcze i odbiorcze o wysokości 250 μm znajdują się w drugiej/górnej warstwie. Aby zapewnić prawidłowe połączenie między dwiema sekcjami hodowlanymi (mikrokanałami a komorami), obie warstwy muszą zostać precyzyjnie wyrównane pod względem położenia. Jednak grubość i nieprzezroczystość drugiej warstwy są na tyle duże, że blokują dostęp optycznego wyrównywacza do elementów dolnych. W związku z tym zaprojektowaliśmy maski z markerami referencyjnymi umieszczonymi w pewnej odległości. Dzięki temu markery w pierwszej warstwie mogą zostać selektywnie osłonięte podczas wirowania drugiej warstwy. W rezultacie obie warstwy elementów są wykonane w jednej matrycy i gotowe do formowania w basiorze stempla z PDMS.

1. Zaprojektować i przygotować dwie fotomaski. Jedna maska składa się z dwóch markerów referencyjnych i macierzy mikrokanałów (o długości 400 μm i szerokości 10-50 μm) dla pierwszej warstwy. Druga maska składa się z komór zasiewczych i odbiorczych (o długości 2 mm i szerokości 600 μm) dla drugiej warstwy. Obie maski zostają zaprojektowane w programie Illustrator (Adobe, Kalifornia), wydrukowane laserowo na foliach przezroczystych (Thin Metal Parts, Kolorado), oczyszczone izopropanolem i wysuszone powietrzem.
2. Wykonać pierwszą warstwę z fotorezystu su-8 (MicroChem, Massachusetts) zgodnie z instrukcją dostawcy. Najpierw nałożyć metodą spin-coatingu na podłoże krzemowe (WRS Materials, Kalifornia) warstwę fotorezystu su-8 (5) o grubości 3 μm, a następnie przeprowadzić wstępne wygrzewanie (soft-baking). Fotorezyst zostaje następnie naświetlony promieniami UV i utwardzony przy użyciu odpowiedniej maski w kontakcie bezpośrednim, po czym następuje wygrzewanie końcowe (post-baking) i wywoływanie.
3. Nałożyć metodą spin-coatingu drugą warstwę su-8 (2100) o grubości 250 μm. Aby zapobiec zablokowaniu markerów referencyjnych z pierwszej warstwy przez gruby fotorezyst, przed nałożeniem drugiej warstwy obszary te należy pokryć taśmą klejącą. Następnie taśmę odkleja się, aby odsłonić markery do celów wyrównania.
4. Naświetlić drugą warstwę promieniami UV przy użyciu drugiej maski. Dzięki odsłoniętym markerom wyrównania łatwo jest dopasować je do markerów w drugiej masce za pomocą optycznego wyrównywacza masek. Druga warstwa fotorezystu zostaje następnie naświetlona promieniami UV i utwardzona w kontakcie bezpośrednim, a następnie poddana wygrzewaniu końcowemu i wywoływaniu.
5. Nałożyć powłokę antyadhezyjną na otrzymaną matrycę. Aby ułatwić usuwanie utwardzonego PDMS, matrycę su-8 można silanizować poprzez osadzanie z fazy gazowej, aby stworzyć powierzchnię o właściwościach nieprzywierających. Należy umieścić ją w deskryptyku na co najmniej jedną godzinę w próżni, dodając kilka kropel roztworu trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu.
6. Odlać PDMS z matrycy. Dokładnie zmieszać bazę prepolimeru i utwardzacz PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) w stosunku 10:1. Umieścić mieszaninę w deskryptyku w celu odgazowania w próżni, aż do czasu całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Wylać mieszaninę na maskę i ponownie odgazować, jeśli pojawią się nowe pęcherzyki powietrza. Utwardzać formę na poziomym bloku grzewczym przez 2 godziny w temperaturze 90 C. Po ostygnięciu do temperatury pokojowej ostrożnie oddzielić stempel z PDMS. W ten sposób w PDMS zostają wytrawione kanały hodowlane, gotowe do montażu urządzenia. Matryca może być wielokrotnie wykorzystywana do odlewania, dopóki nie pęknie lub nie ulegnie zużyciu. Powłokę antyadhezyjną należy nałożyć ponownie, gdy powierzchnia zacznie przywierać.

3. Montaż urządzeń mikroprzepływowych i hodowla komórek (rycina 2)

W celu hodowli komórek stempel z PDMS z wytrawionymi strukturami zostaje przymocowany do szkiełka podstawowego, aby utworzyć zamknięte kanały. Tworzone są wloty i wyloty służące do wprowadzania hodowli/pożywek. Jednocześnie niezbędne jest oczyszczenie oraz przeprowadzenie innych procedur w odniesieniu do podłoża szklanego i stempla z PDMS, aby zapewnić kompatybilność z komórkami.

1. Wykonaj otwory rezerwuarów w stemplu PDMS za pomocą dziurkacza do biopsji. Wybrano średnicę 6 mm. Rezerwuary te służą dwóm celom: zapewnieniu dodatkowych składników odżywczych dla wzrostu komórek oraz umożliwieniu dostępu dla pipety podczas wprowadzania próbki i aspiracji próżniowej.
2. Namocz stempel PDMS w 70% etanolu przez 30 min, a następnie płucz wodą dejonizowaną przez kolejne 10 min. Celem jest usunięcie potencjalnych pozostałości organicznych wprowadzonych podczas procesu produkcji oraz zanieczyszczeń z nieusieciowanego PDMS. W innych pracach stosowano bardziej intensywne i dokładne procesy czyszczenia, takie jak ekstrakcja organiczna¹³ i ekstrakcja Soxhleta¹⁴, jednak w przypadku hodowli BTSC uznano je za zbędne.
3. Sterylizuj stempel PDMS w autoklawie (121°C, 35 min). Ten etap dodatkowo dopełnia reakcję sieciowania PDMS. Od tego momentu aż do kroku 3.6 wszystkie procedury są wykonywane w warunkach sterylnych.
4. Stempel PDMS ułóż na szklanym nakryciu, które zostało wcześniej pokryte poli-L-lizyną.^15-17 Następnie pokryj urządzenie lamininą, wypełniając kanał roztworem lamininy przez noc w temperaturze 37°C. Lamininę odessaj z urządzenia, a następnie przemyj je pożywką dla komórek macierzystych.
5. Wprowadź zawiesinę komórkową z kroku 1 do rezerwuarów i kanałów. Do jednego rezerwuaru zasiewowego wprowadź 11 μl zdysocjowanych komórek. W razie potrzeby użyj aspiracji próżniowej, aby wymusić przemieszczenie komórek do komory zasiewowej. Dodatkowe 7 μl komórek wprowadź do sąsiedniego rezerwuaru zasiewowego. Uwaga: średnie zagęszczenie komórek wynosi 20 000 komórek/μl pożywki. Po pięciu minutach wypełnij rezerwuary zasiewowe i odbiorcze pożywką.
6. Na górze umieść wcześniej autoklawowaną arkusz PDMS o grubości 0,5-1 mm. Naturalna adhezja powierzchniowa między dwoma elementami PDMS zapewni szczelność hodowli komórkowej, przygotowując ją do transportu, inkubacji i obrazowania mikroskopowego.

4. Długoterminowe obrazowanie time-lapse migracji BTSC z wykorzystaniem BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, USA).

Dzięki połączeniu kamery, oprogramowania i inkubatora w jednym urządzeniu, ten system mikroskopowy umożliwia obrazowanie hodowli komórkowych przez wiele dni bez zakłócania ich stanu. Dodatkowo, unikalna konstrukcja silnika przesuwa obiektyw, utrzymując stolik z próbką w bezruchu podczas korzystania z funkcji odwiedzania punktów. Pozwala to na praktyczne obrazowanie eksperymentów równoległych oraz śledzenie lokomocji komórek w testach wysokoprzepustowych.

1. Przedstępnie wyrównaj warunki w urządzeniu Biostation IM przez 45 minut, aby ustabilizować temperaturę, wilgotność i dopływ powietrza. W celu utrzymania odpowiedniej wilgotności w komorze próbki należy umieścić kilka naczyń z wodą.
2. Umieść urządzenie z komórkami w komorze próbki mikroskopu i wycentruj je za pomocą mikropincety.
3. Ustaw ostrość, punkty pozycyjne oraz punkty czasowe w oprogramowaniu Biostation, a następnie rozpocznij sekwencjonowanie czasowe (time-lapse).

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykłady inspekcji wizualnej i charakterystyki migracji komórek nowotworowych przy użyciu kompartymentowego urządzenia mikroprzepływowego przedstawiono na rysunku 3 i rysunku 4. Zastosowana linia komórkowa to BTSC. Przy obecnej konfiguracji obrazowanie fazowe hodowli komórkowej może być rejestrowane w sposób ciągły przez okres do 5 dni (rysunek 3) z częstotliwością nawet co 2 sekundy (rysunek 4). Po 5 dniach konieczna jest wymiana pożywki w celu uzupełnienia składników odżywczych i usunięcia produktów przemiany materii. Nasz długoterminowy time-lapse pozwolił zidentyfikować powtarzającą się sekwencję sześciu etapów komórkowych podczas migracji, opartą na zmianach morfologicznych. Jak pokazano na rysunku 3, opisano je jako (i) przedmigracyjny, (ii) inicjację, (iii) eksplorację ścieżki, (iv) przemieszczanie się (cruising), (v) eksplorację celu oraz (vi) pomigracyjny. W komorze odbiorczej komórki wrzecionowate pozostają w etapie (i), podobnie jak w guzach litej tkanki, gdzie są zdolne do wzrostu, podziału i stopniowej migracji. W miarę zbliżania się do wlotu mikrokanału niektóre komórki przechodzą do etapu (ii), rozszerzając się i tworząc wypustki adhezyjne. Tylko jedna z nich jest w stanie zająć wlot i przejść do etapu (iii), w którym następuje eksploracja kierunku migracji. Gdy komórka ustali kierunek migracji, przechodzi do etapu (iv), aby przemieszczać się przez mikrokanał ze stałą, wysoką prędkością, co utrzymuje się przez cały odcinek kanału. Na końcu mikrokanału komórka przechodzi do etapu (v), aby eksplorować otwartą przestrzeń komory odbiorczej, a następnie do etapu (vi). W mikrokanale siła migracji jest generowana głównie przez aktywność blebbingową, jak pokazano na rysunku 4, podobnie jak w przypadku komórek ameboidalnych. Proces blebbingu komórkowego i deformacji błony został tutaj w pełni zarejestrowany.

Rysunek 1. Schematy wykonania urządzenia mikroprzepływowego. Cały proces przeprowadzono na 3-calowym waflu krzemowym (handle wafer) przy użyciu zmodyfikowanej techniki miękkiej litografii. Mikrokanały o wysokości 3 μm oraz markery wyrównujące zostały wykonane w pierwszej warstwie. Następnie naniesiono metodą spin-coatingu warstwę su-8 o grubości 250 μm, podczas gdy markery wyrównujące pokryto taśmą klejącą, aby były one później dostępne dla urządzenia do wyrównywania masek bez przeszkód w widoczności spowodowanych grubym fotorezystem. Dzięki temu elementy komory można było wykonać jako drugą warstwę i precyzyjnie wyrównać z pierwszą warstwą. Na koniec z otrzymanego wzorca odlewano stempel PDMS.

Rysunek 2. Schematy montażu urządzenia i procesu wysiewania komórek. Trzeciowymiarowa przestrzeń hodowlana, zamknięta przez PDMS i szklaną lamellkę, składa się z komór, zbiorników i mikrokanałów. Komora wysiewania jest wypełniona kulturą komórkową, natomiast komora odbiorcza jest początkowo wypełniona pożywką bez komórek. Mikrokanały łączące obie komory stanowią ścieżkę migracji komórek ze strony wysiewania do strony odbiorczej.

Rysunek 3. Migracja BTSC przez mikrokanał. Góra: ujęcia z filmu poklatkowego przedstawiają pojedynczą komórkę (zaznaczoną na zielono), która migruje na odległość ponad 400 μm ze strony siewnej do strony odbiorczej. Cała droga zajmuje około 2 dni i obejmuje sekwencję zmian morfologicznych komórki. Pasek skali wynosi 40 μm. Dół: schematyczna reprezentacja sześciu etapów migracji. Przed migracją (i): w komorze siewnej komórki o wrzecionowatym kształcie, zdolne do podziału, stopniowo migrują obok siebie. Komórki znajdujące się w pobliżu wejścia do mikrokanału konkurują ze sobą poprzez polaryzację ciała komórki i wysuwanie lamellipodiów. Inicjacja (ii): komórka migrująca o największej zdolności zajmuje wejście do kanału, podczas gdy jej konkurentki wycofują się. Eksploracja ścieżki (iii): komórka migrująca przechodzi w tryb ameboidalny z niewielką polaryzacją. Ten tryb migracji charakteryzuje się bardzo wysoką ruchliwością i zdolnością do eksploracji ścieżki we wszystkich kierunkach poprzez tworzenie małych wypustek błonowych (blebbing). Przemieszczanie się (iv): po ustaleniu ścieżki migracji komórka przechodzi w dostosowany tryb ameboidalny, utrzymując dodatkową dużą wypustkę skierowaną do przodu. W ten sposób komórka zachowuje wysoką ruchliwość oraz stały kierunek i prędkość. Eksploracja celu (v): u końca ścieżki komórka zwalnia i rozwija filopodia, aby przeszukać komorę odbiorczą w poszukiwaniu celu inwazji. Po migracji (vi): po wejściu do komory odbiorczej komórka przyjmuje kształt gwiazdowy i zachowuje wysoką ruchliwość, ale bez określonego kierunku.

Rysunek 4. Ujęcia z filmu poklatkowego przedstawiają cykl aktywności blebowania i deformacji błony BTSC: (A-B) inicjacja; (B-D) rozszerzanie; (D-F) retrakcja. Strzałki i linie krzywe reprezentują odpowiednio kierunek i miejsce deformacji błony. Ujęcia były gromadzone co 8 sekund.

Dyskusja

Przedstawione tutaj urządzenie mikroprzepływowe oraz technika rejestracji obrazu umożliwiają wizualną charakterystykę morfologii komórkowej podczas migracji. W porównaniu z istniejącymi konwencjonalnymi metodami, platforma mikroprzepływowa charakteryzuje się opłacalnością, wysoką przepustowością oraz elastycznością projektu. Przedstawiony system wizualizacji mikroskopowej pozwala na badanie i rejestrację długoterminowej migracji żywych komórek. Funkcja zmotoryzowanego obiektywu umożliwia śledzenie wielu ścieżek migracji z wysoką rozdzielczością obrazu bez zakłócania próbki.

Podczas montażu urządzenia stempel PDMS jest tymczasowo przytwierdzony do szkiełka podstawowego w celu ułatwienia powlekania PDL (krok 3.4). Osiągnięcie szczelnego połączenia jest kluczowe dla powodzenia tego protokołu. Zanieczyszczenia wprowadzone podczas produkcji urządzenia, takie jak pęcherzyki powietrza w stemplu lub kurz i drobiny na podłożu, mogą pogorszyć wiązanie i doprowadzić do wycieku płynu. Dlatego ważne jest obchodzenie się z urządzeniem w sposób zapobiegający zapyleniu, aby uniknąć awarii. Przed powlekaniem PDL szkiełka podstawowe są traktowane kwasem azotowym, a roztwór PDL jest wirowany w celu usunięcia kurzu i drobin. W przypadku braku dostępu do pomieszczenia czystego bardzo pomocne w usuwaniu kurzu i drobin ze stempla PDMS są taśma klejąca, płukanie alkoholem oraz kąpiel wodna. Po zetknięciu stempla PDMS ze szkiełkiem podstawowym delikatne opukiwanie stempla pęsetą ułatwia uszczelnienie.

Komórki macierzyste guza mózgu (BTSCs) można wzbogacić z próbek pobranych podczas operacji u ludzi poprzez hodowlę sfer w medium dla komórek macierzystych, analogicznie do hodowli prawidłowych neuralnych komórek macierzystych¹⁰. BTSCs wzbogacone w ten sposób wykazują właściwości typowe dla komórek macierzystych, takie jak ekspresja markerów komórek macierzystych (CD133, nestyna), różnicowanie w kierunku wielu linii neuralnych (glejowej i neuronalnej) oraz zdolność do inicjowania nowotworu w ortotopowym modelu mysim z niedoborem odporności przy użyciu zaledwie 100 komórek¹⁸. Mimo że istnieją pewne kontrowersje dotyczące oczyszczania i utrzymania BTSCs^{1, 19-21}, BTSCs hodowane w formie sfer lepiej zachowują fenotyp i genotyp guza rodzicielskiego^22-24.

Przegrodzona przestrzeń naśladuje środowisko fizjologiczne dla migracji komórek. W naszym urządzeniu BTSC wykazują silną zdolność do migracji przez przestrzeń o ograniczonej wielkości poprzez regulację morfologii komórkowej. Nasza charakterystyka zmian morfologicznych komórek wskazuje na transformacje trybów w sekwencji sześcioetapowej, która może stanowić nowy, szczegółowy opis procesu inwazji BTSC do sąsiednich obszarów mózgu. W początkowych etapach komórki zyskują znaczną polaryzację i generują wypustki adhezyjne, aby skutecznie zakotwiczyć się wewnątrz mikrokanału. Po ustaleniu obecności komórki w mikrokanale, przechodzi ona w tryb przelotowy i utrzymuje go przez całą drogę w mikrokanale. Na tym etapie BTSC zachowują wysoką ruchliwość i stały kierunek, jednocześnie oszczędzając energię. Co ciekawe, wydaje się, że jeden mikrokanał jest ograniczony do jednej komórki w trybie przelotowym w danym czasie, tak że gdy pojedyncza komórka przejdzie do tego etapu, pozostałe komórki wycofują się z mikrokanału. Mechanizm ten prawdopodobnie zapewnia efektywność rozprzestrzeniania się guza i zapobiega nadmiernemu zużyciu składników odżywczych w mikrokanale. Po zakończeniu migracji przez mikrokanał, komórka odzyskuje zdolność do tworzenia wypustek wielokierunkowych i dalszego poszukiwania celów inwazji lub nowych dróg migracji. Przegrodzone urządzenie mikrofluidyczne oferuje nową metodę in vitro tworzenia mikrośrodowiska do badania infiltracji miąższu mózgu przez BTSC.

Metodę tę można łatwo dostosować do badania komórek macierzystych nowotworu (CSC) oraz linii komórek migrujących pochodzących z innych typów guzów. Hodowlę komórek w urządzeniu mikrofluidycznym można przeprowadzić w każdym nowoczesnym laboratorium biologicznym wyposażonym w inkubator i zaplecze specjalistyczne w zakresie hodowli tkanek. Przy zastosowaniu matrycy su-8, odlewanie PDMS oraz montaż urządzenia są możliwe do wykonania po podstawowym przeszkoleniu w zakresie litografii miękkiej. Ponadto platformę tę można rozszerzyć o inne zastosowania poprzez integrację z dodatkowymi modułami funkcjonalnymi, takimi jak mieszalnik gradientowy, strukturyzacja powierzchni, kontrola przepływu cieczy oraz mikroelektrody.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco’zmodyfikowana pożywka Eagle (modified Eagle medium)’pożywka DMEM, wysoka zawartość glukozy	GIBCO, by Life Technologies	11965	Materiały do hodowli komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
Szynka’s F12	GIBCO, by Life Technologies	31765	Materiały do hodowli komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
suplement B27 bez witaminy A	GIBCO, by Life Technologies	12587-010	Materiały do hodowli macierzystych komórek glejaka (BTSC)
Antybiotykowo-antymykotyczny (PSA)	GIBCO, by Life Technologies	15240	Materiały do hodowli komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
Epidermal Growth Factor (EGF), ludzki rekombinowany	GIBCO, by Life Technologies	PHG0313	Materiały do hodowli macierzystych komórek nowotworu mózgu (BTSC)
podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), rekombinowany ludzki	GIBCO, by Life Technologies	PHG0021	Materiały do hodowli komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
Heparyna sodowa, z błony śluzowej jelit świni	Sigma-Aldrich	H1027-250KU	Materiały do hodowli komórek macierzystych glejaka (BTSC)
Laminina (naturalna mysia)	GIBCO, by Life Technologies	23017-015	Materiały do hodowli komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
Accutase	EMD Millipore	SCR005	Materiały do hodowli macierzystych komórek guza mózgu (BTSC)
Pożywka do komórek macierzystych			30% Hams F12 70% DMEM 1% antybiotyk-antymykotyk 2% B27 bez witaminy A EGF (20 ng/mL) i bFGF/heparyna (20 ng/mL bFGF, 5 mg/ml heparyny). Wymieszać składniki i przefiltrować sterylnie przed użyciem.
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)/Heparyna			Aliquot o stężeniu 20 μg/ml Dla 25 μg: Dodaj 1,25 ml heparyny o stężeniu 5 mg/ml do 25 μg bFGF. Dla 250 μg: Dodaj 1 ml heparyny o stężeniu 5 mg/ml do 250 μg bFGF. Przenieść do stożkowej probówki 15 ml i dodać 11,5 ml heparyny o stężeniu 5 mg/ml. Przechowywać w temperaturze 50°C μl lub 250 μalikwoty w temperaturze -80°C°C.
Epidermalny czynnik wzrostu (EGF)			<µl> Koncentracja alikwotu 20 μg/ml Dla 200 μg: Dodać 1 ml sterylnego DMEM (Gibco 11965-118) do 200 μg EGF. Przenieść do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i dodać 9 ml DMEM. Dla 500 μg: Dodaj 1 ml sterylnego DMEM (Gibco 11965-118) do 200 μg EGF. Przenieść do probówki stożkowej o pojemności 50 ml i dodać 24 ml DMEM. Przechowywać w temperaturze 50 μl lub 250 μalikwoty w temperaturze -80°C°C.
Heparyna			Stężenie alikwotu 5 mg/ml Odważyć 100 mg heparyny. Dodać 100 mg heparyny do 20 mL (70%)DMEM-(30%)F12-(1%)PSA (14 mL DMEM, 6 mL F12, 200 μL PSA) Filtr sterylny Przechowywać w temperaturze 50°C μl lub 250 μalikwoty w temp. -80°C°C
fotorezyst SU-8	MicroChem Corp.
Krzemowy podłoże nośny (wafer)	Materiały WRS	3P01-5SSP-INV
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan	Sigma-Aldrich	448931
PDMS Sylgard 184	Dow Corning
laminina	BD Biosciences		50 μg/ml w buforze PBS dla uzyskania stężenia końcowego
Biostation IM	Nikon Instruments