Transfekcja genów poprzez elektroporację ulega poprawie około dwukrotnej, gdy orientacja pola elektrycznego ulega zmianie podczas aplikacji impulsu, podczas gdy żywotność komórek nie zostaje naruszona. Wzrost wydajności transfekcji genów jest spowodowany zwiększeniem powierzchni błony, która staje się kompetentna do wnikania DNA do wnętrza komórki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas aplikacji impulsów elektrycznych poprawia transfer genów plazmidowych in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Elektrotransfer genów to fizyczna metoda dostarczania genów do komórek poprzez zastosowanie krótkich i intensywnych impulsów elektrycznych, które powodują destabilizację błony komórkowej, czyniąc ją przepuszczalną dla małych cząsteczek i umożliwiając transfer dużych cząsteczek, takich jak DNA. Stanowi ona alternatywę dla wektorów wirusowych ze względu na swoje bezpieczeństwo, skuteczność i łatwość zastosowania. W elektrotransferze genów stosuje się różne protokoły impulsów elektrycznych w celu osiągnięcia maksymalnej transfekcji genów, z których jednym jest zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego podczas podawania impulsów. Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego zwiększa obszar błony kompetentny dla wniknięcia DNA do komórki. W tym filmie demonstrujemy różnicę w skuteczności elektrotransferu genów w sytuacji, gdy wszystkie impulsy są podawane w tym samym kierunku, oraz gdy impulsy są podawane poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego. W tym celu wykorzystano końcówkę z zintegrowanymi elektrodami oraz prototypowy generator wysokiego napięcia, który umożliwia zmianę kierunku pola elektrycznego podczas aplikacji impulsu elektrycznego. Skuteczność elektrotransferu genów jest określana 24h po zastosowaniu impulsu jako liczba komórek wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego podzielona przez całkowitą liczbę komórek. Wyniki pokazują, że transfekcja genów zwiększa się, gdy orientacja pola elektrycznego podczas podawania impulsu elektrycznego ulega zmianie.
Protokół
1. Hodowla komórek, przygotowanie plazmidów i buforów do eksperymentu
- W tym doświadczeniu wykorzystano komórki jajnika chomika syryjskiego (CHO-K1). Komórki hodowano w pożywce HAM-F12 (PAA) uzupełnionej o 2 mM L-glutaminy, 10% płatowej surowicy bydlęcej, 400 µl/l gentamycyny (wszystko od Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Niemcy) oraz 1 ml/l krystacyliny (Pliva, Zagrzeb, Chorwacja). Komórki inkubowano przez 24h w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w inkubatorze.
- Namnożyć plazmid pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA) kodujący zielone białko fluorescencyjne (GFP) w szczepie Escherichia coli DH5α i wyizolować go za pomocą zestawu HiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Stężenie DNA plazmidowego (plazmid rozpuszczony w buforze TE) należy oznaczyć spektrofotometrycznie przy 260 nm i potwierdzić za pomocą elektroforezy żelowej.
- Przygotować izoosmolarny bufor fosforanowy (10 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 250 mM sacharozy, pH 7,4).
- W dniu eksperymentu przygotować zawiesinę komórkową poprzez trypsynizację z użyciem 0,25% roztworu trypsyny/EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Niemcy). Wirować komórki przez 5 min przy 1000 rpm (180 x g) w temperaturze 4°C (Sigma, Niemcy) i resuspender osad komórkowy w izoosmolarnym buforze fosforanowym do gęstości 5 × 106 komórek/ml.
2. Sprzęt sprzętowy
- Komórki są poddawane działaniu pola elektrycznego w końcówce pipety (Rysunek 1) z zintegrowanymi elektrodami podłączonymi do prototypowego generatora wysokiego napięcia. Geometria końcówki i elektrod umożliwia przyłożenie stosunkowo jednorodnego pola elektrycznego, a generator pozwala na dostarczenie impulsów elektrycznych w różnych kierunkach. Końcówka oraz generator zostały opracowane w Laboratorium Biocybernetyki na Wydziale Elektrotechniki Uniwersytetu w Lublanie 1.
Rysunek 1. Pionowy i poziomy (a) przekrój poprzeczny oraz fotografia (b) końcówki pipety z zintegrowanymi elektrodami. Na przekroju poprzecznym kolor szary oznacza obudowę plastikową, a czarny elektrody. Końcówka pipety z zintegrowanymi elektrodami składa się z czterech cylindrycznych elektrod prętowych. Elektrody wykonane są ze stali nierdzewnej; ich średnica wynosi 1.4 mm, sąsiednie elektrody są oddalone od siebie o 1 mm, a elektrody przeciwległe o 2 mm. Elektrody są wklejone do plastikowej końcówki równolegle, a ich długość robocza wynosi 30 mm 2.
3. Protokół elektrotransferu genów
- Dodaj plazmid pEGFP-N1 do zawiesiny komórkowej w stężeniu 10 μg/ml.
- Inkubuj mieszaninę przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej przed przyłożeniem impulsów elektrycznych.
- Odciągnij 100 µl zawiesiny komórkowej do końcówki pipety z zintegrowanymi elektrodami.
- Aby uzyskać najlepszą wydajność elektrototransferu genów i zachować żywotność komórek, należy zastosować optymalne parametry impulsów elektrycznych. W tym doświadczeniu do każdej próbki przyłożono serię 8 impulsów prostokątnych (każdy o czasie trwania 1 ms, amplitudzie 225 V i częstotliwości repetycji 1 Hz), używając prototypowego generatora wysokiego napięcia. Zastosowano dwa różne protokoły pola elektrycznego (Rysunek 2): w pierwszym protokole wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, natomiast w drugim impulsy są dostarczane poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego. Drugiego protokołu można użyć wyłącznie z odpowiednim generatorem impulsów, który umożliwia aplikację impulsów elektrycznych w różnych kierunkach.
- Bezpośrednio po przyłożeniu impulsów przenieś komórki z końcówki pipety do płytki 6-dołkowej i dodaj płodową surowicę cielęcą (FCS-Sigma, USA) (25% objętości próbki).
- Inkubuj komórki przez 5 min w temperaturze 37°C, aby umożliwić regenerację błony komórkowej.
- Dodaj 2 ml pożywki HAM-F12 do każdej próbki w dołku płytki i inkubuj komórki przez 24h w temperaturze 37°C w inkubatorze w nawilżonej atmosferze 5% CO2.
Rycina 2.Protokoły pola elektrycznego: (a) wszystkie impulsy są dostarczane w tym samym kierunku, (b) impulsy są dostarczane poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego.
4. Pozyskiwanie obrazów i określanie wydajności elektrootransferu genów
- Wydajność elektrottransferu genów określa się jako procent komórek wykazujących ekspresję GFP 24h po przyłożeniu impulsu.
- Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (w naszym przypadku Zeiss 200, Axiovert, ZR Niemcy) ze światłem wzbudzenia o długości fali 488 nm generowanym przez system monochromatora (PolyChrome IV, Visitron, Niemcy), a emisję wykrywa się przy 507 nm. Obrazy rejestruje się za pomocą systemu obrazowania (MetaMorph imaging system, Visitron, Niemcy), jednak można również zastosować inne podobne oprogramowanie do akwizycji.
- Należy pobrać co najmniej pięć obrazów (kontrast fazowy i fluorescencja zielona) przy 20-krotnym powiększeniu obiektywu.
- Należy policzyć komórki na obrazie w kontraście fazowym oraz komórki wykazujące ekspresję GFP na obrazie z fluorescencją zieloną. Procentową wydajność elektrottransferu genów wyznacza się, dzieląc liczbę komórek wykazujących ekspresję GFP przez całkowitą liczbę komórek na każdym odpowiednim obrazie (Rysunek 3).
5. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 3. Przedstawiono procent komórek wykazujących ekspresję GFP w przypadku dostarczenia wszystkich impulsów w tym samym kierunku oraz w przypadku dostarczenia impulsów poprzez naprzemienną zmianę kierunku i orientacji pola elektrycznego. Komórki poddano serii ośmiu impulsów o amplitudzie 225 V, czasie trwania 1 ms i częstotliwości powtórzeń 1 Hz. Wyniki uzyskano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Każda wartość na wykresie reprezentuje średnią z trzech niezależnych eksperymentów ± odchylenie standardowe. Zmiana kierunku i orientacji pola elektrycznego powoduje wzrost procentowego udziału komórek wykazujących ekspresję GFP.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Elektrotransfer genów to wszechstronna technika biotechnologiczna, która umożliwia wprowadzanie DNA do komórek poprzez aplikację krótkich impulsów elektrycznych o wysokim napięciu 3 i stanowi bezpieczniejszą alternatywę dla wektorów wirusowych ze względu na swoje bezpieczeństwo, skuteczność i łatwość zastosowania. Chociaż obecnie elektrotransfer genów jest szeroko stosowany do transfekcji wszystkich typów komórek, a zgłoszono już pierwszą fazę I badań klinicznych z wykorzystaniem tej metody 4, mecha...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana przez Słowiańską Agencję Badawczą (projekt J2-9770, centrum infrastrukturalne IP-0510 oraz program P2-0249). Ten film stanowi materiał uzupełniający do warsztatów naukowych i kursu podyplomowego „Electroporation-based Technologies and Treatments”, zorganizowanych przez Wydział Elektrotechniki Uniwersytetu w Lublanie w Słowenii. Autorzy dziękują również Duši Hodžič za uprzejme udostępnienie plazmidowego DNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| HAM-F12 | Laboratoria PAA | E15-016 | pożywka hodowlana |
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| płodowa surowica bydlęca | Laboratoria PAA | A15-151 | |
| gentamycyna | Sigma-Aldrich | G1397 | antybiotyk |
| krystalina | Pliva | 625110 | antybiotyk |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plazmidowe DNA |
| Zestaw do maksymalnej izolacji plazmidów HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl₂2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sacharoza | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| roztwór trypsyny/EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| końcówka do pipety | Wykonane na zamówienie | ||
| generator impulsów elektrycznych | Wykonany na zamówienie | ||
| płytka 6-dołkowa | Produkty z tworzyw sztucznych Techno | 92406 | |
| probówka wirówkowa 15 ml | Produkty z tworzyw sztucznych Techno | 91015 | |
| 75 cm2 kolba hodowlana | Techno Plastic Products | 90076 |
Bibliografia
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
