Ocena migracji nowotworowych komórek macierzystych przy użyciu kompartmentaryzujących urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Summary

Opisano urządzenie mikroprzepływowe do badania migracji nowotworowych komórek macierzystych. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co może prowadzić do skuteczniejszych przyszłych terapii.

Abstract

W ciągu ostatnich 40 lat Stany Zjednoczone zainwestowały ponad 200 miliardów dolarów w badania nad rakiem, co spowodowało tylko 5% spadek śmiertelności. Główną przeszkodą w poprawie wyników leczenia pacjentów jest słabe zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw migracji komórkowej związanej z agresywną inwazją komórek nowotworowych, przerzutami i opornością na leczenie¹. Glejak wielopostaciowy (GBM), najbardziej rozpowszechniony pierwotny złośliwy nowotwór mózgu^{u dorosłych 2}, jest przykładem tej trudności. Pomimo standardowej chirurgii, radioterapii i chemioterapii, mediana przeżycia pacjenta wynosi tylko piętnaście miesięcy, ze względu na agresywną infiltrację GBM do sąsiedniego mózgu i szybki nawrót raka². Interakcje nieprawidłowych mechanizmów migracji komórek i mikrośrodowiska guza prawdopodobnie różnicują raka od normalnych komórek³. W związku z tym udoskonalenie metod terapeutycznych w przypadku GBM wymaga lepszego zrozumienia mechanizmów migracji komórek nowotworowych. Ostatnie prace sugerują, że niewielka subpopulacja komórek w obrębie GBM, komórki macierzystej guza mózgu (BTSC), może być odpowiedzialna za oporność na leczenie i nawroty. Mechanizmy leżące u podstaw zdolności migracyjnej BTSC dopiero zaczynają być charakteryzowane^1,4.

Ze względu na ograniczenia w oględzinach i manipulacjach geometrycznych, konwencjonalne testy migracji⁵ są ograniczone do ilościowego określania całych populacji komórek. W przeciwieństwie do tego, urządzenia mikroprzepływowe umożliwiają analizę pojedynczych komórek ze względu na kompatybilność z nowoczesną mikroskopią i kontrolę nad mikrośrodowiskiem^6-9.

Prezentujemy metodę szczegółowej charakterystyki migracji BTSC za pomocą kompartmentów mikroprzepływowych urządzeń. Te urządzenia wykonane przez PDMS umieszczają środowisko hodowli tkankowej w trzech połączonych komorach: komorze wysiewającej, komorze odbiorczej i mikrokanalikach mostkowych. Dostosowaliśmy urządzenie w taki sposób, aby obie komory mieściły wystarczającą ilość mediów, aby obsłużyć żywotny BTSC przez 4-5 dni bez wymiany mediów. Wysoce mobilne BTSC początkowo wprowadzone do komory wysiewającej są izolowane po migracji przez mostkowanie mikrokanałów do równoległej komory odbiorczej. Ta migracja symuluje rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych przez przestrzenie śródmiąższowe mózgu. Obrazy morfologii komórek podczas migracji na żywo są rejestrowane przez kilka dni. Wysoce migrujące BTSC można zatem izolować, rekulturować i dalej analizować.

Mikrofluidyka może być wszechstronną platformą do badania zachowań migracyjnych BTSC i innych nowotworowych komórek macierzystych. Dzięki połączeniu generatorów gradientu, obsługi płynów, mikroelektrod i innych modułów mikroprzepływowych, urządzenia te mogą być również wykorzystywane do badań przesiewowych leków i diagnozowania chorób⁶. Izolacja agresywnej subpopulacji komórek migrujących umożliwi zbadanie mechanizmów molekularnych leżących u ich podstaw.

Protocol

1. Dysocjacja komórek BTSC

BTSC pochodzą z wcześniej istniejących kultur hodowanych na pożywce z komórek macierzystych bez surowicy jako neurosfery. których hodowla została wcześniej opisana^{10, 11}.

1. Przygotuj zawiesinę komórkową z neurosfer pochodzących z BTSC. Neurosfery pochodzące z BTSC zbiera się w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirowuje z prędkością 900 obr./min przez 5 minut. Szybsze wirowanie może spowodować ścinanie i/lub uszkodzenie neurosfer. Supernatant jest odsysany, a kultura neurosfery jest ponownie zawieszana w 0,5 ml wstępnie podgrzanego Accutase. Roztwór ten inkubuje się przez 5-10 minut w temperaturze 37°C, co pozwala na rozluźnienie neurosfer. Komórki są mechanicznie rozbijane za pomocą 10-20 delikatnych pociągnięć pipety P100, a następnie do komórek dodaje się 1,5 ml pożywki z komórek macierzystych w celu zneutralizowania Accutazy.
2. BTSC są następnie odwirowywane z prędkością 1300 obr./min przez 5 minut i ponownie zawieszane w 1 ml pożywki z komórek macierzystych.
3. Podwielokrotność 50 μl usuwa się z zawiesiny i umieszcza w probówce mikrowirówkowej w celu zliczenia komórek. Do probówki Eppendorfa dodaje się 50 μl błękitu trypanowego, a zawiesinę umieszcza się w hemocytometrze w celu zliczenia komórek.
4. Jeśli jest to wymagane po zliczeniu komórek, do zawiesiny BTSC dodaje się dodatkowe podłoże z komórek macierzystych, aby uzyskać gęstość komórek 20 000 żywych komórek/μl pożywki.

2. Wykonanie dwuwarstwowego wzorca su-8 i formowanie pieczęci PDMS (patrz rysunek 1)

Używamy litografii optycznej i miękkiej litografii do produkcji pieczęci su-8 master i PDMS, które są niezbędne do montażu urządzeń mikroprzepływowych. Nieco inaczej niż standardowa procedura¹², nasz su-8 master składa się z dwóch warstw. Mikrokanaliki o wysokości 3 μm są odlewane w pierwszej/dolnej warstwie na wcześniejszym etapie procesu, podczas gdy komory wysiewające i odbiorcze o wysokości 250 μm znajdują się w drugiej/górnej warstwie. Aby zapewnić prawidłowe połączenie między dwoma komorami hodowlanymi (mikrokanalikami i komorami), obie warstwy muszą być dokładnie wyrównane w odpowiedniej pozycji. Jednak grubość i nieprzezroczystość drugiej warstwy są wystarczająco duże, aby zablokować wyrównywacz referencyjny/optyczny przed dostępem do dolnych elementów. Tutaj projektujemy maski ze znacznikami odniesienia, które są zdalnie pozycjonowane. W ten sposób te markery w pierwszej warstwie mogą być selektywnie ekranowane podczas wirowania drugiej warstwy. W efekcie obie warstwy elementów są wykonane w jednym wzorcu i gotowe do formowania w płaskorzeźbie stempla PDMS.

1. Zaprojektuj i przygotuj dwie fotomaski. Jedna maska składa się z dwóch markerów odniesienia i szeregu mikrokanalików (o długości 400 μm i szerokości 10-50 μm) dla pierwszej warstwy. Kolejna maska składa się z komór wysiewających i odbiorczych (o długości 2 mm i szerokości 600 μm) dla drugiej warstwy. Obie maski zostały zaprojektowane w programie Illustrator (Adobe, Kalifornia), wydrukowane laserowo na foliach przezroczystych (Thin Metal Parts, Colorado), oczyszczone izopropanolem i wysuszone na powietrzu.
2. Wykonaj pierwszą warstwę za pomocą fotorezystu su-8 (MicroChem, Massachusetts) zgodnie z instrukcją produktu od dostawcy. Najpierw obrócić wafel uchwytu (WRS Materials, Kalifornia) fotorezystem su-8 (5) o grubości 3 μm, a następnie wypalić na miękko. Fotorezystor jest następnie naświetlany promieniami ultrafioletowymi i utwardzany odpowiednią maską w bliskim kontakcie, a następnie poddawany pieczeniu i wywoływaniu.
3. Drugą warstwę należy pokryć warstwą su-8 (2100) o grubości 250 μm. Aby zapobiec blokowaniu znaczników referencyjnych przez gruby fotorezystor z pierwszej warstwy, zakrywamy te obszary taśmą klejącą przed nałożeniem wirowania drugiej warstwy. Taśma jest następnie odklejana, aby odsłonić znaczniki w celu wyrównania.
4. Naświetlić UV drugą warstwę z drugą maską. Po ujawnieniu znaczników wyrównania można je łatwo wyrównać z tymi w drugiej masce za pomocą optycznego wyrównywania maski. Druga warstwa fotorezystu jest następnie naświetlana promieniowaniem ultrafioletowym i utwardzana w bliskim kontakcie, a następnie wypalana i wywoływana.
5. Powłoka antyadhezyjna powstałego mistrza. Aby pomóc w usuwaniu utwardzonego PDMS, su-8 master może być silanizowany poprzez osadzanie z fazy gazowej, aby powierzchnia pokryła się powłoką nieprzywierającą. Po prostu umieść go w eksykatorze na co najmniej godzinę, z kilkoma kroplami roztworu trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu w próżni.
6. Formuj PDMS za pomocą mistrza. Dokładnie wymieszaj bazę prepolimerową i utwardzacz PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) w proporcji 10:1. Umieść go w eksykatorze w celu odgazowania próżniowego, aż nie będzie widać pęcherzyków powietrza. Wlej mieszaninę na maskę i ponownie odgazuj, jeśli zostanie wprowadzony nowy pęcherzyk powietrza. Utwardź formę na równej płycie grzejnej przez 2 godziny w temperaturze 90 C. Po ostygnięciu do temperatury pokojowej delikatnie zwolnij stempel PDMS. W ten sposób kanały hodowlane są grawerowane w PDMS i gotowe do montażu urządzenia. Mistrz nadaje się do wielokrotnego użytku do formowania, dopóki nie zostanie pęknięty lub zużyty. Powłokę zapobiegającą przywieraniu należy wykonać ponownie, gdy lepkość odzyska lepkość.

3. Montaż urządzeń mikroprzepływowych i hodowla komórek (rysunek 2)

Aby hodować komórki, do szkiełka nakrywkowego dołącza się grawerowany stempel PDMS, który tworzy zamknięte kanały. Stworzone są wloty i wyloty do załadunku kultury/pożywki. Tymczasem czyszczenie i inne procedury na szklanym podłożu i stemplu PDMS są konieczne, aby zapewnić kompatybilność ogniw.

1. Wykonaj zbiorniki przez stempel PDMS za pomocą dziurkacza do biopsji. Wybieramy ich średnicę na 6 mm. Zbiorniki te służą dwóm celom. Jednym z nich jest przechowywanie dodatkowego składnika odżywczego do wzrostu komórek. Drugi służy do dostępu do ładowania pipet i zasysania próżniowego.
2. Namocz stempel PDMS w 70% etanolu na 30 minut, a następnie spłukuj go wodą dejonizowaną przez kolejne 10 minut. Celem jest usunięcie potencjalnych pozostałości organicznych wprowadzonych podczas procesu produkcyjnego oraz nieusieciowanych zanieczyszczeń PDMS. Bardziej intensywne i dokładne procesy czyszczenia, takie jak ekstrakcja organiczna¹³ i ekstrakcja Soxhleta¹⁴, były stosowane w innych miejscach. Stwierdziliśmy jednak, że w kulturze BTSC jest to niepotrzebne.
3. Wysterylizuj stempel PDMS w autoklawie (121°C, 35 min). Ten krok dodatkowo uzupełnia reakcję sieciowania PDMS. Począwszy od tego etapu, aż do kroku 3.6, wszystkie procedury są wykonywane w sposób sterylny.
4. Stempel PDMS jest następnie umieszczany na szklanym szkiełku nakrywkowym, które jest uprzednio pokryte poli-L-lizyną. ^15-17 Urządzenie jest następnie powlekane lamininą, wypełniając kanał roztworem lamininy przez noc w temperaturze 37°C. Laminina jest odsysana z urządzenia, a urządzenie jest myte pożywką z komórek macierzystych.
5. Zawieszenie ogniwa obciążnikowego z kroku 1 do zbiorników i kanałów. 11 μl zdysocjowanych komórek umieszcza się w jednym zbiorniku wysiewu. Aspiracja próżniowa służy do wtłaczania komórek do komory wysiewu, jeśli to konieczne. Dodatkowe 7 μl komórek umieszcza się w sąsiednim zbiorniku wysiewu. Uwaga: Średnia gęstość komórek wynosi 20 000 komórek/μl podłoża. Po pięciu minutach zbiorniki wysiewające i odbiorcze są zalewane mediami.
6. Umieść na wierzchu wstępnie autoklawizowany arkusz PDMS o grubości 0,5-1 mm. Naturalnie występująca adhezja powierzchniowa między dwoma fragmentami PDMS sprawi, że hodowla komórkowa będzie szczelna i gotowa do transportu, inkubacji i obrazowania mikroskopowego.

4. Długoterminowe obrazowanie poklatkowe migracji BTSC za pomocą BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, USA).

Łącząc kamerę, oprogramowanie i inkubator w jednym urządzeniu, ten mikroskopijny system umożliwia obrazowanie hodowli komórkowej bez zakłóceń przez wiele dni. Ponadto jego unikalna konstrukcja silnika porusza soczewką obiektywu i utrzymuje stolik próbki nieruchomo w funkcji wizyty punktowej. To sprawia, że praktyczne jest obrazowanie równoległych eksperymentów i śledzenie lokomocji komórek w testach wysokoprzepustowych.

1. Wstępnie wyrównaj Biostation IM przez 45 minut, aby ustabilizować temperaturę, wilgotność i dopływ powietrza. Dodanie kilku naczyń zawierających wodę w komorze na próbki służy do utrzymania odpowiedniej wilgotności.
2. Załaduj urządzenie zawierające komórkę do komory na próbkę mikroskopu i wyśrodkuj je za pomocą mikropęsety.
3. Ustaw ostrość, punkty pozycji i punkty czasowe w oprogramowaniu Biostation i rozpocznij tworzenie filmu poklatkowego.

5. Reprezentatywne wyniki:

Przykłady wizualnej kontroli i charakterystyki migracji komórek nowotworowych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego z podziałem na przedziały są zilustrowane na Rysunku 3 i Rysunku 4. Linia komórkowa to BTSC. Przy naszej obecnej konfiguracji obrazy fazowe hodowli komórkowej mogą być rejestrowane w sposób ciągły nawet przez 5 dni (ryc. 3) i tak często, jak co 2 sekundy (ryc. 4). Po upływie 5 dni należy wymienić pożywki hodowlane w celu uzupełnienia składników odżywczych i usunięcia odpadów. Nasz długoterminowy film poklatkowy identyfikuje obracającą się sekwencję sześciu etapów komórki podczas jej migracji na podstawie zmian morfologicznych. Jak pokazano na rysunku 3, opisujemy je jako (i) przed migracją, (ii) inicjację, (iii) eksplorację ścieżki, (iv) rejs, (v) poszukiwanie celu i (vi) po migracji. W komorze odbiorczej komórki w kształcie wrzeciona pozostają w stadium (i), jak w guzach masowych, które są zdolne do wzrostu, podziału i stopniowej migracji. Gdy zbliżają się do wejścia do mikrokanału, kilka komórek przechodzi do etapu (ii), w którym rozszerzają się i generują wypukłość kleju. Tylko jeden z nich jest w stanie zająć wejście i przejść do etapu (iii), który może badać kierunek migracji. Gdy komórka określi kierunek migracji, przechodzi do etapu (iv), aby przepłynąć przez mikrokanał ze stałą i dużą prędkością, który jest przenoszony przez cały mikrokanał. Na końcu mikrokanału komórka przechodzi do etapu (v) w celu zbadania otwartej przestrzeni komory odbiorczej, a następnie do etapu (vi). W mikrokanale moc migracyjna jest głównie generowana przez aktywność pęcherzyków, jak pokazano na rysunku 4, podobną do tej w komórkach ameboidalnych. Brzeszczenie komórek i deformacja błony są tutaj w pełni rejestrowane.

Rysunek 1. Schemat wykonania urządzenia mikroprzepływowego. Cały proces odbywa się na 3-calowej silikonowej płytce z uchwytem dzięki zmodyfikowanej technice miękkiej litografii. Mikrokanaliki i znaczniki wyrównania o wysokości 3 μm są wykonane jak w pierwszej warstwie. Następnie su-8 o grubości 250 μm jest powlekany wirowo, podczas gdy znaczniki wyrównania są pokryte taśmą klejącą, dzięki czemu mogą być później dostępne dla nakładki maski bez blokowania wzroku przez gruby fotorezyst. W ten sposób elementy komory mogą być wykonane jako druga warstwa i dokładnie wyrównane z pierwszą warstwą. Stempel PDMS jest ostatecznie formowany z powstałego wzorca.

Rysunek 2. Schematy montażu urządzenia i procesu wysiewu komórek. Zamknięta przez PDMS i szklane szkiełko nakrywkowe, przestrzeń hodowli 3D składa się z komór, zbiorników i mikrokanałów. Komora wysiewająca jest wypełniona kulturą komórkową, podczas gdy komora odbiorcza jest początkowo wypełniona pożywką bezkomórkową. Mikrokanaliki, które łączą się między nimi, zapewniają szlak migracji komórek od strony wysiewu do strony odbiorczej.

Rysunek 3. Migracja BTSC przez mikrokanał. Góra: zrzuty poklatkowe pokazują, że pojedyncza komórka (podświetlona na zielono) migruje ponad 400 μm od strony wysiewu do strony odbiorczej. Cała podróż trwa około 2 dni i obejmuje sekwencję zmian morfologicznych komórek. Podziałka wynosi 40 μm. U dołu: karykaturalne przedstawienie sześciu etapów migracji. Przed migracją (i): W komorze siewnej wrzecionowate i dzielące się komórki stopniowo migrują wzdłuż siebie. Komórki w pobliżu wejścia do mikrokanału ścigają się ze sobą, polaryzując ciało komórki i wywierając wypukłość blaszek. Inicjacja (ii): Komórka migracyjna o największej przepustowości zajmuje wejście do kanału, podczas gdy jej konkurenci wycofują się. Eksploracja ścieżki (iii): Komórka wędrowna przechodzi w tryb ameboidalny z niewielką polaryzacją. Ten tryb migracji jest niezwykle ruchliwy i zdolny do eksploracji ścieżki we wszystkich kierunkach, wypukując małe wypukłości błony. Rejs (iv): Po ustaleniu ścieżki migracji komórka przekształca się w przystosowany tryb ameboidalny, utrzymując dodatkowy duży występ skierowany do przodu. W ten sposób komórka utrzymuje wysoką ruchliwość, a także stały kierunek i prędkość. Eksploracja celu (v): Po zakończeniu ścieżki komórka zwalnia i rozwija filopodia, aby zbadać komorę odbiorczą w poszukiwaniu dowolnego celu inwazji. Po migracji (vi): Po wejściu do komory odbiorczej komórka zmienia się w gwiaździstą i zachowuje wysoką ruchliwość, ale bez określonego kierunku.

Rysunek 4. Migawki poklatkowe pokazują cykl aktywności pęcherzyków i deformacji błony BTSC: (A-B). wprowadzenie; (B-D). Ekspansja; (D-F). Wycofanie. Strzałki i linie krzywych reprezentują odpowiednio kierunek i położenie deformacji membrany. Migawki są zbierane co 8 sekund.

Discussion

Zaprezentowane tu urządzenie mikroprzepływowe i technika zapisu obrazu umożliwiają wizualną charakterystykę morfologii komórek podczas migracji. W porównaniu z istniejącymi metodami konwencjonalnymi, platforma mikroprzepływowa charakteryzuje się ekonomicznością, wysoką przepustowością i elastycznością projektowania. Prezentowany system wizualizacji mikroskopowej pozwala na badanie i rejestrację długotrwałej migracji żywych komórek. Funkcja napędzana obiektywem umożliwia śledzenie wielu ścieżek migracji w wysokiej rozdzielczości obrazu bez zakłócania pracy próbki.

Podczas montażu urządzenia stempel PDMS jest nietrwale przyklejony do szkiełka nakrywkowego dla wygody powlekania PDL (krok 3.4). Kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu ma uzyskanie dobrego uszczelnienia. Zanieczyszczenia powstałe w wyniku produkcji urządzenia, takie jak pęcherzyki powietrza w stemplu lub kurz/zanieczyszczenia na podłożu, mogą zagrozić wiązaniu i spowodować wyciek płynu. Dlatego ważne jest, aby obchodzić się z urządzeniem w sposób bezpyłowy, aby zapobiec awarii. Przed nałożeniem powłoki PDL szkiełka nakrywkowe są poddawane działaniu kwasu azotowego, a roztwór PDL jest odwirowywany w celu wyeliminowania kurzu/zanieczyszczeń. Uważamy, że taśma klejąca, płukanie alkoholem i kąpiel wodna są bardzo pomocne w usuwaniu kurzu/zanieczyszczeń ze stempla PDMS, jeśli czyste pomieszczenie nie jest dostępne. Po zetknięciu się stempla PDMS ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym, delikatne stuknięcie stempla pęsetą ułatwia uszczelnienie.

BTSC mogą być wzbogacane z próbek z ludzkich sal operacyjnych poprzez hodowlę sferyczną w pożywce z komórek macierzystych, podobnie jak hodowla normalnych nerwowych komórek macierzystych¹⁰. Wzbogacone w ten sposób BTSC wykazują właściwości podobne do komórek macierzystych, takie jak ekspresja markerów komórek macierzystych (CD133, nestyna), różnicowanie do wielu linii nerwowych (glejowych i neuronalnych) oraz inicjacja guza w ortotopowym modelu myszy z niedoborem odporności z zaledwie^{100 komórkami 18}. Chociaż istnieje pewna debata na temat oczyszczania i utrzymania BTSC^{1, 19-21}, BTSC hodowane w kuli lepiej utrzymują fenotyp i genotyp guza rodzicielskiego^22-24.

Podzielona na przedziały przestrzeń naśladuje fizjologiczne środowisko migracji komórek. W naszym urządzeniu BTSC wykazują silną zdolność migracji przez przestrzeń o ograniczonej wielkości poprzez regulację morfologii komórek. Nasza charakterystyka zmian morfologicznych komórki wskazuje na transformacje modów w sześcioetapowej sekwencji, która może modelować możliwy nowy szczegółowy opis inwazji BTSC na sąsiedni mózg. We wczesnych stadiach komórki uzyskują znaczną polaryzację i generują wypukłości adhezyjne, aby skutecznie zakotwiczyć się w mikrokanale. Po ustaleniu zajętości komórki w mikrokanale przełącza się on w tryb rejsowy i utrzymuje ten tryb przez całą podróż przez mikrokanał. Na tym etapie BTSC utrzymują wysoką ruchliwość i stały kierunek, ale oszczędzają energię. Co ciekawe, wydaje się, że jeden mikrokanał jest ograniczony do jednej komórki krążącej na raz, tak że gdy pojedyncza komórka przechodzi do tego etapu, inne komórki wycofują się z mikrokanału. Mechanizm ten prawdopodobnie zapewnia skuteczność rozprzestrzeniania się guza i zapobiega nadmiernemu zużyciu składników odżywczych w mikrokanalikach. Po zakończeniu migracji przez mikrokanał komórka odzyskuje skłonność do wielokierunkowych wypukłości i dalszej eksploracji w poszukiwaniu celów inwazji lub nowych ścieżek migracji. Mikroprzepływowe urządzenie z podziałem na przedziały oferuje nowatorski sposób tworzenia in vitro mikrośrodowiska do badania infiltracji miąższu mózgu przez BTSC.

Metodę tę można łatwo dostosować do badania nowotworowych komórek macierzystych (CSC) i migrujących linii komórkowych pochodzących z innych typów nowotworów. Hodowla komórek w urządzeniu mikroprzepływowym może być wykonywana w każdym nowoczesnym laboratorium biologicznym, które jest wyposażone w inkubator i specjalistyczną wiedzę z zakresu kultur tkankowych. Wyposażony w wzorzec su-8, odlewanie PDMS i montaż urządzeń są możliwe po podstawowym przeszkoleniu w miękkiej litografii. Ponadto platforma ta może być również rozszerzona o inne zastosowania poprzez integrację innych modułów funkcjonalnych, takich jak mieszalnik gradientów, wzór powierzchni, kontrola płynów i mikroelektroda.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s zmodyfikowany orzeł" s medium (DMEM), wysoki poziom glukozy	GIBCO, firmy Life Technologies	11965	Hodowla komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) dostarcza
szynkę" s F12	GIBCO, firmy Life Technologies	31765	Hodowla komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) dostarcza
suplement B27 bez witaminy A	GIBCO, firmy Life Technologies	12587-010	Hodowla komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) dostarcza
antybiotykowo-przeciwgrzybiczą (PSA)	GIBCO, firmy Life Technologies	15240	Hodowla komórek macierzystych guza mózgu (BTSC)
dostarcza naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), rekombinowany	ludzkoGIBCO, firmy Life Technologies	PHG0313	Hodowla komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) dostarcza
podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), ludzki rekombinowany	GIBCO, firmy Life Technologies	PHG0021	Hodowla komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) dostarcza
sól sodową heparyny z błony śluzowej jelit świń	Sigma-Aldrich	H1027-250KU	Hodowla komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) dostarcza
Laminina (naturalna mysz)	GIBCO, firmy Life Technologies	23017-015	Hodowla komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) dostarcza
Accutase	EMD Millipore	SCR005	Hodowla komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) dostarcza
pożywkę			30 % Szynki F12 70% DMEM 1% antybiotyk-przeciwgrzybiczny 2% B27 bez witaminy A EGF (20 ng/mL) i bFGF/ heparyna (20 ng/ml bFGF, 5 mg/ml heparyny) Wymieszaj składniki i sterylny filtr przed użyciem
Zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)/ Heparyna			Aliquot stężenie 20 μ g/ml Dla 25 μ g: Dodaj 1,25 ml 5 mg/ml heparyny do 25 μ g bFGF. Dla 250 #x03BC; g: Dodaj 1 ml 5 mg/ml heparyny do 250 μ g bFGF. Przenieść do 15 ml stożkowego i dodać 11,5 ml 5 mg/ml heparyny do stożkowego. Przechowywać jako 50 μ l lub 250 μ l podwielokrotności w stężeniu -80°C.
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)			Stężenie 20 μ g / ml< / li> Dla 200 μ g: Dodaj 1 ml sterylnego DMEM (Gibco 11965-118) do 200 μ g EGF. Przenieść do 15 ml stożkowego i dodać 9 ml DMEM. Dla 500 μ g: Dodaj 1 ml sterylnego DMEM (Gibco 11965-118) do 200 μ g EGF. Przenieść do 50 ml stożkowego i dodać 24 ml DMEM. Przechowywać jako 50 μ l lub 250 μ l podwielokrotności w temperaturze -80°C.
Heparyna			Stężenie podwielokrotności 5 mg/ml Odważyć 100 mg heparyny. Dodaj 100 mg heparyny do 20 ml (70%)DMEM-(30%)F12-(1%)PSA (14 ml DMEM, 6 ml F12, 200 μ L PSA) < / li> Sterylny filtr Przechowywać jako 50 μ l lub 250 μ l podwielokrotności przy -80° C
su-8 fotorezystor	MicroChem Corp.
Wafel	silikonowy WRS Materiały	3P01-5SSP-INV
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan	Sigma-Aldrich	448931
PDMS Sylgard 184	Dow Corning
laminina	BD Biosciences		50 μ g/ml w buforze PBS dla stężenia końcowego
Biostacja IM	Nikon Instruments