In Situ Hybrydyzacja w celu precyzyjnej lokalizacji transkryptów w roślinach

Summary

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ pozwala na bezpośrednią lokalizację mRNA i ekspresję małego RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i specyficznością. Procedura jest zoptymalizowana pod kątem skrawków tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiej gamy roślin i tkanek i może zostać zakończona w ciągu dziesięciu dni.

Abstract

Dzięki postępom w badaniach genomicznych ostatniej dekady, biologia roślin doczekała się licznych badań prezentujących wielkoskalowe analizy ilościowe ekspresji genów. Podejścia oparte na mikromacierzach i sekwencjonowaniu nowej generacji są wykorzystywane do badania procesów rozwojowych, fizjologicznych i reakcji na stres, analizowania szlaków epigenetycznych i małych RNA oraz budowania dużych sieci regulacyjnych genów^1-3. Chociaż techniki te ułatwiają jednoczesną analizę dużych zestawów genów, zazwyczaj zapewniają one bardzo ograniczoną rozdzielczość czasoprzestrzenną zmian ekspresji genów. Ograniczenie to można częściowo przezwyciężyć, stosując metodę profilowania w połączeniu z mikrodysekcją laserową lub sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją^4-7. Jednak, aby w pełni zrozumieć biologiczną rolę genu, niezbędna jest wiedza na temat jego czasoprzestrzennego wzorca ekspresji w rozdzielczości komórkowej. Szczególnie podczas badania rozwoju lub wpływu bodźców środowiskowych i mutantów może stać się niezbędna szczegółowa analiza wzorca ekspresji genu. Na przykład subtelne różnice ilościowe w poziomach ekspresji kluczowych genów regulatorowych mogą prowadzić do dramatycznych fenotypów, gdy są związane z utratą lub wzrostem ekspresji w określonych typach komórek.

Kilka metod jest rutynowo używanych do szczegółowego badania wzorców ekspresji genów. Jednym z nich jest analiza transgenicznych linii reporterowych. Taka analiza może jednak stać się czasochłonna w przypadku analizy wielu genów lub pracy w roślinach opornych na transformację. Ponadto zwykle wymagana jest niezależna walidacja w celu zapewnienia, że wzorzec ekspresji transgenu naśladuje gen endogenny. Immunohistochemiczna lokalizacja białek lub hybrydyzacja mRNA in situ stanowią stosunkowo szybką alternatywę dla bezpośredniej wizualizacji ekspresji genów w komórkach i tkankach. Ten ostatni ma wyraźną zaletę, że może być łatwo stosowany na dowolnym genie, który Cię interesuje. Hybrydyzacja in situ umożliwia wykrywanie docelowych mRNA w komórkach poprzez hybrydyzację ze znakowaną antysensowną sondą RNA uzyskaną przez transkrypcję in vitro interesującego genu.

Tutaj przedstawiamy protokół lokalizacji in situ ekspresji genów w roślinach, który jest bardzo czuły i specyficzny. Jest zoptymalizowany do stosowania z sekcjami utrwalonymi w paraformaldehydzie, zatopionymi w parafinie, które zapewniają doskonałe zachowanie histologii, oraz sondami znakowanymi DIG, które są wizualizowane przez immunodetekcję i reakcję kolorymetryczną fosfatazy alkalicznej. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do wielu tkanek z szerokiej gamy gatunków roślin i może być stosowany do analizy ekspresji mRNA, a także małych RNA^8-14.

Protocol

1. Przygotowanie próbki

Uwaga: Wszystkie kroki aż do etapu hybrydyzacji włącznie są wrażliwe na aktywność RNAza. Dlatego tak ważna jest praca w czystych warunkach. Dość powszechne jest również, że wszystkie roztwory są wolne od RNaz przy użyciu wody uzdatnionej DEPC i naczyń szklanych pieczonych w temperaturze 180 °C przez co najmniej 3 godziny. Pojemniki z tworzywa sztucznego są często czyszczone poprzez obróbkę 0,2 N NaOH przez 30 minut. Jednak żaden z tych środków ostrożności nie jest niezbędny i zazwyczaj używamy regularnego, czystego milliQ_{H 2}O do wszystkich roztworów. Przechowujemy oddzielne odczynniki, pudełka i szkło do hybrydyzacji in situ i przechowujemy je w czystej szafce.

1. Utrwalanie próbki
   1. Dzień 1: Przygotuj świeży utrwalacz 4% paraformaldehydu (PFA). Na 500 ml podgrzej 400 ml 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na₂HPO₄, 3 mM NaH₂PO₄ pH 7,0) do 60°C i rozpuść dwie granulki NaOH. W dygestorium dodaj 20 g paraformaldehydu i dokładnie wymieszaj, aż do rozpuszczenia. Umieść roztwór na lodzie i po schłodzeniu dostosuj pH do 7,2 za pomocą_H2SO4 (1-2 krople na 100 ml). Następnie dostosuj objętość do 500 ml za pomocą 1x PBS.
      Uwaga: Nie używaj HCl do regulacji pH, ponieważ spowoduje to uwolnienie wysoce toksycznych oparów. Paraformaldehyd jest toksyczny; Roztwór ten należy zatem przygotować w dygestorium i odpowiednio zutylizować. Ponadto paraformaldehyd jest przechowywany w temperaturze 4°C i powinien być kupowany jako nowy co 6 - 9 miesięcy.
   2. Pobrać próbki tkanek i natychmiast umieścić je w 15 ml świeżego utrwalacza PFA na lodzie w szklanych fiolkach scyntylacyjnych. Jeśli wymagane jest wycięcie tkanki, najlepiej zrobić to na lodzie w zimnym utrwalaczu.
      Uwaga: Ważne jest, aby użyć dużego nadmiaru utrwalacza. Ogólnym zalecanym stosunkiem jest użycie 10 objętości utrwalacza na 1 objętość tkanki.
   3. Zastosować próżnię ( ̃500 mm Hg) do próbek znajdujących się na lodzie. Trzymaj próżnię przez 15-20 minut; Z próbek powinny uwalniać się małe pęcherzyki, ale utrwalacz nie powinien dojść do wrzenia. Powoli uwalniaj próżnię i wymień utrwalacz PFA, aby upewnić się, że utrwalacz pozostaje w odpowiednim stężeniu. Powtarzaj ten krok, aż tkanki opadną po uwolnieniu próżni.
      Uwaga: Utrwalanie jest wymagane do utrwalenia i usieciowania cząsteczek RNA w tkance. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ źle zamocowane materiały dają słaby sygnał. Niektóre tkanki nie toną od razu, ale większość ostatecznie tonie w ciągu nocy. Aby poprawić infiltrację utrwalacza, można dodać następujące detergenty: Triton do 0,1% i/lub Tween do 0,1 - 0,3%. Alternatywnie, utrwalacze na bazie etanolu, takie jak kwas formaldehydowo-alkoholowo-kwaśny (FAA), mogą być stosowane do tkanek, które w przeciwnym razie nie są łatwo infiltrowane^14,15.
   4. Ponownie wymienić utrwalacz PFA i przechowywać fiolki w temperaturze 4°C przez noc.
2. Osadzanie tkanek
   1. Dzień 2: Wstępnie schłodzić 1x PBS i serię etanolową w temperaturze 4°C.
   2. Przepłukać próbki dwukrotnie przez 30 minut każda w 1x PBS, na lodzie.
      Uwaga: Ponownie zaleca się użycie dużego nadmiaru każdego roztworu.
   3. Odwodnić próbki, przeprowadzając je przez serię etanolu na lodzie, w następujący sposób:
      • 10% etanol     30 min,
      • 30% etanolu     30 min,
      • 50% etanolu     1 godzina,
      • 70% etanolu     1 godzina,
      • 85% etanol     1 godzina,
      • 95% etanolu     1 godzina,
      • 3 wymiany 100% etanolu przez 1 godzinę każda
   4. Pod koniec dnia zastąp etanol przez 0,1% eozyny w 100% etanolu przez noc w temperaturze 4°C. Eozyna zabarwia ścianę komórkową, dzięki czemu próbki są bardziej widoczne podczas zatapiania i cięcia.
      Uwagi: Wskazane tutaj czasy zostały zoptymalizowane dla bloków o wymiarach 3x3x3 mm, ale w przypadku większych próbek mogą być wymagane dłuższe inkubacje.
      Próbki mogą być przechowywane w 70% etanolu w temperaturze 4°C przez kilka miesięcy.
   5. Dzień 3: Następnego ranka ogrzej próbki do temperatury pokojowej przez godzinę. Następnie stopniowo zastępuj etanol Histoclear w następujący sposób:
      
   6. Pod koniec dnia dodaj 1/4 objętości chipsów Paraplast Plus i umieść fiolkę w piekarniku o temperaturze 60°C. Napełnij również zlewkę wiórkami Paraplast i często ją uzupełniaj, aby zawsze mieć pod ręką świeżo stopiony wosk.
      Uwaga: Temperatura piekarnika jest ważna i należy unikać długotrwałego podgrzewania Paraplastu powyżej 60°C.
   7. Dzień 4: Stopniowo zastępuj histoclear preparatem Paraplast, regularnie dodając więcej wiórów parafinowych (co godzinę). Pod koniec dnia ostrożnie odlej mieszaninę histoclear i wosku i natychmiast zastąp ją czystym stopionym woskiem. Pozostawić próbki w temperaturze 60°C na noc.
   8. Dzień 5 i 6: Wymieniaj Paraplast 3 razy dziennie, mniej więcej co 4 godziny, ze świeżym stopionym woskiem, utrzymując próbki w temperaturze 60 °C.
      Uwaga: Możliwa jest wymiana wosku tylko raz dziennie, ale przygotowanie tkanki zajęłoby kilka dodatkowych dni, ponieważ wosk musi być zmieniany co najmniej 5 lub 6 razy. Infiltracja próżniowa próbek tkanek, gdy są one w 100% EtOH i/lub w wosku, może jeszcze bardziej poprawić infiltrację i osadzanie tkanek. Infiltracja próżniowa próbek w wosku powinna odbywać się w temperaturze 60°C.
   9. Dzień 7: Zmień wosk jeszcze raz. Zapach histoclear powinien teraz całkowicie zniknąć, a próbki mogą zostać osadzone później tego samego dnia.
   10. Ustaw dużą płytę grzewczą w temperaturze 60°C zabezpieczoną folią aluminiową.
   11. Metoda osadzania będzie się różnić w zależności od rodzaju tkanki, która ma być analizowana. Najważniejszym punktem na tym etapie jest upewnienie się, że próbki są prawidłowo zorientowane do późniejszego cięcia. Jednym ze sposobów jest użycie plastikowych form i pierścieni. Rozgrzej foremki na płycie grzewczej i wlej stopiony wosk do dolnej części formy. Przenieś próbkę tkanki do formy za pomocą rozgrzanych kleszczyków i ustaw ją w żądanej pozycji. Umieść biały pierścień na formie i dodaj dodatkowy stopiony wosk, aby tkanki były całkowicie pokryte. Ostrożnie przenieś formę z talerza na ławkę. Pozwól woskowi stopniowo ostygnąć.

Inną możliwością jest rozłożenie wszystkich próbek na szalce Petriego zawierającej stopiony wosk (próbki powinny być całkowicie pokryte woskiem) podczas pracy na płycie ogrzewanej w temperaturze 60°C. Ułóż próbki za pomocą ciepłych kleszczy. Na koniec wyłącz płytę. Po zestaleniu się wosku szalkę Petriego można przenieść na ławkę, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C. Gdy są gotowe do cięcia, małe bloki zawierające próbkę tkanki można wyciąć z szalki Petriego za pomocą rozgrzanego ostrza i zamontować na uchwycie na próbkę mikrotomu z dodatkową kroplą stopionego wosku. Pozwól próbce stwardnieć przez kilka minut przed podziałem na sekcje.

Uwaga: Bloki mogą być przechowywane w temperaturze 4°C przez 1 rok lub dłużej. Aby uzyskać dodatkowe pomocne wskazówki dotyczące utrwalania i osadzania tkanek, patrz ref. 16

2. Przygotowanie sondy

1. Klonowanie
   Sondy są zwykle generowane do jednego lub więcej określonych regionów genu będącego przedmiotem zainteresowania. Wysoce powtarzalne sekwencje powinny być wykluczone z sondy, ale sekwencje odpowiadające konserwatywnym domenom białkowym, takim jak motywy wiążące DNA w czynnikach transkrypcyjnych, zazwyczaj dają specyficzne dla genów wzorce ekspresji^8,9,12,15 (ryc. 1). Dzieje się tak, ponieważ leczenie RNAZA A na etapach po hybrydyzacji (patrz poniżej) zmniejsza poziom hybrydyzacji krzyżowej sondy między członkami rodziny genów. RNAza A rozszczepia się przy niedopasowaniach w dupleksach RNA, fragmentujących sondach hybrydyzowanych do transkryptów o niedoskonałej komplementarności, które zostaną zmyte w kolejnych krokach.
   Ogólnie rzecz biorąc, może być konieczne przetestowanie kilku sond dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Sondy mogą mieć nawet 150 zasad długości. Chociaż nie ma ograniczeń co do długości sondy, fragmenty krótsze niż 1,5 kb zazwyczaj transkrybują lepiej. Fragmenty DNA przeznaczone do transkrypcji są klonowane do wektora zawierającego promotory T3, T7 lub SP6 (np. pCRII-TOPO, Invitrogen). Alternatywnie, sekwencje promotorów T3, T7 lub SP6 mogą być dołączone jako ogon 5' na odwróconym starterze używanym do amplifikacji obszaru sondy.
   W każdym eksperymencie hybrydyzacji in situ uwzględniamy dodatnią sondę kontrolną, dla której znany jest wzór hybrydyzacji i która działa konsekwentnie, a także kontrolę ujemną (Figura 1D i H). Ta ostatnia może być losową sondą RNA, o której wiadomo, że nie hybrydyzuje z żadnymi transkryptami w tkance będącej przedmiotem zainteresowania. Chociaż powszechne jest używanie sondy zmysłowej analizowanego genu, nie jest to konieczne i każde niehybrydyzujące RNA będzie pasować do tego celu. Jeśli to możliwe, tkanki z transkrypcyjnego allelu zerowego genu będącego przedmiotem zainteresowania służyłyby jako doskonała kontrola negatywna.
   
2. Transkrypcja in vitro
   1. Linearyzuj plazmid, trawiąc około 5 μg DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego, który trawi się na końcu wstawki naprzeciwko miejsca promotora. Nie używaj enzymów restrykcyjnych, które pozostawiają 3'-zwis. Może to prowadzić do artefaktów transkrypcji, ponieważ polimeraza może wykorzystywać zwis 3' jako substrat do kontynuowania transkrypcji. Alternatywnie, region sondy, w tym promotor T3, T7 lub SP6, może być amplifikowany metodą PCR w celu wygenerowania matrycy DNA do reakcji transkrypcji in vitro.
   2. Sprawdź podwielokrotność na żelu, aby upewnić się, że reakcja przeszła do końca.
   3. Ekstrahować DNA fenolem/chloroformem, wytrącić etanolem i ponownie zawiesić osad DNA w miliQ_H2O do stężenia 1 μg/μl. Alternatywnie, DNA można oczyścić za pomocą standardowych kolumn do oczyszczania DNA.
   4. Ustaw reakcję transkrypcji in vitro, mieszając:
      • 1 μl oczyszczonego DNA (1 μg/μl)
      • 2μl 10x bufor transkrypcyjny
      • 2 μL 10x mieszanka do znakowania DIG RNA
      • 1 μl RNAzes
      • 2 μl polimerazy RNA T3, T7 lub SP6 (20 U/μl)
      • H₂O do 20 μl.
      
      Inkubować w temperaturze 37°C przez 1 do 2 godzin. Zachowaj 1 μl do późniejszej analizy na żelu.
      Uwaga: Sondy znakowane fluorescencyjnie są preferowane w systemach zwierzęcych, ale ze względu na wysoką autofluorescencję większości tkanek roślinnych, protokoły hybrydyzacji in situ dla roślin wykorzystują sondy znakowane radioaktywnie¹⁷ lub częściej sondy znakowane DIG, które są wykrywane przez immunohistochemię.
   5. Usunąć matrycę DNA, dodając 75 μl MilliQ_H2O i 5 μl DNA RQ1 (1 U/μl) do reakcji transkrypcji i inkubując reakcję w temperaturze 37°C przez 10 minut.
   6. Oczyść reakcję transkrypcji in vitro w celu wyeliminowania nieinkorporowanych nukleotydów i małych transkryptów. Jedną z możliwości jest użycie kolumny Sephadex® z wykluczeniem rozmiaru, takiej jak mini kolumny RNA Quick Spin (Roche). Alternatywnie, reakcja transkrypcji może być oczyszczona przez konwencjonalne wytrącanie LiCl/etanol (patrz odnośnik 14). Zachowaj 1 μl, aby później sprawdzić żel.
   7. Sondy o długości ponad 250 zasad są zwykle częściowo hydrolizowane w celu uzyskania cząsteczek RNA o wielkości około 150 nt, a zatem wystarczająco małych, aby skutecznie penetrować skrawki tkanki. Dodać równą objętość 2x buforu węglanowego (80 mM NaHCO₃, 120 mM Na₂CO₃) do oczyszczonej reakcji transkrypcji i inkubować w temperaturze 60°C. Czas inkubacji należy obliczyć według następującego wzoru:
      czas = (Li - Lf) / (K x Li x Lf)
      gdzie Li = początkowa długość sondy (w kb); Lf = końcowa długość sondy (0,150 kb); K = 0,11 kb/minutę. Zachowaj 2 μl, aby sprawdzić, czy żel jest dobry.
   8. Zneutralizować reakcję hydrolizy, dodając 1/20 objętości 10% kwasu octowego.
   9. Sonda jest następnie oczyszczana przez dodanie 1 μl tRNA (100 mg / ml), 1/10 objętości 3M NaAc pH 5,2 plus 2,5 objętości zimnego 100% etanolu i inkubację w temperaturze -80 ° C przez 30 min. Wytrącić RNA przez odwirowanie z prędkością 13 500 obr./min przez 20 min w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant i przepłukać osad RNA 500 μl 70% etanolu. Ponownie odwirować, pozostawić granulkę do wyschnięcia (zwykle około 15 minut) i ponownie zawiesić RNA w 50 μl 50% dejonizowanego formamidu. Sonda powinna być przechowywana w temperaturze -80°C do czasu użycia.
   10. Sprawdzić na zwykłym żelu 1% TAE-agarozowym produkt końcowy, jak również produkty pośrednie z sekcji 2.2.4, 2.2.6 i 2.2.7 (Rysunek 2A). Pozwala to na monitorowanie skuteczności reakcji transkrypcji in vitro.
       Uwaga: W wyniku reakcji transkrypcji in vitro powinno dojść do uzyskania około 1 μg RNA na 1 μg matrycy.
3. Analiza It Blot
   Stężenie sondy i włączenie DIG-UTP można ocenić za pomocą analizy punktowej (rysunek 2B). Seryjne rozcieńczenia RNA są wykrywane na standardowej błonie hybrydyzacyjnej wraz ze znakowanym kontrolnym RNA o znanym stężeniu. Na przykład używamy kontrolnej sondy RNA znakowanej DIG-UTP, która znajduje się w zestawie do transkrypcji in vitro (Roche). Najlepiej jest przetestować wiele rozcieńczeń dla każdej sondy, aby ustalić dokładne stężenie.
   1. Przygotować bufor blokujący, rozpuszczając 0,5% odczynnika blokującego w 1x buforze TBS (100 mM Tris-HCl pH7,5, 150 mM NaCl) w temperaturze 70°C, a następnie pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
   2. Umieścić 1 μl seryjnych rozcieńczeń (zwykle ^10-1 do ^10-5) sond transkrybowanych in vitro i kontrolnych na membranie nylonowej N+. Napraw RNA przez sieciowanie UV.
      Uwaga: Należy użyć minimalnej powierzchni membrany, aby zmniejszyć objętość potrzebnych później.
   3. Równowaga membrany w 1x TBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) na platformie wstrząsającej.
   4. Zablokuj membranę za pomocą bufora blokującego na 30 minut w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsającej.
   5. Płukać membranę w 1x TBS przez 5 min.
   6. Inkubować błonę z przeciwciałem anty-DIG, rozcieńczając 1 μl anty-digoksygeniny-AP w 10 ml 1x TBS, przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Umyj membranę dwukrotnie w 1x TBS po 15 minut.
   8. Zrównoważyć membranę w 1x buforze TN (100mM Tris-HCl pH 9,5, 100mM NaCl) przez 5 min.
   9. Wybarwić membranę przez inkubację z NBT/BCIP 1/50 (v/v) w 1x buforze TN. Barwienie może zająć 5-10 minut. Następnie spłucz membranę wodą; Następnie można go wysuszyć i przechowywać jako dokumentację.
      Uwaga: NBT/BCIP jest substratem fosfatazy alkalicznej sprzężonej z przeciwciałem anty-DIG, które po hydrolizie wytwarza ciemnoniebieski barwnik.

3. Podział na sekcje

1. Podgrzej bloki do temperatury pokojowej. Jeśli bloki są zbyt zimne, poszczególne sekcje mogą się przewrócić, nie tworząc woskowej "wstążki". Przytnij blok do kształtu trapezu, pozostawiając około 1 mm wosku wokół próbki.
2. Rozgrzej duży podgrzewacz do zjeżdżalni w temperaturze 35-37°C.
   Uwaga: Wiele protokołów wykonuje ten krok w temperaturze 42°C, jednak obniżenie temperatury do 35-37°C zapobiega tworzeniu się pęcherzyków pod sekcjami.
3. Umieść blok na mikrotomie tak, aby dłuższa z dwóch równoległych ścian znajdowała się na dole. Ostrożnie przesuń klocek do przodu do ostrza i upewnij się, że powierzchnia bloku jest równoległa do ostrza. Przekrój o grubości 8 - 10 μm. Taśmy woskowe można wyrównać na nielepkiej powierzchni, takiej jak folia aluminiowa lub bibuła filtracyjna, aby wybrać interesujące sekcje. Można to ocenić za pomocą pobliskiego mikroskopu preparacyjnego.
   Uwaga: Zabarwienie tkanki eozyną stanowi wskazówkę, czy tkanki zostały prawidłowo naciekane podczas osadzania. Jeśli środek bloku nie jest zabarwiony eozyną, zwykle oznacza to, że tkanka jest słabo utrwalona.
4. Oznacz szkiełka Probe-on Plus ołówkiem (większość pisaków lub markerów jest usuwana podczas protokołu hybrydyzacji in situ) i rozprowadź na nich 1 ml czystego milliQ_{H 2}O. Ostrożnie unosić interesujące Cię sekcje na powierzchni wody w temperaturze pokojowej (łatwiej jest manipulować sekcjami na wodzie podczas pracy w temperaturze pokojowej). Upewnij się, że błyszcząca strona (dolna strona, gdy wstążka schodzi z mikrotomu) jest skierowana w stronę wody. Następnie powoli przenieś szkiełko na podgrzewacz do slajdów. Ogrzewanie pomaga sekcjom rozprzestrzeniać się po powierzchni wody. Po 5 minutach wylej wodę ostrożnie, ale jednym płynnym ruchem, tak aby wstążka została opuszczona na zjeżdżalnię. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na co najmniej kilka godzin lub na noc w temperaturze 37°C, aby chusteczka przylegała.
   Uwaga: Pociętą tkankę można przechowywać w pudełku z osuszaczem krzemionkowym przez kilka dni do tygodni w temperaturze 4°C, jednak najlepiej jest zużyć szkiełka tak szybko, jak to możliwe.

4. Hybrydyzacja in situ

1. Sekcja obróbki wstępnej
   Objętość wymagana dla każdego roztworu będzie oczywiście zależeć od liczby szkiełek do obróbki i wielkości użytego pojemnika. Sekcje powinny być zawsze całkowicie zanurzone. Na 25-suwakowy stojak i starannie dopasowany pojemnik wystarczy 200-250 ml. Ponieważ wiele etapów inkubacji jest bardzo krótkich, zwykle najpierw przygotowujemy wszystkie możliwe roztwory, a następnie rozpoczynamy wstępną obróbkę szkiełka. Jednak roztwór bezwodnika octowego należy przygotować bezpośrednio przed użyciem, a proteazę dodaje się w momencie użycia. Wszystkie czynności są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Ponadto wszystkie można przygotować w stężeniu 10x jako roztwór podstawowy.
   1. Ogrzać bufor proteazy (100 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA) w pojemniku do temperatury 37°C.
   2. Odparafinować i ponownie nawodnić skrawki tkanek w następujący sposób:
      
      • HistoClear - 10 min (użyj szklanego naczynia)
      • HistoClear - 10 min (użyj szklanego naczynia)
      • 100% etanol - 1 min
      • 100% etanol - 30 sek
      • 95% etanolu - 30 sek
      • 85% etanol - 30 sek
      • 70% etanolu - 30 sek
      • 50% etanolu - 30 sek
      • 30% etanolu - 30 sek
      • 10% etanolu - 30 sek
      • miliQ H₂O - 1 min
   3. Inkubować w 1x PBS przez 2 min.
   4. Wymieszaj 625 μl proteazy 50 mg / ml w 250 ml buforu proteazy podgrzanego do 37°C i inkubuj szkiełka przez 20 minut w temperaturze 37°C.
      Uwaga: Proteaza jest niezbędna do trawienia utrwalonych białek i zwiększania dostępu sondy do komórkowych RNA. Bardzo ważne jest, aby kontrolować czas inkubacji, aby zmaksymalizować sygnał hybrydyzacji bez rozpadu tkanki, dlatego dla każdej próbki tkanki może być wymagana pewna optymalizacja.
   5. Neutralizuj aktywność proteazy w 0,2% glicynie w 1x PBS przez 2 min.
   6. Płucz szkiełka raz na 1x PBS przez 2 minuty.
   7. Preparaty należy traktować w 4% roztworze PFA przez 10 minut, aby ponownie utrwalić RNA, które może zostać uszkodzone przez leczenie proteazą.
   8. Opłucz szkiełka dwukrotnie w 1x PBS przez 2 minuty każde.
   9. Podczas gdy szkiełka znajdują się w płuczkach PBS, uzupełnić 250 ml 0,1 M roztworu trietanoloaminy o pH 8,0, mieszając 12,5 ml 2M trietanoloaminy (29,8 g w 100 ml miliQ_H2O, pH 8,0 z HCl) z 236,25 ml miliQ_H2Ow szklanym naczyniu. Dodać 1,25 ml bezwodnika octowego do buforu trietanoloaminy bezpośrednio przed włożeniem szkiełek i dobrze wymieszać. Po dodaniu szkiełek kontynuuj powolne mieszanie przez 10 minut.
      Wymaga to, aby stojak na szkiełka był podniesiony w pojemniku z trietanoloaminą / bezwodnikiem octowym. Stosujemy system mocowania ze stojakiem podporowym.
      Uwaga: Na tym etapie dodatnio naładowane grupy aminowe, które mogą prowadzić do niespecyficznego wiązania sondy, są acetylowane. Ponadto bezwodnik octowy jest toksyczny; Roztwór ten należy zatem przygotować w dygestorium i odpowiednio zutylizować.
   10. Przepłukać szkiełka dwukrotnie w 1x PBS przez 2 minuty.
   11. Ponownie odwodnić skrawki tkanki:
       
       • H₂O - 1 min
       • 10% etanolu - 30 sek
       • 30% etanolu - 30 sek
       • 50% etanolu - 30 sek
       • 70% etanolu - 30 sek
       • 85% etanol - 30 sek
       • 95% etanolu - 30 sek
       • 100% etanol - 30 sek
       • 100% etanol - 30 sek
       Uwaga: Preparaty można przechowywać w pojemniku z niewielką ilością 100% etanolu na dnie do kilku godzin w temperaturze 4°C.
2. krzyżowanie
   1. Podgrzej blok grzewczy do 85°C.
   2. Przygotuj bufor hybrydyzacyjny. Na 10 ml wymieszaj w probówce Falcon 1,25 ml soli hybrydyzacyjnych in situ (3M NaCl, 100mM Tris-HCl pH 8,0, 100mM Na Phosphate pH6,8, 50mM EDTA), 5 ml dejonizowanego formamidu, 2,5 ml 50% siarczanu dekstranu, 250 μl 50x Denhardt, 125 μl 100mg/ml tRNA i 875 μl H₂O.
      Uwaga: Siarczan dekstranu jest bardzo lepki, dlatego najlepiej jest podgrzać roztwór do 60°C, aby ułatwić pipetowanie. Bufor hybrydyzacyjny może być przechowywany w temperaturze -20°C.
   3. Przygotuj różne sondy. Na każdym szkiełku należy zmieszać 1 μl sondy z 9 μl miliQ_H2O i 10 μl dejonizowanego formamidu. Podgrzej sondę w temperaturze 85°C przez 2-3 minuty, natychmiast schłodzić na lodzie, krótko odwirować i dodać sondę do 80 μl buforu hybrydyzacyjnego na szkiełko. Dobrze wymieszać pipetując, ale unikać tworzenia pęcherzyków.
      Uwaga: Ilość sondy, która ma być dodana na szkiełko, musi być przetestowana empirycznie. Ogólnie rzecz biorąc, sondy są używane przy końcowym stężeniu złożoności sondy 0,5 ng/kb/μl. Ponieważ hybrydyzacja jest wykonywana przy użyciu 100 μl na szkiełko, potrzeba około 25 ng sondy na szkiełko w przypadku sond o długości 0,5 kb i 50 ng sondy na szkiełko w przypadku sond o długości 1 kb. Dla uproszczenia często próbujemy sondy 0,5, 1 i 4 μl na szkiełko.
   4. Umieść szkiełka na czystej powierzchni i pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu przez 5-10 minut. Odpipetuj mieszankę sondy/buforu hybrydyzacyjnego na prawą krawędź szkiełka. Stopniowo opuszczaj szkiełko nakrywkowe na szkiełko; Upewnij się, że roztwór hybrydyzacyjny obejmuje wszystkie sekcje bez żadnych pęcherzyków. Delikatnie postukaj palcem w szkiełko nakrywkowe w miejscu, w którym tworzą się bąbelki, aby przemieścić je ze wszystkich odcinków tkanki. Nie ściągaj szkiełka nakrywkowego, ponieważ spowoduje to uszkodzenie sekcji.
      Uwaga: Alternatywną metodą powszechnie stosowaną na tym etapie jest przygotowanie "kanapek" składających się z dwóch szkiełek, które są inkubowane za pomocą tej samej sondy. Więcej informacji na temat tej metody można znaleźć w ref. 14.
   5. Przygotuj komorę wilgotnościową w idealnie płaskim plastikowym pudełku. Przykryj spód pudełka papierem whatman zwilżonym wodą milliQ, przykryj papier parafilmem, pozostawiając rogi odkryte; Umieść szkiełka w plastikowym pudełku i szczelnie zamknij pudełko.
   6. Inkubować szkiełka w żądanej temperaturze hybrydyzacji, zwykle 50 - 55 °C, przez 16-20 godzin.
   7. Do użycia następnego ranka przygotuj 1 litr 0,2x SSC i przechowuj w temperaturze 55°C. Ponadto należy przygotować 1 litr buforu NTE (0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH7,5, 1 mM EDTA pH8,0) i przechowywać w temperaturze 37°C.
3. Leczenie po hybrydyzacji
   1. Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe, aby nie uszkodzić sekcji. Umieść preparaty w stojaku i umyj je dwukrotnie w 0,2x SSC w temperaturze 55°C przez godzinę.
      Uwaga: Szkiełka nakrywkowe często łatwo odpadają, gdy są umieszczone pionowo. Jeśli szkiełko nakrywkowe pozostaje założone, zanurz szkiełko w ciepłym 0,2x SSC na 1 lub 2 minuty, aby zmyć szkiełko nakrywkowe. Unikaj ciągnięcia szkiełka nakrywkowego szkiełka, ponieważ może to spowodować uszkodzenie sekcji.
   2. W międzyczasie należy przygotować 500 ml buforu płuczącego (1% BSA, 0,3% trytonu w buforze TBS) i 100 ml roztworu blokującego (0,5% odczynnika blokującego w buforze TBS). Wymieszaj proszek blokujący z TBS, który powoli podgrzewa się do 70°C i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej po rozpuszczeniu.
      Uwaga: Wymagane objętości bufora myjącego i roztworu blokującego będą się różnić w zależności od rozmiaru płaskiego plastikowego pudełka użytego w krokach 4.3.8 -11. Całkowite rozpuszczenie Tritona zajmie trochę czasu, więc wcześniej przygotuj wystarczającą ilość roztworu.
   3. Równowaga slajdów w 1x NTE przez 2 minuty.
   4. Przejdź do obróbki RNAzą A, przenosząc szkiełka do 1x bufora NTE, do którego dodaje się 20 μg/ml RNAzy A tuż przed użyciem, inkubować w temperaturze 37°C przez 30 min.
      Uwaga: RNAza A rozszczepia wolne jednoniciowe RNA, a także w niedopasowaniach w dupleksach RNA. Ten krok pomaga zmniejszyć poziom niespecyficznego wiązania sondy, ponieważ rozszczepione fragmenty sondy są zmywane w ostatnim 0,2-krotnym płukaniu SSC (patrz 4.3.6).
   5. Opłucz szkiełka dwukrotnie w 1x NTE przez 2 minuty każde.
   6. Myć szkiełka w świeżym 0,2x SSC w temperaturze 55°C przez godzinę.
   7. Równowaga szkiełek w 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Przenieś szkiełka ze stojaka na spód płaskiego plastikowego pudełka i przykryj je minimalną objętością roztworu blokującego. Zablokuj zjeżdżalnie na 45 minut na wolno trzęsącej się platformie.
   9. Przenieś szkiełka do drugiego czystego płaskiego plastikowego pudełka i myj je przez 45 minut buforem myjącym na platformie do wytrząsania.
   10. Przejdź do inkubacji przeciwciał. Rozcieńczyć przeciwciało anty-digoksygeniny w buforze do przemywania (1:5 v/v) i albo nałożyć minimalną objętość bezpośrednio na każde szkiełko, albo umieścić szkiełko w płaskim plastikowym pudełku i przykryć je minimalną objętością roztworu przeciwciała. Szkiełka należy inkubować w ciemności przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.
   11. Umyj szkiełka 4 razy po 15 minut za pomocą bufora myjącego na platformie wytrząsającej. Użyj minimalnej objętości bufora do mycia i płaskiego plastikowego pudełka. Wyczyść plastikowe pudełko między każdym z prań.
       Uwaga: Czyszczenie pudełka między praniami zmniejszy ogólne tło na slajdzie. Aby to uprościć, używamy dwóch identycznych płaskich pudełek i po każdym praniu przenosimy szkiełka do czystego pudełka.
   12. Przenieś slajdy do 1x TBS na 2 minuty.
   13. Równowaga szkiełek w buforze TN dwa razy przez 2 minuty każda.
   14. Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór barwiący, dodając 20 μl NBT/BCIP na 1 ml buforu TN. Wlej roztwór barwiący do małego plastikowego naczynia do ważenia. Ułóż dwie prowadnice razem z sekcjami skierowanymi do siebie. Zanurz jeden długi bok kanapki w roztworze, pozwalając, aby działanie kapilarne podciągnęło roztwór. Opróżnij szkiełka za pomocą płynu Kimwipe i ponownie napełnij szkiełka roztworem przeciwciał. Może być konieczne stukanie w szkiełka podczas napływu roztworu, aby uniknąć pęcherzyków. Umieść szkiełka w plastikowym pudełku i przechowuj w temperaturze pokojowej w ciemności.
   15. Dzień 10 do dnia 15: Odświeżać roztwór barwiący dwa razy dziennie przez 1-5 dni, spłukując szkiełka w buforze TN i przygotowując nowe kanapki zawierające świeży roztwór barwiący.
       Uwaga: Wymiana roztworu barwiącego w regularnych odstępach czasu poprawi stosunek sygnału do tła. Rozwój sygnału może być monitorowany pod mikroskopem złożonym lub stereoskopowym. Możliwe jest fotografowanie sekcji, gdy znajdują się one w buforze TN pomiędzy rundami barwienia lub po przeniesieniu do wody tuż przed trwałym montażem.
4. Montażu
   1. Gdy sygnał jest oczywisty, przepłucz szkiełka w milliQ H₂O i szybko je odwodnij za pomocą etanolu z serii:
      
      • 10% etanolu - 10 s
      • 30% etanolu - 10 s
      • 50% etanolu - 10 s
      • 70% etanolu - 5 s
      • 80% etanolu - 5 s
      • 95% etanolu - 5 s
      • 100% etanol - 5 s
      • HistoClear - 2 min
      • HistoClear - 2 min
      Uwaga: Upewnij się, że każdy z tych czasów inkubacji jest krótki, ponieważ sygnał jest rozpuszczalny w etanolu.
   2. Zamontuj szkiełka, umieszczając jedną lub dwie krople medium montażowego na bazie toluenu na każdym szkiełku i powoli opuszczając szkiełko nakrywkowe na szkiełko, unikając tworzenia się pęcherzyków. Pozwól, aby podłoże montażowe stwardniało przez noc przed analizą wyniku pod mikroskopem złożonym. Po zamontowaniu szkiełka mogą być przechowywane przez lata w temperaturze pokojowej.

5. Reprezentatywne wyniki:

Po 1-5 dniach, czerwono-fioletowy sygnał rozwinie się w tych komórkach, w których sonda zhybrydyzowała się z komplementarnymi transkryptami (Rysunek 1). Sygnał barwny zapewnia zatem bezpośrednią wizualizację w rozdzielczości komórkowej wzorca ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Może również wystąpić słabsze zabarwienie tła, wynikające z niespecyficznego wiązania sondy lub barwienia tkanek roślinnych (ryc. 3). Taki sygnał tła może być stosunkowo bardziej wyraźny w małych, mniej zdeterminowanych komórkach tkanki, ale barwienie tła byłoby również obserwowane w sekcjach zhybrydyzowanych z sondami kontroli negatywnej i pozytywnej i nie byłoby odtwarzalne między eksperymentami.

Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą różnych sond na tkankach rzodkiewnika i kukurydzy. Hybrydyzacja in situ tkanek Arabidopsis (A-D) i kukurydzy (E-H) z odrębnymi sondami specyficznymi dla genu, ilustrującymi rodzaj wyników, których można się spodziewać po pomyślnym zakończeniu nakreślonego protokołu. (A) Lokalizacja SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) w wierzchołku pędu wegetatywnego Arabidopsis; Zwróć uwagę na obecność fioletowo-niebieskiego sygnału w nieokreślonych komórkach merystemu i brak sygnału w otaczających liściach. (B-D) Sekcje zarodków Arabidopsis w stadium torpedowym wykazują ekspresję CLAVATA3 (B) w kilku embrionalnych komórkach macierzystych, ekspresję AtML1 (C) w warstwie naskórka i brak sygnału w odcinkach badanych losowym RNA kontroli ujemnej (D). (E) lokalizacja węzła homologicznego STM1 w rozwijającym się zarodku kukurydzy; Zwróć uwagę na silny sygnał szczególnie w merystemie embrionalnym i korzeniu. (F-H) Przekroje podłużne przez wierzchołek pędu wegetatywnego kukurydzy wykazujące wyraźne wzorce hybrydyzacji in situ dla arf3a (F) i ocl4 (G) oraz brak sygnału hybrydyzacji dla sondy kontroli ujemnej (H). arf3a ulega ekspresji na powierzchni liścia osiowego/dolnego, podczas gdy homolog AtML1 ocl4 ulega ekspresji specyficznie w naskórku.

Następujące fragmenty genów zostały użyte jako sonda: STM: region cDNA obejmujący aminokwasy 81 - 382, który obejmuje konserwatywną homeodomenę; CLV3: cDNA o pełnej długości; AtML1: trzeci ekson; KN1: cała otwarta ramka do czytania; arf3a: nukleotydy 9 - 225 klonu cDNA HM004539; ocl4: 3' 1,7 kb cDNA o pełnej długości, który zawiera kilka konserwatywnych domen białkowych.

Rysunek 2. Sprawdzanie punktów podczas wykonywania sond transkrypcyjnych in vitro. (A) Sondy do hybrydyzacji in situ są sprawdzane na standardowym żelu agarozowym po transkrypcji in vitro (a), po traktowaniu DNazą, a następnie oczyszczeniu reakcji transkrypcji in vitro (b), po hydrolizie węglanów –jeśli jest to wymagane- (c) i gdy są gotowe do użycia (d). W przypadku sond o długości powyżej 250 pz, takich jak sonda 1, hydroliza węglanowa da szereg mniejszych fragmentów sondy (nawias). (B) Kwantyfikacja kolorymetryczna sond za pomocą analizy punktowej. Rozcieńczenia w zakresie od ^10-1 do ^10-5 sondy kontrolnej 100 ng/μl (1) i trzech nowo znakowanych sond DIG (2-4) są wykrywane na membranie transferowej, inkubowane z przeciwciałem anty-DIG i oznaczane przy użyciu testu kolorymetrycznego opisanego w sekcji 2.3 protokołu. Analiza sugeruje następujące szacunkowe stężenia: sonda 2, ̃100 ng/μl; sonda 3, ̃10 ng/μl sonda 4, ̃1 ng/μl. Jest mało prawdopodobne, aby sonda 4 dostarczyła dobry sygnał hybrydyzacji in situ.

Rysunek 3. Porównanie sondy niespecyficznej z dobrze działającą sondą. Przekroje podłużne przez wierzchołek pędu wegetatywnego kukurydzy wykazujące niespecyficzny sygnał tła (A) i specyficzny sygnał hybrydyzacji in situ dla sondy OCL5 w zewnętrznej warstwie komórkowej (B).

Rysunek 4. Diagram przedstawiający oś czasu kroków w protokole hybrydyzacji in situ. Etapy osadzania tkanek są oznaczone kolorem zielonym, etapy przygotowania sondy są oznaczone kolorem pomarańczowym, a etapy hybrydyzacji in situ są oznaczone kolorem niebieskim. Ta oś czasu zakłada, że matryca DNA do transkrypcji sondy in vitro jest dostępna. Bloki tkankowe z wbudowanymi parafinami i sondy z oznaczeniem DIG mogą być przygotowane wcześniej i przechowywane w temperaturze odpowiednio 4°C i -80°C do czasu użycia. Protokół hybrydyzacji in situ można następnie ukończyć w ciągu zaledwie czterech dni.

Discussion

Opisana tutaj metoda hybrydyzacji in situ pozwala na bezpośrednią wizualizację czasoprzestrzennego wzorca ekspresji dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania z dużą rozdzielczością komórkową, wysoką czułością i swoistością. Protokół nie pozwala na ilościowe porównanie poziomów ekspresji między genami. Jednak wysoka czułość i rozdzielczość metody może ujawnić gradienty ekspresji genów w tkance^{8, 18}, co nie jest możliwe w przypadku większości innych metod analizy ekspresji genów.

Protokół zawiera wiele kroków, które mogą sprawić, że rozwiązywanie problemów będzie problematyczne. Najbardziej krytycznymi etapami protokołu są utrwalenie tkanki oraz wybór i oznakowanie sondy. Słabo zinfiltrowane tkanki i sondy o niskiej inkorporacji DIG będą dawać bardzo słabe sygnały, które mogą być trudne do wykrycia powyżej tła. Dla każdego nowego genu będącego przedmiotem zainteresowania zaleca się wypróbowanie kilku odrębnych sond pochodzących z różnych regionów transkryptu. Czasami może być konieczne połączenie dwóch lub trzech sond ukierunkowanych na różne mniejsze regiony genu w celu uzyskania silnego i specyficznego sygnału hybrydyzacji. Ponadto warunki hybrydyzacji, takie jak temperatura i skład bufora hybrydyzacyjnego, mogą być zoptymalizowane dla każdego genu lub tkanki w celu obniżenia lub zwiększenia rygorystyczności hybrydyzacji. Również etap leczenia proteazą jest zmienny i może być zmieniony w celu dostosowania protokołu do różnych gatunków roślin lub do wykrywania transkryptów o bardzo niskiej liczebności. Włączenie zarówno sond kontroli pozytywnej, jak i ujemnej będzie pomocne w identyfikacji problematycznych punktów protokołu.

Procedura jest zoptymalizowana pod kątem skrawków tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ale z niewielkimi modyfikacjami może być również stosowana do hybrydyzacji in situ w całości. Chociaż jest szeroko stosowana w badaniach na zwierzętach¹⁹, cała hybrydyzacja in situ będzie ograniczona do tkanek roślinnych, które mogą być łatwo infiltrowane, takich jak zarodki, korzenie lub młode tkanki merystematyczne^20,21. Protokół można również łatwo zmodyfikować, aby jednocześnie wykrywać dwa odrębne mRNA lub lokalizować transkrypty obok białek^15,22,23. Wreszcie, możliwe jest rozszerzenie zastosowania tej metody na wizualizację wzorców ekspresji małych RNA u roślin. Wzorce ekspresji miRNA zostały określone przy użyciu tego protokołu zarówno u kukurydzy, jak i Arabidopsis^8,14. Niedawno sondy transkrybowane in vitro zostały zastąpione dostępnymi na rynku sondami oligologicznymi z zablokowanymi kwasami nukleinowymi (LNA) znakowanymi DIG, które zwiększają czułość sygnału^{18, 24.}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytoseal 60 4oz	Fisher Scientific	23-244-256	Na bazie toluenu 8310-4
Histoclear	Fisher Scientific	50-899-90147
Ścieżka tkankowa Paraplast Plus	Fisher Scientific	23-021-400
Membrana nylonowa N+ Hybond-N+	GE Healthcare	RPN203B
RNaza OUT; 40 U/μ L	Invitrogen	10777019
RQ1 DNaza wolna od RNaz; 1 U/μ l	Promega Corp.	M6101
RNA z oznaczeniem DIG	Grupa Roche	11585746910
Mieszanka znakowania DIG RNA	Grupa Roche 11277073910
Polimeraza RNA SP6 1,000 U	Grupa Roche	10810274001
Polimeraza RNA T3 1,000 U	Grupa Roche	11031163001
Polimeraza RNA T7 1,000 U	Grupa Roche 10881767001
RNaza-A	Grupa Roche	109142	rozpuszcza się w glicerolu 50% Tris 100mM pH8.0
Odczynnik blokujący	Grupa	Roche 1 096 176	Podgrzej do 70° C w buforze TBS
Anti-Digoxygenin-AP, fragmenty Fab od owiec 150 U	Grupa Roche	1 093 274
Roztwór podstawowy NBT/BCIP	Grupa Roche 1	681 451
mini Kolumny RNA Quick Spin	Grupa Roche 11814427001
tRNA z E. coli	Grupa Roche	109541
Triton® X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Dejonizowany formamid	Sigma-Aldrich	F9037
Proteaza z Streptomyces griseus Typ XIV	Sigma-Aldrich	P5147	Rozcieńczyć w wodzie miliQ i wstępnie strawić 4 godziny w temperaturze 37° C
Trietanoloamina	Sigma-Aldrich	90279	Rozcieńczyć w wodzie, doprowadzić do pH 8,0 za pomocą HCl
Bezwodnik octowy	Sigma-Aldrich	A6404
Sól sodowa siarczanu dekstranu z Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D8906-5G	Siarczan dekstranu należy podgrzać do 80° C, aby się rozpuścić.
Denhardt' s Roztwór 50x Koncentrat	Sigma-Aldrich	D2532
Albumina z surowicy bydlęcej - ≥ 98%	Sigma-Aldrich	A7906
Sól disodowa eozyny Y	Sigma-Aldrich	E4382	Rozpuścić w 96-100% etanolu do nasycenia
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Etanol absolutny 200 proof
Fenol / chloroform
Formy bazowe	Mikroskopia elektronowa Nauki	62352-15
Pierścienie do zatapiania	Fisher Scientific	22-038-197
Jednorazowe fiolki scyntylacyjne 20 ml, z nakrętkami	VWR international	66020-326
Szkiełka z sondą na plusie	Fisher Scientific	22-230-900
Okulary z mikro nakrywką 24x50 mm	VWR international	48404-452
Papier Whatman 3mm	VWR międzynarodowa	89022-360
Trzy szklane naczynia i jeden stojak na prowadnice ze stali nierdzewnej	Mikroskopia elektronowa Nauki	71420-25	Do leczenia histoclear niezbędne są dwie szklane wypukłości, a ostatnia służy do obróbki bezwodnikiem octowym
18 czystych plastikowych pojemników	Electron Microscopy Sciences	71402
2 lub 3 duże płaskie plastikowe pudełka z zamykanymi pokrywkami			wymagane do etapów hybrydyzacji i przeciwciał
Drobne pędzle	Pomoc w przekazywaniu wstążek woskowych
	Fisher Scientific
			C oraz 85° C
Inkubator w wieku 58-60° C	Fisher Scientific		Do schodów ze stopionymi piekarnikami Paraplast
lub łaźniami wodnymi dla 55° C oraz 37° C	Fisher Scientific		Potrzeba dwóch ze względu na szybką zmianę temperatur
Wirówka (4° C - 20° C)
Wyciąg