Artykuł metodologiczny

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

53.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3328

⸱

23 listopada 2011

 ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią lokalizację ekspresji mRNA i małych RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiego zakresu roślin i tkanek oraz może zostać ukończona w ciągu dziesięciu dni.

Streszczenie

Wraz z postępami w badaniach genomiki w ciągu ostatniej dekady, biologia roślin stała się obszarem licznych studiów prezentujących wielkoskalowe analizy ilościowe ekspresji genów. Metody mikromacierzy oraz sekwencjonowania następnej generacji są wykorzystywane do badania procesów rozwojowych, fizjologicznych i odpowiedzi na stres, analizowania szlaków epigenetycznych i małych RNA oraz budowania rozbudowanych sieci regulacji genów1-3. Chociaż techniki te umożliwiają jednoczesną analizę dużych zestawów genów, zazwyczaj oferują one bardzo ograniczoną rozdzielczość czasowo-przestrzenną zmian ekspresji genów. Ograniczenie to można częściowo zniwelować, stosując dowolną z tych metod profilowania w połączeniu z mikrosekcją laserową lub sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją4-7. Jednakże, aby w pełni zrozumieć biologiczną rolę genu, niezbędna jest wiedza o jego czasowo-przestrzennym wzorcu ekspresji na poziomie komórkowym. Szczególnie istotna może stać się szczegółowa analiza wzorca ekspresji genu podczas badania rozwoju, efektów bodźców środowiskowych lub mutantów. Na przykład subtelne różnice ilościowe w poziomach ekspresji kluczowych genów regulatorowych mogą prowadzić do drastycznych fenotypów, gdy wiążą się z utratą lub nabyciem ekspresji w specyficznych typach komórek.

Do szczegółowego badania wzorców ekspresji genów rutynowo stosuje się kilka metod. Jedną z nich jest analiza transgenicznych linii reporterowych. Taka analiza może jednak stać się czasochłonna w przypadku badania wielu genów lub pracy z roślinami opornymi na transformację. Ponadto zazwyczaj wymagana jest niezależna walidacja, aby upewnić się, że wzorzec ekspresji transgenu naśladuje wzorzec genu endogennego. Immunohistochemiczna lokalizacja białek lub hybrydyzacja mRNA in situ stanowią stosunkowo szybkie alternatywy dla bezpośredniej wizualizacji ekspresji genów w komórkach i tkankach. Ta druga metoda ma wyraźną zaletę w postaci możliwości łatwego zastosowania w odniesieniu do dowolnego genu zainteresowania. Hybrydyzacja in situ umożliwia wykrycie docelowych mRNA w komórkach poprzez hybrydyzację z znakowaną antysensowną sondą RNA, uzyskaną w drodze transkrypcji in vitro badanego genu.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół wysokoczułej i specyficznej lokalizacji ekspresji genów in situ w roślinach. Został on zoptymalizowany do stosowania w przypadku przekrojów utrwalonych paraformaldehydem i zatopionych w parafinie, co zapewnia doskonałą konserwację histologiczną, oraz sond znakowanych DIG, które są wizualizowane za pomocą immunodetekcji i kolorymetrycznej reakcji z fosfatazą alkaliczną. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany w wielu tkankach z szerokiego zakresu gatunków roślin i może być wykorzystywany do analizy ekspresji zarówno mRNA, jak i małych RNA8-14.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

Uwaga: Wszystkie etapy, aż do momentu hybrydyzacji włącznie, są wrażliwe na aktywność RNaz. Dlatego niezbędne jest zachowanie czystości podczas pracy. Powszechną praktyką jest przygotowywanie wszystkich roztworów w warunkach wolnych od RNaz poprzez stosowanie wody traktowanej DEPC oraz szkła wypalanego w temperaturze 180 °C przez co najmniej 3 h. Pojemniki plastikowe często oczyszcza się poprzez traktowanie 0,2 N NaOH przez 30 min. Żadna z tych środków ostrożności nie jest jednak niezbędna i zazwyczaj używamy zwykłej, czystej wody milliQ H2O do wszystkich roztworów. Przechowujemy oddzielne odczynniki, pudełka i szkło do hybrydyzacji in situ w czystej szafce.

  1. Fiksacja próbek
    1. Dzień 1: Przygotować świeży fiksator 4% paraformaldehydu (PFA). Aby otrzymać 500 ml, podgrzać 400 ml 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4 pH 7,0) do 60°C i rozpuścić dwa pellety NaOH. W dygestorium dodać 20 g paraformaldehydu i mieszać dokładnie do całkowitego rozpuszczenia. Umieścić roztwór w lodzie, a po ochłodzeniu dostosować pH do 7,2 za pomocą H2SO4 (1-2 krople na 100 ml). Następnie uzupełnić objętość do 500 mL za pomocą 1x PBS.
      Uwaga: Do regulacji pH nie należy używać HCl, ponieważ spowoduje to wydzielenie wysoce toksycznych oparów. Paraformaldehyd jest toksyczny, dlatego roztwór ten należy przygotowywać w dygestorium i utylizować w odpowiedni sposób. Paraformaldehyd przechowuje się w temperaturze 4°C i należy go kupować jako nowy co 6 - 9 miesięcy.
    2. Pobrać próbki tkanki i natychmiast umieścić je w 15 mL świeżego fiksatora PFA w lodzie, w szklanych fiolkach scyntylacyjnych. Jeśli wymagana jest dysekcja tkanki, najlepiej przeprowadzić ją w lodzie w zimnym fiksatorze.
      Uwaga: Ważne jest zastosowanie znacznej nadwyżki fiksatora. Ogólnie zalecany stosunek to 10 objętości fiksatora na 1 objętość tkanki.
    3. Próbki znajdujące się w lodzie poddać działaniu próżni (˜500 mm Hg). Utrzymywać próżnię przez 15-20 minut; z próbek powinny wydzielać się małe pęcherzyki, ale fiksator nie powinien zacząć wrzeć. Powoli zwolnić próżnię i wymienić fiksator PFA, aby zapewnić utrzymanie właściwego stężenia. Powtarzać ten krok, aż tkanki opadną na dno po zwolnieniu próżni.
      Uwaga: Fiksacja jest niezbędna do utrwalenia i sieciowania cząsteczek RNA w tkance. Krok ten jest krytyczny, ponieważ słabo utrwalone materiały dają niski sygnał. Niektóre tkanki nie opadają natychmiast, ale większość z nich opadnie w końcu w ciągu nocy. Aby poprawić infiltrację fiksatora, można dodać następujące detergenty: Triton do 0,1% i/lub Tween do 0,1 - 0,3%. Alternatywnie, w przypadku tkanek, które nie ulegają łatwej infiltracji, można zastosować fiksatory na bazie etanolu, takie jak formaldehyd-alkohol-kwas octowy (FAA)14,15.
    4. Jeszcze raz wymienić fiksator PFA i przechowywać fiolki w temperaturze 4°C przez noc.
  2. Zatapianie tkanek
    1. Dzień 2: Wstępnie schłodzić 1x PBS oraz serię etanolową do 4°C.
    2. Przepłukać próbki dwukrotnie przez 30 min każdorazowo w 1x PBS, w lodzie.
      Uwaga: Ponownie zaleca się zastosowanie znacznej nadwyżki każdego z roztworów.
    3. Odwodnić próbki, przeprowadzając je przez serię etanolową w lodzie w następujący sposób:
      • 10% etanol 30 min,
      • 30% etanol 30 min,
      • 50% etanol 1 godzina,
      • 70% etanol 1 godzina,
      • 85% etanol 1 godzina,
      • 95% etanol 1 godzina,
      • 3 wymiany 100% etanolu po 1 godzinie każda
    4. Na koniec dnia zastąpić etanol 0,1% eozyną w 100% etanolu i pozostawić przez noc w temperaturze 4°C. Eozyna barwi ścianę komórkową, czyniąc próbki bardziej widocznymi podczas zatapiania i sekcjonowania.
      Uwagi: Wskazane tutaj czasy zostały zoptymalizowane dla bloków o wymiarach 3x3x3 mm, jednak w przypadku większych próbek może być wymagana dłuższa inkubacja.
      Próbki można przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4°C przez kilka miesięcy.
    5. Dzień 3: Następnego ranka ogrzać próbki do temperatury pokojowej przez jedną godzinę. Następnie stopniowo zastępować etanol środkiem rozjaśniającym (histoclear) w następujący sposób:
      Schemat procesu rozjaśniania histologicznego, stosunki etanol/histoclear, wykaz przedziałów czasowych.
    6. Na koniec dnia dodać 1/4 objętości granulek Paraplast Plus i umieścić fiolkę w piecu w temperaturze 60°C. Napełnić również zlewkę granulkami Paraplast i często je uzupełniać, aby mieć zawsze pod ręką świeżo stopiony wosk.
      Uwaga: Temperatura pieca jest istotna; należy unikać przedłużonego ogrzewania Paraplastu powyżej 60°C.
    7. Dzień 4: Stopniowo zastępować histoclear Paraplastem, regularnie dodając więcej granulek parafiny (co godzinę). Na koniec dnia ostrożnie odlać mieszaninę histoclear/wosk i natychmiast zastąpić ją czystym stopionym woskiem. Pozostawić próbki w temperaturze 60°C przez noc.
    8. Dni 5 i 6: Wymieniać Paraplast 3 razy dziennie, mniej więcej co 4 godziny, na świeży stopiony wosk, utrzymując próbki w temperaturze 60°C.
      Uwaga: Możliwa jest wymiana wosku tylko raz dziennie, ale przygotowanie tkanki zajęłoby wówczas kilka dodatkowych dni, ponieważ wosk musi zostać wymieniony co najmniej 5 lub 6 razy. Infiltracja próbek tkankowych próżniowo, gdy znajdują się one w 100% EtOH i/lub w wosku, może dodatkowo poprawić infiltrację i zatopienie tkanek. Infiltracja próżniowa próbek w wosku powinna być przeprowadzana w temperaturze 60°C.
    9. Dzień 7: Wymienić wosk jeszcze raz. Zapach histoclearu powinien być już całkowicie usunięty, a próbki można zatopić w późniejszej części dnia.
    10. Przygotować dużą płytkę grzewczą ustawioną na 60°C i zabezpieczoną folią aluminiową.
    11. Metoda zatapiania będzie się różnić w zależności od rodzaju analizowanej tkanki. Najważniejszym punktem na tym etapie jest upewnienie się, że próbki są prawidłowo zorientowane pod kątem późniejszego sekcjonowania. Jednym ze sposobów jest użycie plastikowych form i pierścieni. Rozgrzać formy na płytce grzewczej i wlać stopiony wosk do dolnej części formy. Przenieść próbkę tkanki do formy za pomocą ogrzanej pęsety i ustawić ją w pożądanej pozycji. Nałożyć biały pierścień na formę i dodać dodatkowy stopiony wosk tak, aby tkanki zostały całkowicie przykryte. Ostrożnie przenieść formę z płytki na blat. Pozostawić wosk do stopniowego ostygnięcia.

Inną możliwością jest rozmieszczenie wszystkich próbek w szalce Petri zawierającej roztopiony wosk (próbki powinny być całkowicie przykryte woskiem) podczas pracy na płytce podgrzanej do 60°C. Próbki należy układać za pomocą ciepłej pęsety. Na koniec należy wyłączyć płytkę. Po zastygnięciu wosku szalkę Petri można przenieść na blat, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C. Gdy próbki będą gotowe do krojenia, małe bloki zawierające próbkę tkanki można wyciąć z szalki Petri za pomocą podgrzanego ostrza i zamocować w uchwycie mikrotomu, używając dodatkowej kropli roztopionego wosku. Przed przystąpieniem do krojenia należy pozostawić próbkę do stwardnienia na kilka minut.

Uwaga: Bloki można przechowywać w temperaturze 4°C przez 1 rok lub dłużej. Dodatkowe przydatne wskazówki dotyczące utrwalania i zatapiania tkanek znajdują się w ref. 16

2. Przygotowanie sondy

  1. Klonowanie
    Sondy projektuje się zazwyczaj przeciwko jednemu lub kilku specyficznym regionom interesującego genu. Z sondy należy wykluczyć sekwencje silnie powtarzalne, natomiast sekwencje odpowiadające konserwatywnym domenom białkowym, takim jak motywy wiążące DNA w czynnikach transkrypcyjnych, zazwyczaj pozwalają uzyskać specyficzne dla genu wzorce ekspresji.8,9,12,15 (Ryc. 1). Wynika to z faktu, że traktowanie RNazą A w krokach po hybrydyzacji (patrz poniżej) zmniejsza poziom hybrydyzacji krzyżowej sond między członkami rodziny genów. RNaza A przecina miejsce niedopasowań w dupleksach RNA, fragmentując sondy zhybrydyzowane z transkryptami o niepełnej komplementarności, które zostaną usunięte w kolejnych etapach przemywania.
    Zazwyczaj dla każdego badanego genu może być konieczne przetestowanie kilku sond. Sondy mogą mieć długość nawet 150 zasad. Choć nie ma ograniczeń co do długości sondy, fragmenty krótsze niż 1,5 kb zazwyczaj podlegają skuteczniejszej transkrypcji. Fragmenty DNA przeznaczone do transkrypcji klonuje się do wektora zawierającego promotory T3, T7 lub SP6 (np. pCRII-TOPO, Invitrogen). Alternatywnie sekwencje promotorów T3, T7 lub SP6 można wprowadzić jako ogon 5' w prawej primerze używanym do amplifikacji regionu sondy.
    W każdym in situ W eksperymencie z hybrydyzacją uwzględniamy sondę kontrolną pozytywną, której wzór hybrydyzacji jest znany i powtarzalny, a także kontrolę negatywną (Ryc. 1D i H). Ta ostatnia może być losową sondą RNA, o której wiadomo, że nie hybrydyzuje ona z żadnymi transkryptami w badanej tkance. Chociaż powszechne jest stosowanie sondy sensu genu poddanego analizie, nie jest to konieczne i do tego celu nadaje się jakikolwiek niehybrydyzujący RNA. Jeśli są dostępne, tkanki z transkrypcyjnego allela null badanego genu stanowiłyby doskonałą kontrolę negatywną.
  2. In vitro transkrypcja
    1. Zlinearyzuj plazmid, trawiąc około 5 μg DNA enzymem restrykcyjnym, który tnie na końcu wstawki po przeciwnej stronie niż miejsce położenia promotora. Nie należy stosować enzymów restrykcyjnych pozostawiających nadwieszenie 3'. Może to prowadzić do powstania artefaktów transkrypcyjnych, ponieważ polimeraza może wykorzystać nadwieszenie 3' jako substrat do kontynuacji transkrypcji. Alternatywnie, region sondy zawierający promotor T3, T7 lub SP6 można namnożyć metodą PCR, aby uzyskać matrycę DNA do reakcji transkrypcji in vitro.
    2. Należy sprawdzić alikwot na żelu, aby potwierdzić, że reakcja dobiegła końca.
    3. Wyekstrahować DNA za pomocą fenolu i chloroformu, wytrącić etanolem, a następnie rozpuścić osad DNA w wodzie milliQ.2do uzyskania stężenia 1 μg/μl. Alternatywnie DNA można oczyścić przy użyciu standardowych kolumien do oczyszczania DNA.
    4. Przygotuj in vitro reakcja transkrypcji poprzez mieszanie:
      • 1 μl oczyszczonego DNA (1 μg/μl)
      • 2 μl 10x buforu do transkrypcji
      • 2 μL 10x mieszanina do znakowania RNA DIG
      • 1 μl RNAse OUT
      • 2 μl polimerazy RNA T3, T7 lub SP6 (20 U/μl)
      • H2O do 20 μl.

      Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 do 2 godzin. Odstawić 1 μl do późniejszej analizy w żelu.
      Uwaga: W układach zwierzęcych preferowane są sondy znakowane fluorescencyjnie, jednak ze względu na wysoką autofluorescencję większości tkanek roślinnych, In situ protokoły hybrydyzacji dla roślin z wykorzystaniem sond znakowanych radioaktywnie17 lub częściej sondy znakowane DIG, które wykrywa się za pomocą immunohistochemii.
    5. Usuń matrycę DNA, dodając 75 μL wody MilliQ2oraz 5 μL RQ1 DNAse (1 U/μl) do mieszaniny reakcyjnej transkrypcji i inkubowanie reakcji w temperaturze 37°C przez 10 min.
    6. Oczyścić in vitro reakcji transkrypcji w celu usunięcia nieinkorporowanych nukleotydów i krótkich transkryptów. Jedną z możliwości jest zastosowanie kolumny Sephadex® do chromatografii wykluczania żelowego, np. kolumn mini Quick Spin RNA Columns (Roche). Alternatywnie, produkt reakcji transkrypcji można oczyścić za pomocą konwencjonalnego wytrącania LiCl/etanolem (patrz ref. 14). Należy zachować 1 μl w celu późniejszej kontroli na żelu.
    7. Sondy o długości przekraczającej 250 zasad są zazwyczaj częściowo hydrolizowane w celu uzyskania cząsteczek RNA o długości około 150 nt, co pozwala im na efekwentne przenikanie przez skrawki tkanek. Należy dodać równą objętość 2x buforu węglanowego (80 mM NaHCO3, 120 mM Na2CO3) do oczyszczonej reakcji transkrypcji i inkubować w temperaturze 60°C. Czas inkubacji należy obliczyć według następującego wzoru:
      czas = (Li - Lf) / (K x Li x Lf)
      gdzie Li = początkowa długość sondy (w kb); Lf = końcowa długość sondy (0,150 kb); K = 0,11 kb/minutę. Zachować 2 μL do kontroli na żelu.
    8. Zneutralizuj reakcję hydrolizy, dodając 1/20 objętości 10% kwasu octowego.
    9. Sondę oczyszcza się poprzez dodanie 1 μl tRNA (100 mg/ml), 1/10 objętości 3M NaAc o pH 5,2 oraz 2,5 objętości zimnego 100% etanolu, a następnie inkubację w temperaturze -80°C przez 30 min. RNA wytrąca się poprzez wirowanie przy 13 500 obr./min przez 20 min w temperaturze 4°C. Po odlaniu supernatantu osad RNA płucze się 500 μl 70% etanolu. Następnie ponownie wiruje się próbkę, pozostawiając osad do wyschnięcia na powietrzu (zazwyczaj około 15 min), a RNA resuspensuje w 50 μl 50% dejonizowanej formamidu. Sondę należy przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.
    10. Produkty końcowe, a także produkty pośrednie z sekcji 2.2.4, 2.2.6 i 2.2.7, należy sprawdzić na standardowym 1% żelu agarozowym w buforze TAE (Rysunek 2A). Pozwala to na monitorowanie wydajności procesu in vitro reakcja transkrypcji
      Uwaga: in vitro reakcja transkrypcji powinna przynieść około 1 μg RNA na 1 μg matrycy.
  3. Analiza dot blot
    Stężenie sondy oraz stopień wbudowania DIG-UTP można ocenić za pomocą analizy dot blot (rycina 2B). Seryjne rozcieńczenia RNA nanosi się kropelkowo na standardową membranę do hybrydyzacji obok znakowanego kontrolnego RNA o znanym stężeniu. Przykładowo, stosujemy znakowaną DIG-UTP kontrolną sondę RNA dołączoną do in vitro zestaw do transkrypcji (Roche). W celu ustalenia dokładnego stężenia zaleca się przetestowanie kilku rozcieńczeń dla każdej sondy.
    1. Przygotować bufor blokujący, rozpuszczając 0,5% odczynnika blokującego (Blocking Reagent) w buforze 1x TBS (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) w temperaturze 70°C, a następnie pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    2. Nanieś 1 μl rozcieńczeń seryjnych (zazwyczaj 10-1 do 10-5) z in vitro sondy transkrybowane i kontrolne na membranie nylonowej N+. Utkwić RNA poprzez sieciowanie promieniami UV.
      Uwaga: Należy użyć minimalnej powierzchni membrany, aby zmniejszyć objętość buforów potrzebnych w dalszej części procedury.
    3. Równoważyć membranę w 1x TBS przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT) na platformie wytrząsającej.
    4. Zablokować membranę, używając buforu blokującego, przez 30 min w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsowej.
    5. Przepłucz membranę w 1x TBS przez 5 min.
    6. Inkubować membranę z przeciwciałem anty-DIG, rozcieńczając 1 μl przeciwciała anty-digoksygenina-AP w 10 ml 1x TBS, przez 45 min w temperaturze pokojowej.
    7. Przemyj membranę dwukrotnie w 1x TBS po 15 min każde z prań.
    8. Równoważyć membranę w buforze 1x TN (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl) przez 5 min.
    9. Barwić membranę poprzez inkubację z NBT/BCIP w stężeniu 1/50 (v/v) w 1x buforze TN. Barwienie może trwać od 5 do 10 min. Następnie opłukać membranę wodą; można ją potem wysuszyć i zachować jako dokumentację.
      Uwaga: NBT/BCIP jest substratem dla fosfatazy alkalicznej sprzężonej z przeciwciałem anty-DIG, który w wyniku hydrolizy tworzy ciemnoniebieski barwnik.

3. Krojenie na sekcje

  1. Ogrzać bloki do temperatury pokojowej. Jeśli bloki będą zbyt zimne, poszczególne skrawki mogą zwijać się, nie tworząc woskowej „wstęgi”. Przyciąć blok do kształtu trapezu, pozostawiając około 1mm wosku wokół próbki.
  2. Rozgrzać duży podgrzewacz do szkiełek w temperaturze 35-37°C.
    Uwaga: W wielu protokołach ten etap wykonuje się w temperaturze 42°C, jednak obniżenie temperatury do 35-37°C zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza pod skrawkami.
  3. Umieścić blok w mikrotomie tak, aby dłuższa z dwóch równoległych ścian znajdowała się na dole. Ostrożnie przesunąć blok w stronę noża i upewnić się, że powierzchnia bloku jest równoległa do noża. Wykonać skrawki o grubości 8 - 10μm. Wstęgi woskowe można ułożyć na nieprzylegającej powierzchni, takiej jak folia aluminiowa lub papier filtracyjny, aby wybrać interesujące skrawki. Można to ocenić za pomocą znajdującego się w pobliżu mikroskopu stereoskopowego.
    Uwaga: Barwienie tkanki eozyną daje wskazówkę, czy tkanki zostały prawidłowo zinfiltrowane podczas zatapiania. Jeśli środek bloku nie jest zabarwiony eozyną, zazwyczaj oznacza to, że tkanka jest słabo utrwalona.
  4. Oznaczyć szkiełka Probe-on Plus ołówkiem (większość długopisów lub markerów zostaje usunięta podczas protokołu hybrydyzacji in situ) i nanieść na nie 1mL czystej wody milliQ H2O. Ostrożnie umieścić interesujące skrawki na powierzchni wody w temperaturze pokojowej (manipulowanie skrawkami na wodzie jest łatwiejsze w temperaturze pokojowej). Upewnić się, że strona błyszcząca (strona dolna, gdy wstęga schodzi z mikrotomu) jest skierowana w stronę wody. Następnie powoli przenieść szkiełko na podgrzewacz. Podgrzewanie pomaga skrawkom rozprzestrzenić się na powierzchni wody. Po 5 min ostrożnie, ale jednym płynnym ruchem, odlać wodę, tak aby wstęga opadła na szkiełko. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia przez co najmniej kilka godzin lub przez noc w temperaturze 37°C, aby tkanka przylgnęła.
    Uwaga: Pocięte tkanki można przechowywać w pudełku z osuszaczem z krzemionką przez kilka dni lub tygodni w temperaturze 4°C, jednak najlepiej użyć szkiełek jak najszybciej.

4. Hybrydyzacja in situ

  1. Obróbka wstępna skrawków
    Objętość wymagana dla każdego roztworu będzie oczywiście zależeć od liczby szkiełek do obróbki oraz rozmiaru użytego pojemnika. Skrawki powinny być zawsze całkowicie zanurzone. Dla kasetki na 25 szkiełek i dopasowanego pojemnika wystarczające jest 200-250 ml. Ponieważ wiele etapów inkubacji jest bardzo krótkich, zwykle przygotowujemy najpierw wszystkie możliwe roztwory, a następnie rozpoczynamy obróbkę wstępną szkiełek. Jednak roztwór bezwodnika octowego należy przygotować bezpośrednio przed użyciem, a proteazę dodaje się w momencie stosowania. Wszystkie etapy wykonuje się w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Ponadto wszystkie bufory można przygotować w stężeniu 10x jako roztwór zapasowy.
    1. Podgrzać bufor do proteazy (100 mM Tris pH 8.0, 50 mM EDTA) w pojemniku do 37°C.
    2. Odparafinizować i rehydratować skrawki tkanek w następujący sposób:
      • histoclear - 10 min (użyć naczynia szklanego)
      • histoclear - 10 min (użyć naczynia szklanego)
      • 100% etanol - 1 min
      • 100% etanol - 30 s
      • 95% etanol - 30 s
      • 85% etanol - 30 s
      • 70% etanol - 30 s
      • 50% etanol - 30 s
      • 30% etanol - 30 s
      • 10% etanol - 30 s
      • milliQ H2O - 1 min
    3. Inkubować w 1x PBS przez 2 min.
    4. Wymieszać 625μl proteazy (50mg/ml) w 250 ml buforu do proteazy podgrzanego do 37°C i inkubować szkiełka przez 20 min w 37°C.
      Uwaga: Proteaza jest niezbędna do strawienia utrwalonych białek i zwiększenia dostępności sond do komórkowych RNA. Krytyczna jest kontrola czasu inkubacji, aby zmaksymalizować sygnał hybrydyzacji bez uszkodzenia tkanki, dlatego dla każdej próbki tkanki może być wymagana optymalizacja.
    5. Zneutralizować aktywność proteazy w 0.2% glicynie w 1x PBS przez 2 min.
    6. Przepłukać szkiełka raz w 1x PBS przez 2 min.
    7. Potraktować szkiełka 4% roztworem PFA przez 10 min, aby ponownie utrwalić RNA, który mógł zostać uszkodzony podczas obróbki proteazą.
    8. Przepłukać szkiełka dwukrotnie w 1x PBS po 2 min każde.
    9. Podczas płukania szkiełek w PBS, przygotować 250 ml 0.1 M roztworu trietanolaminy o pH 8.0, mieszając 12.5 ml 2M trietanolaminy (29.8g w 100ml milliQ H2O, pH 8.0 za pomocą HCl) z 236.25 ml milliQ H2O w naczyniu szklanym. Bezpośrednio przed włożeniem szkiełek dodać 1.25 ml bezwodnika octowego do buforu trietanolaminowego i dobrze wymieszać. Po dodaniu szkiełek kontynuować powolne mieszanie przez 10 minut.
      Wymaga to, aby kasetka ze szkiełkami była uniesiona w pojemniku z trietanolaminą / bezwodnikiem octowym. Używamy systemu zaciskowego z podstawką wspierającą.
      Uwaga: Na tym etapie acetylowane są dodatnio naładowane grupy aminowe, które mogą prowadzić do nieswoistego wiązania sondy. Bezwodnik octowy jest toksyczny; roztwór ten należy zatem przygotowywać w dygestorium i utylizować w odpowiedni sposób.
    10. Przepłukać szkiełka dwukrotnie w 1x PBS przez 2 min.
    11. Ponownie odwodnić skrawki tkanek:
      • H2O - 1 min
      • 10% etanol - 30 s
      • 30% etanol - 30 s
      • 50% etanol - 30 s
      • 70% etanol - 30 s
      • 85% etanol - 30 s
      • 95% etanol - 30 s
      • 100% etanol - 30 s
      • 100% etanol - 30 s
      Uwaga: Szkiełka można przechowywać w pojemniku z niewielką ilością 100% etanolu na dnie do kilku godzin w 4°C.
  2. Hybrydyzacja
    1. Podgrzać blok grzejny do 85°C.
    2. Przygotować bufor do hybrydyzacji. Aby otrzymać 10 ml, wymieszać w probówce typu Falcon 1.25 ml soli do hybrydyzacji in situ (3M NaCl, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM fosforanu sodu pH 6.8, 50mM EDTA), 5 ml dejonizowanego formamidu, 2.5 ml 50% siarczanu dekstranu, 250 μl 50x Denhardt, 125 μl 100mg/ml tRNA oraz 875 μl H2O.
      Uwaga: Siarczan dekstranu jest bardzo lepki, dlatego najlepiej podgrzać roztwór do 60°C, aby ułatwić pipetowanie. Bufor do hybrydyzacji można przechowywać w -20°C.
    3. Przygotować poszczególne sondy. Dla każdego szkiełka wymieszać 1 μl sondy z 9 μl milliQ H2O i 10 μl dejonizowanego formamidu. Podgrzać sondę w 85°C przez 2-3 min, natychmiast schłodzić na lodzie, krótko odwirować i dodać sondę do 80μl buforu do hybrydyzacji na szkiełko. Dobrze wymieszać poprzez pipetowanie, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.
      Uwaga: Ilość sondy dodawanej na szkiełko musi zostać ustalona empirycznie. Zazwyczaj sondy stosuje się w końcowym stężeniu 0.5 ng/kb/μl złożoności sondy. Ponieważ hybrydyzacje wykonuje się z użyciem 100 μl na szkiełko, dla sond o długości 0.5 kb potrzeba około 25 ng sondy na szkiełko, a dla sond o długości 1 kb – 50 ng sondy na szkiełko. Dla uproszczenia często testujemy 0.5, 1 oraz 4 μl sondy na szkiełko.
    4. Położyć szkiełka na czystej powierzchni i pozostawić do całkowitego wyschnięcia przez 5-10 min. Nanieść pipetą mieszaninę sondy/buforu do hybrydyzacji na prawą krawędź szkiełka. Stopniowo opuścić szkiełko nakrywkowe na szkiełko, upewniając się, że roztwór do hybrydyzacji pokrywa wszystkie skrawki bez pęcherzyków powietrza. Lekko ostukać nakrywkę palcem w miejscach, gdzie tworzą się pęcherzyki, aby usunąć je ze wszystkich skrawków tkanki. Nie odciągać nakrywki, ponieważ może to uszkodzić skrawki.
      Uwaga: Alternatywną metodą często stosowaną na tym etapie jest przygotowanie „kanapek” z dwóch szkiełek inkubowanych z tą samą sondą. Więcej szczegółów na temat tej metody znajduje się w ref. 14.
    5. Przygotować komorę wilgotnościową w idealnie płaskim plastikowym pudełku. Dno pudełka wyłożyć papierem Whatmana zwilżonym wodą milliQ, przykryć papier parafilmem, pozostawiając niezakryte rogi; umieścić szkiełka w plastikowym pudełku i szczelnie je zamknąć.
    6. Inkubować szkiełka w pożądanej temperaturze hybrydyzacji, zazwyczaj 50 - 55 °C, przez 16-20 godzin.
    7. Do użycia następnego ranka przygotować 1 litr 0.2x SSC i przechowywać w 55°C. Dodatkowo przygotować 1 litr buforu NTE (0.5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0) i przechowywać w 37°C.
  3. Obróbka po hybrydyzacji
    1. Ostrożnie zdjąć nakrywki, aby nie uszkodzić skrawków. Umieścić szkiełka w kasetce i przemyć dwukrotnie w 0.2x SSC w 55°C przez jedną godzinę.
      Uwaga: Nakrywki często łatwo odpadają, gdy szkiełka są ustawione pionowo. Jeśli nakrywka pozostaje przytwierdzona, zanurzyć szkiełko w ciepłym 0.2x SSC na 1 lub 2 min, aby zmyć nakrywkę. Unikać odrywania nakrywki ze szkiełka, ponieważ może to spowodować uszkodzenie skrawków.
    2. W międzyczasie przygotować 500 ml buforu do płukania (1% BSA, 0.3% tritonu w buforze TBS) i 100 ml roztworu blokującego (0.5% odczynnika blokującego w buforze TBS). Wmieszać proszek blokujący do TBS, który jest powoli podgrzewany do 70°C, i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej po rozpuszczeniu.
      Uwaga: Wymagane objętości buforu do płukania i roztworu blokującego będą się różnić w zależności od rozmiaru płaskiego plastikowego pudełka użytego w krokach 4.3.8 - 11. Całkowite rozpuszczenie tritonu zajmuje trochę czasu, dlatego należy przygotować wystarczającą ilość roztworu z wyprzedzeniem.
    3. Eqwilibrować szkiełka w 1x NTE przez 2 min.
    4. Przejść do obróbki RNAzą A, przenosząc szkiełka do buforu 1x NTE, do którego tuż przed użyciem dodano 20μg/ml RNAzy A; inkubować w 37°C przez 30 min.
      Uwaga: RNAza A przecina wolne jednoniciowe RNA oraz miejsca niedopasowań w dupleksach RNA. Ten krok pomaga zmniejszyć poziom nieswoistego wiązania sondy, ponieważ przecięte fragmenty sondy są usuwane podczas ostatniego płukania w 0.2x SSC (patrz 4.3.6).
    5. Przepłukać szkiełka dwukrotnie w 1x NTE po 2 min każde.
    6. Przemyć szkiełka w świeżym 0.2x SSC w 55°C przez jedną godzinę.
    7. Eqwilibrować szkiełka w 1x PBS przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    8. Przenieść szkiełka z kasetki na dno płaskiego plastikowego pudełka i pokryć je minimalną objętością roztworu blokującego. Blokować szkiełka przez 45 min na platformie z wolnym wstrząsaniem.
    9. Przenieść szkiełka do drugiego czystego płaskiego plastikowego pudełka i płukać przez 45 min buforem do płukania na platformie wstrząsającej.
    10. Przejść do inkubacji z przeciwciałem. Rozcieńczyć przeciwciało anty-digoksygeninę w buforze do płukania (1:5 v/v) i albo nanieść minimalną objętość bezpośrednio na każde szkiełko, albo umieścić szkiełko w płaskim plastikowym pudełku i pokryć minimalną objętością roztworu przeciwciała. Inkubować szkiełka w ciemności przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.
    11. Przemyć szkiełka 4 razy po 15 min każde buforem do płukania na platformie wstrząsającej. Użyć minimalnej objętości buforu do płukania i płaskiego plastikowego pudełka. Czyścić plastikowe pudełko pomiędzy każdym z płukań.
      Uwaga: Czyszczenie pudełka między płukaniami zmniejszy ogólne tło na szkiełku. Aby to uprościć, używamy dwóch identycznych płaskich pudełek i przenosimy szkiełka do czystego pudełka po każdym płukaniu.
    12. Przenieść szkiełka do 1x TBS na 2 min.
    13. Eqwilibrować szkiełka w buforze TN dwukrotnie po 2 min każde.
    14. Przygotować roztwór barwiący bezpośrednio przed użyciem, dodając 20 μl NBT/BCIP na 1 ml buforu TN. Nalać roztwór barwiący do małego plastikowego naczynia ważkiego. Złożyć dwa szkiełka razem, tak aby skrawki były skierowane ku sobie. Zanurzyć jeden długi bok „kanapki” w roztworze, pozwalając na wciągnięcie roztworu siłami kapilarnymi. Osuszyć szkiełka na chusteczce Kimwipe i ponownie wypełnić szkiełka roztworem przeciwciał. Może być konieczne ostukanie szkiełek podczas wpływania roztworu, aby uniknąć pęcherzyków. Umieścić szkiełka w plastikowym pudełku i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności.
    15. Dzień 10 do Dnia 15: Odświeżać roztwór barwiący dwa razy dziennie przez 1-5 dni, płucząc szkiełka w buforze TN i przygotowując nowe „kanapki” zawierające świeży roztwór barwiący.
      Uwaga: Wymiana roztworu barwiącego w regularnych odstępach czasu poprawi stosunek sygnału do tła. Rozwój sygnału można monitorować pod mikroskopem złożonym lub stereoskopowym. Możliwe jest fotografowanie skrawków, gdy znajdują się w buforze TN pomiędzy rundami barwienia lub po ich przeniesieniu do wody tuż przed trwałą montażą.
  4. Montaż
    1. Gdy sygnał będzie wyraźny, przepłukać szkiełka w milliQ H2O i szybko odwodnić w serii etanolu:
      • 10% etanol - 10 s
      • 30% etanol - 10 s
      • 50% etanol - 10 s
      • 70% etanol - 5 s
      • 80% etanol - 5 s
      • 95% etanol - 5 s
      • 100% etanol - 5 s
      • histoclear - 2 min
      • histoclear - 2 min
      Uwaga: Należy dbać o to, aby każdy z tych czasów inkubacji był krótki, ponieważ sygnał jest rozpuszczalny w etanolu.
    2. Zamontować szkiełka, nakładając jedną lub dwie krople medium montażowego na bazie toluenu na każde szkiełko i powoli opuszczając nakrywkę na szkiełko, unikając tworzenia pęcherzyków. Pozostawić medium montażowe do utwardzenia przez noc przed analizą wyniku pod mikroskopem złożonym. Po zamontowaniu szkiełka mogą być przechowywane przez lata w temperaturze pokojowej.

5. Reprezentatywne wyniki:

Po upływie 1–5 dni w komórkach, w których sonda zhybrydyzowała z komplementarnymi transkryptami, pojawi się sygnał w kolorze czerwono-fioletowym (Rycina 1). Sygnał kolorystyczny ten umożliwia zatem bezpośrednią wizualizację wzorca ekspresji badanego genu w rozdzielczości komórkowej. Może rozwinąć się również słabsze barwienie tła, wynikające z niespecyficznego wiązania sondy lub barwienia tkanek roślinnych (Rycina 3). Taki sygnał tła może być stosunkowo bardziej wyraźny w małych, mniej zróżnicowanych komórkach tkanki, jednak barwienie tła byłoby obserwowane również w przekrojach zhybrydyzowanych z sondami kontrolnymi negatywnymi i pozytywnymi i nie byłoby powtarzalne pomiędzy doświadczeniami.

Mikroskopia tkanek roślinnych, analiza ekspresji genów, barwiony przekrój, porównanie histologiczne.
Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu różnych sond w tkankach Arabidopsis i kukurydzy. Hybrydyzacje in situ tkanek Arabidopsis (A-D) oraz kukurydzy (E-H) z różnymi sondami specyficznymi dla genów, ilustrujące typ wyników, jakich można oczekiwać po prawidłowym wykonaniu opisanego protokołu. (A) Lokalizacja SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) w wegetatywnym wierzchołku pędu Arabidopsis; zwróć uwagę na obecność purpurowo-niebieskiego sygnału w niedeterminowanych komórkach merystemu oraz brak sygnału w otaczających liściach. (B-D) Przekroje zarodków Arabidopsis w stadium torpedy wykazujące ekspresję CLAVATA3 (B) w nielicznych embrionalnych komórkach macierzystych, ekspresję AtML1 (C) w warstwie epidermy oraz brak sygnału w przekrojach badanych z użyciem losowego negatywnego RNA kontrolnego (D). (E) Lokalizacja homologu STM, genu knotted1, w rozwijającym się zarodku kukurydzy; zwróć uwagę na silny sygnał specyficznie w merystemie embrionalnym i korzeniu. (F-H) Przekroje podłużne wegetatywnego wierzchołka pędu kukurydzy wykazujące odmienne wzorce hybrydyzacji in situ dla arf3a (F) i ocl4 (G) oraz brak sygnału hybrydyzacji dla sondy kontrolnej negatywnej (H). Gen arf3a jest ekspresowany na abaksjalnej/dolnej powierzchni liścia, podczas gdy homolog AtML1, ocl4, jest ekspresowany specyficznie w epidermie.

Jako sondy wykorzystano następujące fragmenty genów: STM: region cDNA obejmujący aminokwasy 81 - 382, który zawiera konserwowaną domenę homeoboksową; CLV3: pełną długość cDNA; AtML1: trzeci ekson; kn1: całą otwartą ramkę odczytu; arf3a: nukleotydy 9 - 225 klonu cDNA HM004539; ocl4: fragment 1,7 kb z końca 3' pełnej długości cDNA, zawierający kilka konserwowanych domen białkowych.

Wyniki elektroforezy żelowej; fragmenty DNA z sondami; analiza markerów wielkości molekularnej.
Rysunek 2. Punkty kontrolne podczas przygotowywania sond do transkrypcji in vitro. (A) Sondy do hybrydyzacji in situ są sprawdzane na standardowym żelu agarozowym po transkrypcji in vitro (a), po traktowaniu DNazą i późniejszym oczyszczeniu reakcji transkrypcji in vitro (b), po hydrolizie węglanowej – jeśli jest wymagana – (c) oraz po przygotowaniu do użycia (d). W przypadku sond o długości powyżej 250 bp, takich jak sonda 1, hydroliza węglanowa spowoduje powstanie zakresu mniejszych fragmentów sondy (nawias). (B) Kolorymetryczne oznaczanie ilości sond metodą dot blot. Rozcieńczenia od 10-1 do 10-5 sondy kontrolnej o stężeniu 100 ng/μl (1) oraz trzech nowo znakowanych DIG sond (2-4) nanosi się na membranę transferową, inkubuje z przeciwciałem anty-DIG i analizuje przy użyciu testu kolorymetrycznego opisanego w sekcji 2.3 protokołu. Analiza sugeruje następujące szacunkowe stężenia: sonda 2, ˜100 ng/μl; sonda 3, ˜10 ng/μl; sonda 4, ˜1 ng/μl. Mało prawdopodobne jest, aby sonda 4 zapewniła dobry sygnał hybrydyzacji in situ.

Porównanie histologiczne, dwa obrazy mikroskopowe przekrojów tkanki wykazujące różnice w strukturze komórkowej.
Rysunek 3. Porównanie sondy nieswoistej z sondą prawidłowo działającą. Przekroje podłużne przez wierzchołek pędu wegetatywnego kukurydzy wykazujące nieswoisty sygnał tła (A) oraz swoisty sygnał hybrydyzacji in situ dla sondy OCL5 w zewnętrznej warstwie komórkowej (B).

Schemat przebiegu prac histologicznych: utrwalanie tkanek, infiltracja woskiem, transkrypcja, analiza dot blot.
Rysunek 4. Schemat przedstawiający harmonogram etapów protokołu hybrydyzacji in situ. Etapy zatapiania tkanek zaznaczono na zielono, etapy przygotowania sondy na pomarańczowo, a etapy hybrydyzacji in situ na niebiesko. Harmonogram zakłada dostępność matrycy DNA do transkrypcji sondy in vitro. Bloki tkankowe zatopione w parafinie oraz sondy znakowane DIG mogą zostać przygotowane wcześniej i przechowywane odpowiednio w temperaturze 4°C i -80°C do momentu użycia. Protokół hybrydyzacji in situ można wówczas zrealizować w czasie zaledwie czterech dni.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią wizualizację spatiotemporalnego wzorca ekspresji dowolnego genu zainteresowania z wysoką rozdzielczością komórkową, dużą czułością i specyficznością. Protokół ten nie pozwala na ilościowe porównanie poziomów ekspresji między poszczególnymi genami. Jednakże wysoka czułość i rozdzielczość tej metody mogą ujawnić gradienty ekspresji genów w obrębie tkanki8, 18, co nie jest możliwe w przypadku większości innych metod analizy ekspresji genów.

Protokół obejmuje wiele etapów, co może utrudniać rozwiązywanie problemów. Najbardziej krytycznymi krokami protokołu są fiksacja tkanki oraz wybór i znakowanie sondy. Niewłaściwie infiltrowane tkanki oraz sondy o niskim stopniu wbudowania DIG dadzą bardzo słabe sygnały, które mogą być trudne do wykrycia powyżej tła. Dla każdego nowego genu docelowego zaleca się przetestowanie kilku różnych sond pochodzących z różnych regionów transkryptu. Okazycznie konieczne może być połączenie dwóch lub trzech sond celujących w różne, mniejsze regiony genu, aby uzyskać silny i specyficzny sygnał hybrydyzacji. Ponadto warunki hybrydyzacji, takie jak temperatura i skład buforu do hybrydyzacji, mogą być optymalizowane dla każdego genu lub tkanki w celu obniżenia lub zwiększenia rygorystyczności hybrydyzacji. Również etap traktowania proteazą jest zmienną i może zostać zmodyfikowany, aby dostosować protokół do różnych gatunków roślin lub do wykrywania transkryptów o bardzo niskiej obfitości. Zastosowanie zarówno dodatnich, jak i ujemnych sond kontrolnych będzie pomocne w identyfikacji problematycznych punktów protokołu.

Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, lecz po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji może być również stosowana do hybrydyzacji in situ w preparatach całych tkanek. Choć hybrydyzacja in situ w preparatach całych tkanek jest powszechnie stosowana w badaniach nad zwierzętami19, w przypadku roślin jej zastosowanie będzie ograniczone do tkanek, które można łatwo infiltrować, takich jak embriony, korzenie lub młode tkanki merystematyczne20,21. Protokół można również łatwo zmodyfikować, aby jednocześnie wykrywać dwa różne mRNA lub lokalizować transkrypty wraz z białkami15,22,23. Wreszcie istnieje możliwość rozszerzenia zastosowania tej metody na wizualizację wzorców ekspresji małych RNA w roślinach. Wzorce ekspresji miRNA zostały określone przy użyciu tego protokołu zarówno w kukurydzy, jak i w Arabidopsis8,14. W ostatnim czasie sondy transkrybowane in vitro zastąpiono dostępnymi komercyjnie, znakowanymi DIG sondami oligonukleotydowymi z blokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA), które zwiększają czułość sygnału18, 24.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badania w laboratorium M.T. są wspierane z grantów National Science Foundation (DBI-0820610 oraz IOS-1022102) i Departamentu Zdrowia stanu Nowy Jork (NYSTEM-C024308). C.M. otrzymał stypendia podoktorskie od hiszpańskiego Ministerstwa Edukacji i Nauki (2007-0937) oraz Fundacji Rafael del Pino w Hiszpanii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cytoseal 60 4ozFisher Scientific23-244-2568310-4 na bazie toluenu
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Tissue Path Paraplast Plus Fisher Scientific23-021-400
membrana nylonowa N+ Hybond-N+ GE HealthcareRPN203B
RNase OUT; 40 j./μL Invitrogen10777019
RQ1 DNaza wolna od RNaz; 1 U/μL Promega Corp.M6101
Kontrolny RNA znakowany DIG Grupa Roche11585746910
mieszanina do znakowania RNA DIGGrupa Roche11277073910
polimeraza RNA SP6 1 000 U Grupa Roche10810274001
polimeraza RNA T3 1 000 U Grupa Roche11031163001
polimeraza RNA T7 1 000 U Grupa Roche10881767001
RNaza A Grupa Roche109142rozpuścić w glicerolu 50% w 100mM Tris pH 8,0
Odczynnik blokujący Grupa Roche1 096 176Podgrzać do 70°C w buforze TBS
Przeciwciało anty-digoksigenina-AP, fragmenty Fab od owcy 150 U Grupa Roche1 093 274
roztwór zapasu NBT/BCIP Grupa Roche1 681 451
kolumny do szybkiego wirowania RNA mini Quick Spin Grupa Roche11814427001
tRNA z *E. coli* Grupa Roche109541
Triton®X-100 Sigma-AldrichT8787
Tween-20 Sigma-AldrichP9416
Dejonizowany formamid Sigma-AldrichF9037
Proteaza z Streptomyces griseus Typ XIV Sigma-AldrichP5147Rozcieńczyć w wodzie milliQ i poddać wstępnemu trawieniu przez 4 godziny w temperaturze 37°C°C
Trietanoloamina Sigma-Aldrich90279Rozcieńczyć w wodzie, doprowadzić do pH 8,0 za pomocą HCl
Bezwodnik octowy Sigma-AldrichA6404
Sód dextranu siarczan otrzymany z Leuconostoc spp. Sigma-AldrichD8906-5GSiarczan dekstranu należy podgrzać do 80°C do rozpuszczania.
Denhardt’roztwór 50x koncentrat Sigma-AldrichD2532
Albumina z surowicy bydlęcej - ≥98% Sigma-AldrichA7906
sód dwuwodoroeozyny YSigma-AldrichE4382Rozpuścić w etanolu 96-100% do momentu nasycenia
Paraformaldehyd Sigma-AldrichP6148
Etanol absolutny 200 proof
Fenol/chloroform
Formy podstawowe Nauki o mikroskopii elektronowej62352-15
Pierścienie do zatapiania Fisher Scientific22-038-197
jednorazowe fiolki scyntylacyjne 20 ml z nakrętkami VWR international66020-326
Przeszkiełka z nałożoną sondą (probe-on-plus slides) Fisher Scientific22-230-900
Koleczki mikroskopowe 24x50 mm VWR international48404-452
papier Whatman 3 mm VWR international89022-360
Trzy szalki szklane i jedna statywa na preparaty ze stali nierdzewnej Electron Microscopy Sciences71420-25Do zabiegu w histoclear niezbędne są dwie szalki szklane, a ostatnia służy do zabiegu z użyciem bezwodnika octowego.
18 czystych plastikowych pojemników Nauki o mikroskopii elektronowej71402
2 lub 3 duże, płaskie plastikowe pojemniki z uszczelnianymi pokrywkami wymagane do etapów hybrydyzacji i inkubacji z przeciwciałami
Pędzle precyzyjne Pomoc w obchodzeniu się z wstążkami woskowymi
Mikrotom Leica
Samoczyszczący się system odsysania na sucho Welch Allyn2025
Podgrzewacz do szkiełek Fisher Scientific
Blok grzewczy wymagane przy 60°C i 85°C
Inkubator w temperaturze 58–60°C°C Fisher ScientificW przypadku etapów z wykorzystaniem stopionego Paraplastu
Piece lub łaźnie wodne ustawione na 55°C°C i 37°C Fisher ScientificWymagane są dwie sztuki ze względu na szybką zmianę temperatury
Wirówka (4°C - 20°C)
Dygestorium

Bibliografia

  1. Rensink, W. A., Buell, C. R. Microarray expression profiling resources for plant genomics. Trends. Plant. Sci. 10, 603-609 (2005).
  2. Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S. L., Kebrom, T. H., Provart, N., Patel, R., Myers, C. R. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat. Genet. 42, 1060-1067 (2010).
  3. Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
  4. Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318, 801-806 (2007).
  5. Brooks, L., Strable, J., Zhang, X., Ohtsu, K., Zhou, R., Sarkar, A., Hargreaves, S., Elshire, R. J., Eudy, D., Pawlowska, T., Ware, D., Janick-Buckner, D. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS. Genet. 5, e1000476-e1000476 (2009).
  6. Galbraith, D. W., Birnbaum, K. Global studies of cell type-specific gene expression in plants. Annu. Rev. Plant. Biol. 57, 451-475 (2006).
  7. Ohtsu, K., Smith, M., Emrich, S., Borsuk, L., Zhou, R., Chen, T., Zhang, X., Timmermans, M., Beck, J., Buckner, B., Janick-Buckner, D., Nettleton, D., Scanlon, M., Schnable, P. Global gene expression analysis of the shoot apical meristem of maize (Zea mays L.). Plant. J. 52, 391-404 (2007).
  8. Juarez, M. T., Kui, J. S., Thomas, J., Heller, B. A., Timmermans, M. C. P. microRNA-mediated repression of rolled leaf1 specifies maize leaf polarity. Nature. 428, 84-88 (2004).
  9. Kramer, E. M., Irish, V. F. Evolution of genetic mechanisms controlling petal development. Nature. 399, 144-148 (1999).
  10. Stuurman, J., Jäggi, F., Kuhlemeier, C. Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells. Genes Dev. 16, 2213-2218 (2002).
  11. Kim, M., McCormick, S., Timmermans, M., Sinha, N. The expression domain of PHANTASTICA determines leaflet placement in compound leaves. Nature. 424, 438-443 (2003).
  12. Kramer, E. M., Holappa, L., Gould, B., Jaramillo, M. A., Setnikov, D., Santiago, P. M. Elaboration of B gene function to include the identity of novel floral organs in the lower eudicot Aquilegia. Plant Cell. 19, 750-766 (2007).
  13. Lippman, Z. B., Cohen, O., Alvarez, J. P., Abu-Abied, M., Pekker, I., Paran, I., Eshed, Y., Zamir, D. The making of a compound inflorescence in tomato and related nightshades. PLoS Biol. 6, e288-e288 (2008).
  14. Kidner, C., Timmermans, M. C. P. In situ hybridization as a tool to study the role of microRNAs in plant development. Methods. Mol. Biol. 342, 159-179 (2006).
  15. Jackson, D. Double labeling of KNOTTED1 mRNA and protein reveals multiple potential sites of protein trafficking in the shoot. 129, 1423-1429 (2002).
  16. Jensen, W. A. Botanical Histochemistry. , Freeman. San Francisco. 408-408 (1962).
  17. Jackson, D. In situ hybridization in plants. Molecular Plant Pathology: A Practical Approach. Bowles, D. J., Gurr, S. J., McPherson, M. , University Press. Oxford. 163-174 (1991).
  18. Chitwood, D. H., Nogueira, F. T., Howell, M. ontgomery, Carrington, T. A., C, J., Timmermans, M. C. P. Pattern formation via small RNA mobility. Genes. Dev. 23, 549-554 (2009).
  19. Piette, D., Hendrickx, M., Willems, E., Kemp, C. R., Leyns, L. An optimized procedure for whole-mount in situ hybridization on mouse embryos and embryoid bodies. Nat. Protoc. 3, 1194-1201 (2008).
  20. Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
  21. Jackson, D., Hake, S. Control of phyllotaxy in maize by the abphyl1 gene. Development. , 126-315 (1999).
  22. Chuck, G., Whipple, C., Jackson, D., Hake, S. The maize SBP-box transcription factor encoded by tasselsheath4 regulates bract development and the establishment of meristem boundaries. Development. 137, 1243-1250 (2010).
  23. Long, J. A., Barton, M. K. The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis. Development. 125, 3027-3035 (1998).
  24. Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex. PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ekspresja gen wtkanka ro linnadetekcja RNAskrawki parafinowesonda znakowana DIGfosfataza alkalicznareakcja kolorymetrycznakrojenie tkanekbufor do hybrydyzacji
Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.