Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas aplikacji impulsów elektrycznych poprawia transfer genów plazmidowych in vitro

Podsumowanie

Transfekcja genów poprzez elektroporację ulega poprawie około dwukrotnej, gdy orientacja pola elektrycznego ulega zmianie podczas aplikacji impulsu, podczas gdy żywotność komórek nie zostaje naruszona. Wzrost wydajności transfekcji genów jest spowodowany zwiększeniem powierzchni błony, która staje się kompetentna do wnikania DNA do wnętrza komórki.

Streszczenie

Elektrotransfer genów to fizyczna metoda dostarczania genów do komórek poprzez zastosowanie krótkich i intensywnych impulsów elektrycznych, które powodują destabilizację błony komórkowej, czyniąc ją przepuszczalną dla małych cząsteczek i umożliwiając transfer dużych cząsteczek, takich jak DNA. Stanowi ona alternatywę dla wektorów wirusowych ze względu na swoje bezpieczeństwo, skuteczność i łatwość zastosowania. W elektrotransferze genów stosuje się różne protokoły impulsów elektrycznych w celu osiągnięcia maksymalnej transfekcji genów, z których jednym jest zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas podawania impulsów. Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego zwiększa obszar błony kompetentny dla wniknięcia DNA do komórki. W tym filmie demonstrujemy różnicę w skuteczności elektrotransferu genów w sytuacji, gdy wszystkie impulsy są podawane w tym samym kierunku, oraz gdy impulsy są podawane poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego. W tym celu wykorzystano końcówkę z zintegrowanymi elektrodami oraz prototypowy generator wysokiego napięcia, który umożliwia zmianę kierunku pola elektrycznego podczas aplikacji impulsu elektrycznego. Skuteczność elektrotransferu genów jest określana 24h po zastosowaniu impulsu jako liczba komórek wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego podzielona przez całkowitą liczbę komórek. Wyniki pokazują, że transfekcja genów zwiększa się, gdy orientacja pola elektrycznego podczas podawania impulsu elektrycznego ulega zmianie.

Protokół

1. Hodowla komórek, przygotowanie plazmidu i buforów do eksperymentu

1. W tym doświadczeniu wykorzystano komórki jajnika chomika syryjskiego (CHO-K1). Komórki hodowano w pożywce HAM-F12 (PAA) uzupełnionej o 2 mM L-glutaminy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 400 µl/l gentamycyny (wszystkie od Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Niemcy) oraz 1 ml/l krystacyliny (Pliva, Zagrzeb, Chorwacja). Komórki inkubowano przez 24 h w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂ w wilgotnej komorze inkubatora.
2. Plazmid pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA) kodujący zielone białko fluorescencyjne (GFP) namnożono w szczepie Escherichia coli DH5α, a następnie wyizolowano go za pomocą zestawu HiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Stężenie DNA plazmidowego (plazmid rozpuszczony w buforze TE) należy oznaczyć spektrofotometrycznie przy 260 nm i potwierdzić za pomocą elektroforezy w żelu.
3. Przygotować izoosmolarny bufor fosforanowy (10 mM Na₂HPO₄, 10 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂, 250 mM sacharozy, pH 7.4).
4. W dniu doświadczenia przygotować zawiesinę komórkową poprzez trypsynizację z użyciem 0,25% roztworu trypsyny/EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Niemcy). Komórki wirować przez 5 min przy 1000 rpm (180 x g) w temperaturze 4°C (Sigma, Niemcy), a osad komórkowy resuspenderować w izoosmolarnym buforze fosforanowym do gęstości 5 × 10⁶ komórek/ml.

2. Wyposażenie sprzętowe

1. Komórki poddawane są działaniu pola elektrycznego w końcówce pipety (Rysunek 1) z zintegrowanymi elektrodami podłączonymi do prototypowego generatora wysokiego napięcia. Geometria końcówki i elektrod umożliwia zastosowanie względnie jednorodnego pola elektrycznego, a generator pozwala na dostarczanie impulsów elektrycznych w różnych kierunkach. Końcówka oraz generator zostały opracowane w Laboratorium Biocybernetyki na Wydziale Inżynierii Elektrycznej Uniwersytetu w Lublani ¹.

Rycina 1. Przekrój pionowy i poziomy (a) oraz fotografia (b) końcówki pipety z zintegrowanymi elektrodami. Na przekroju kolor szary oznacza plastikową obudowę, a czarny elektrody. Końcówka pipety z zintegrowanymi elektrodami składa się z czterech cylindrycznych elektrod prętowych. Elektrody wykonane są ze stali nierdzewnej; ich średnica wynosi 1,4 mm, odległość między elektrodami sąsiednimi to 1 mm, a między elektrodami przeciwległymi 2 mm. Elektrody są wklejone równolegle do plastikowej końcówki, a ich długość czynna wynosi 30 mm ².

3. Protokół elektrotransferu genów

1. Dodaj plazmid pEGFP-N1 do zawiesiny komórkowej do uzyskania stężenia 10 μg/ml.
2. Inkubuj mieszaninę przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej przed zastosowaniem impulsów elektrycznych.
3. Pobierz 100 µl zawiesiny komórkowej do końcówki pipety z zintegrowanymi elektrodami.
4. Aby osiągnąć najwyższą wydajność elektrotransferu genów i zachować żywotność komórek, należy zastosować optymalne parametry impulsów elektrycznych. W tym doświadczeniu do każdej próbki przyłożono serię 8 impulsów prostokątnych (każdy o czasie trwania 1 ms i amplitudzie 225 V przy częstotliwości powtórzeń 1 Hz), korzystając z prototypowego generatora wysokiego napięcia. Zastosowano dwa różne protokoły pola elektrycznego (Rysunek 2): w pierwszym protokole wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, natomiast w drugim protokole impulsy są dostarczane poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego. Drugiego protokołu można używać wyłącznie z odpowiednim generatorem impulsów, który umożliwia aplikację impulsów elektrycznych w różnych kierunkach.
5. Niezwłocznie po aplikacji impulsów przenieś komórki z końcówki pipety do płytki 6-dołkowej i dodaj płodową surowicę bydlęcą (FCS-Sigma, USA) (25% objętości próbki).
6. Inkubuj komórki przez 5 min w temperaturze 37°C, aby umożliwić uszczelnienie błony komórkowej.
7. Dodaj 2 ml pożywki HAM-F12 do każdej próbki w dołku i inkubuj komórki przez 24 h w temperaturze 37°C w inkubatorze w nawilżonej atmosferze 5% CO₂.

Rycina 2. Protokoły pola elektrycznego: (a) wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, (b) impulsy są dostarczane poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego.

4. Akwizycja obrazów i określenie skuteczności elektrottransferu genów

1. Skuteczność elektroporacji genów określa się jako procent komórek wykazujących ekspresję GFP 24h po przyłożeniu impulsu.
2. Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (w naszym przypadku Zeiss 200, Axiovert, ZR Niemcy) ze światłem wzbudzenia o długości 488 nm generowanym przez system monochromatora (PolyChrome IV, Visitron, Niemcy), a emisję wykrywano przy 507 nm. Obrazy są rejestrowane za pomocą systemu obrazowania (system obrazowania MetaMorph, Visitron, Niemcy), ale można również użyć innego podobnego oprogramowania do akwizycji.
3. Należy pozyskać co najmniej pięć obrazów (kontrast fazowy i zielona fluorescencja) przy powiększeniu obiektywu 20x.
4. Należy policzyć komórki na obrazie w kontraście fazowym oraz komórki wykazujące ekspresję GFP na obrazie z zieloną fluorescencją. Procentową skuteczność elektroporacji genów wyznacza się poprzez podzielenie liczby komórek wykazujących ekspresję GFP przez całkowitą liczbę komórek w każdym odpowiadającym sobie obrazie (Rysunek 3).

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 3. Przedstawiono procent komórek wykazujących ekspresję GFP w przypadku, gdy wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, oraz gdy impulsy są dostarczane poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego. Komórki poddano serii ośmiu impulsów o amplitudzie 225 V, czasie trwania 1 ms i częstotliwości repetycji 1 Hz. Wyniki uzyskano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Każda wartość na wykresie reprezentuje średnią z trzech niezależnych eksperymentów ± odchylenie standardowe. Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego powoduje wzrost procentu komórek wykazujących ekspresję GFP.

Dyskusja

Elektrotransfer genów to wszechstronna technika biotechnologiczna, która umożliwia wprowadzanie DNA do komórek poprzez aplikację krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu ³ i stanowi bezpieczniejszą alternatywę dla wektorów wirusowych ze względu na swoje bezpieczeństwo, skuteczność i łatwość zastosowania. Chociaż obecnie elektrotransfer genów jest szeroko stosowany do transfekcji wszystkich typów komórek, a zgłoszono już pierwszą fazę I badań klinicznych z wykorzystaniem tej metody ⁴, mecha...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HAM-F12	Laboratoria PAA	E15-016	pożywka hodowlana
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
płodowa surowica bydlęca	Laboratoria PAA	A15-151
gentamycyna	Sigma-Aldrich	G1397	antybiotyk
krystalina	Pliva	625110	antybiotyk
pEGFP-N1	Clontech Laboratories	6085-1	plazmidowe DNA
Zestaw do maksymalnej izolacji plazmidów HiSpeed Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12662
Na2HPO4	Merck & Co., Inc.	F640786 933
NaH2PO4	TKI Hrastnik	0795
MgCl₂2	Sigma-Aldrich	M-8266
sacharoza	Sigma-Aldrich	16104
roztwór trypsyny/EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
końcówka do pipety	Wykonane na zamówienie
generator impulsów elektrycznych	Wykonany na zamówienie
płytka 6-dołkowa	Produkty z tworzyw sztucznych Techno	92406
probówka wirówkowa 15 ml	Produkty z tworzyw sztucznych Techno	91015
75 cm2 kolba hodowlana	Techno Plastic Products	90076